规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法及其应用

文献发布时间：2023-06-19 13:48:08

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，还涉及鱼类性别控制育种技术领域，尤其涉及一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法及其应用。

背景技术

水产业的发展已经成为世界不可或缺的一部分，我国淡水鱼产量与日俱增。水产鱼类中广泛存在个体大小和外部形态、颜色特征的两性差异，称为鱼类的两性异形或者性别二态性。许多鱼类在个体大小等重要生产性状上表现出显著的两性异形，如黄河鲤雌性生长显著快于雄性，而这种生产性状的经济价值与性别密切相关。因此，开发鱼类的单性育种技术在鱼类养殖产业上具有重要意义。

在XX/XY性别决定且两性异形的水产养殖鱼类中，单一性别的群体的获得可以大大提高养殖产量，例如全雌鲤、全雌鳜等。在制作全雌鲤、全雌鳜的传统的方法中，往往需要使用激素(例如甲基睾丸酮)进行处理，从而诱使XX性别遗传型雌鱼逆转为生理雄鱼(伪雄鱼)。例如：申请号为 CN201911147886.1的发明专利公开了一种全雌黄姑鱼的规模化培育方法。该方法如下：(1)黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导；(2)伪雄鱼的诱导和鉴定； (3)伪雄鱼与正常雌鱼交配规模化生产全雌鱼。该方法基于黄姑鱼雌核发育技术的基础上，采用芳香化酶抑制剂来曲唑诱导伪雄鱼的产生，再利用伪雄鱼和正常雌鱼交配获得全雌黄姑鱼鱼苗。但上述方法中，激素关联物的使用往往会造成水体污染、鱼体的残留、药物诱导的亲鱼性别发育不稳定、且受限于规模化应用等，因此，很难在扩繁的生产实践中得到推广，这给单性育种带来了阻碍。

有鉴于此，有必要研发针对XX/XY性别决定的水产养殖鱼类研发可以大规模高比例获得伪雄鱼的方法，这对水产鱼类的性别控制育种和单性群体的养殖有着重要的价值和生产意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法及其应用。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，采用基因编辑技术敲除鱼类的性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因，用以阻断鱼类的性类固醇激素合成通路，并筛选获得有效突变的杂合子雌鱼和XX性别遗传型的伪雄鱼，再将所述伪雄鱼与所述杂合子雌鱼进行杂交，由此得到高伪雄群体，规模化扩大伪雄鱼亲本种群的数量。

作为本发明的进一步改进，所述性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因包括但不限于为cyp17a1、cyp19a1、hsd17b等关键催化酶编码基因中的一种。

作为本发明的进一步改进，所述方法包括如下步骤：

S1，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，获得F0代；

S2，将F0代雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，获得有效突变的F1代cyp17a1 杂合子鱼，其基因型为cyp17a1+/-；

S3，将所述F1代cyp17a1杂合子鱼进行自交，获得F2代；

S4，在所述F2代中，筛选获得无雄性标记的、XX性别遗传型的的cyp17a1 纯合子鱼，其表现为生理雄性，记为伪雄鱼，基因型为cyp17a1-/-XX；

S5，将基因型为cyp17a1+/-XX的杂合子雌鱼和基因型为cyp17a1-/-XX的所述伪雄鱼进行杂交；

S6，经过人工催产和授精后获得F3代高伪雄群体，其中F3代雄鱼全部是基因型为cyp17a1-/-XX的伪雄鱼，由此规模化获得伪雄鱼亲本种群。

作为本发明的进一步改进，在步骤S6中，所述F3代雄鱼占F3代群体总数的50％，所述F3代雄鱼的筛选方法为：在F3代群体中通过腹部挤压出白色精液的个体，即可判断为F3代雄鱼。

作为本发明的进一步改进，所述基因编辑技术为采用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的cyp17a1基因，实现鱼类cyp17a1基因的编辑。

作为本发明的进一步改进，在步骤S1中，所述利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因获得F0代的具体过程为：

P1，基于CRISPR/Cas9系统，设计鱼类cyp17a1基因编辑靶位点；

P2，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物，并合成含有所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点的扩增片段的RNA，记为gRNA；

P3，按预定比例配制gRNA、Cas9 mRNA的注射混合物，得到cyp17a1基因编辑的注射混合物，并将所述cyp17a1基因编辑的注射混合物进行鱼类受精卵的显微注射(此步骤操作也可能由于靶向编辑效率的提升，而直接获得S3所述的cyp17a1纯合子鱼，而省略S2和S3所述的获得cyp17a1+/-杂合子并自交的步骤)；

P4，将注射后的鱼类受精卵养至性成熟，得到F0代。

作为本发明的进一步改进，所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点位于cyp17a1 基因1号外显子上，分为第一靶位点和第二靶位点，前述两者的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的进一步改进，在步骤S2中，获得有效突变的F1代cyp17a1 杂合子鱼的过程为：对F1代鱼类个体进行目的检测片段扩增和测序，检测F1 代突变情况，筛选出有效突变的F1代；针对F1代鱼类个体进行目的检测片段扩增和测序工艺所设计的检测引物中，正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

作为本发明的进一步改进，在步骤P2中，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物中，第一靶位点的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，第二靶位点的正向引物的序列如SEQ ID NO.6所示，第一靶位点和第二靶位点的通用反向引物的序列如SEQ IDNO.7所示。

作为本发明的进一步改进，在步骤S4中，所述伪雄鱼为具有正常精巢结构和精子发生的雄鱼，但无雄性的第二性征(鳃盖的珠星和胸鳍的生殖结节)；所述伪雄鱼的筛选过程为：通过性别标记的方式筛选出XX性别遗传型的 cyp17a1纯合子鱼。

作为本发明的进一步改进，所述鱼类为水产养殖经济鱼类。

作为本发明的进一步改进，所述鱼类为雄性异配遗传决定型(即，XX/XY 性别遗传决定型)的水产养殖经济鱼类。

作为本发明的进一步改进，所述鱼类为鲤科鱼类。

为实现上述发明目的，本发明还提供了上述规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法的应用。所述规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法在水产养殖经济鱼类性别决定育种以及伪雄鱼亲本种群大规模培育领域中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明提供的规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，通过利用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的cyp17a1基因(重要的性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因)，阻断鱼类的性类固醇激素合成通路，从而实现其性别决定育种，Cyp17a1是性类固醇激素合成过程中非常重要的催化酶，催化了孕激素转化为雄激素和雌激素的过程。通过对cyp17a1进行基因编辑，可显著降低雌激素和雄激素的水平；雌激素水平降低，从而阻止其向雌性发育，而雄激素水平仅与雄性的第二性征和生殖行为相关，因此，精巢的发育和精子发生并不会受到影响。通过上述原理，无论其性别遗传型为XX 还是XY，cyp17a1纯合子均可发育为具有正常精巢结构和精子发生的雄鱼，但无雄性的第二性征。首先，获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼，并进行自交，通过性别标记筛选出XX性别遗传型的cyp17a1纯合子(cyp17a1-/-XX) 的伪雄鱼，并将其与杂合子雌鱼(cyp17a1+/-XX)进行杂交，可获得数量占比高达50％的伪雄鱼群体(cyp17a1-/-XX)，从而达到大规模扩大伪雄鱼亲本种群数量的效果。该育种方法有效实现了伪雄鱼种群数量扩繁和简易筛选，提升了生产效率，为后续获得全雌鱼提供更多后备亲本。

2、本发明提供的规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法具有很强的应用性，在水产养殖经济鱼类中有广泛的适应性和扩展性，大大扩展了本发明提供的方法在水产养殖经济鱼类性别决定育种领域以及伪雄鱼亲本种群大规模培育领域中的应用范围。

3、本发明提供的规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，有助于快速准确获得生产实践用的伪雄鱼，为开展水产养殖鱼类单性育种工作以及生殖发育与性别分化遗传学研究建立基础，有效克服了雌核发育结合药物处理带来的造成水体污染、鱼体的残留、药物诱导的亲鱼性别发育不稳定、且受限于规模化应用等技术缺陷；同时，对杂合子自交获取伪雄鱼的方法所存在的伪雄鱼比例低、鉴定过程繁琐等技术难点进行了优化。

附图说明

图1为本发明提供的规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法的流程示意图。

图2为本发明提供的cyp17a1基因1号外显子中两个靶位点的示意图(黄色标注序列为靶位点，红色ATG字符为起始密码子)。

图3为本发明提供的cyp17a1基因两个靶位点的gRNA合成后的琼脂糖凝胶电泳图(第一个泳道为DNA Marker，第2和3个泳道为合成的gRNA)。

图4为本发明提供的cyp17a1 F1代个体测序峰图(上图cyp17a1+/+为对照组个体测序峰图，下图cyp17a1+/-为cyp17a1 F1代突变个体测序峰图)。

图5为本发明提供的cyp17a1 F2代个体测序比对图(cyp17a1+/+为对照组个体检测结果，cyp17a1-/-为cyp17a1 F2代突变个体检测结果；红色方框为两个靶位点)。

图6为本发明提供的8月龄cyp17a1杂合子(cyp17a1+/-XX)和伪雄鱼 (cyp17a1-/-XX)的解剖图与性腺切片图(图6中A为cyp17a1杂合子雌鱼的解剖图，图6中a为cyp17a1杂合子雌鱼的性腺切片图，图6中B为伪雄鱼的解剖图，图6中b为伪雄鱼的性腺切片图)。

图7为本发明提供的cyp17a1杂合子(cyp17a1+/-XX)和伪雄鱼(cyp17a1-/-XX)杂交遗传示意图(含实际比例)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。

另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

请参阅图1所示，本发明提供了一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，包括如下步骤：

S1，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，获得F0代；

S2，将F0代雄鱼与野生型雌鱼进行杂交，获得有效突变的F1代cyp17a1 杂合子鱼，其基因型为cyp17a1+/-；

S3，将所述F1代cyp17a1杂合子鱼进行自交，获得F2代；

S4，在所述F2代中，筛选获得XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼，其表现为生理雄性，记为伪雄鱼，基因型为cyp17a1-/-XX；

S5，将基因型为cyp17a1+/-XX的杂合子雌鱼和基因型为cyp17a1-/-XX的所述伪雄鱼进行杂交；

S6，经过人工催产和授精后获得F3代高伪雄群体中，雄鱼全部是基因型为cyp17a1-/-XX的伪雄鱼，由此规模化获得伪雄鱼亲本种群。

优选的，在步骤S6中，所述F3代雄鱼占F3代鱼群总数的50％，所述F3 代雄鱼的筛选方法为：在F3代鱼群中通过腹部挤压出白色精液的个体，即可判断为F3代雄鱼。

优选的，所述基因编辑技术为采用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的 cyp17a1基因，实现鱼类cyp17a1基因的编辑。

优选的，在步骤S1中，所述利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因获得F0代的具体过程为：

P1，基于CRISPR/Cas9系统，设计鱼类cyp17a1基因编辑靶位点；

P2，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物，并合成含有所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点的扩增片段的RNA，记为gRNA；

P3，按预定比例配制gRNA、Cas9 mRNA的注射混合物，得到cyp17a1基因编辑的注射混合物，并将所述cyp17a1基因编辑的注射混合物进行鱼类受精卵的显微注射。

P4，将注射后的鱼类受精卵养至性成熟，得到F0代。

优选的，所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点位于cyp17a1基因1号外显子上，分为第一靶位点和第二靶位点，前述两者的基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选的，在步骤S2中，获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼的过程为：对F1代鱼类个体进行目的检测片段扩增和测序，检测F1代突变情况，筛选出有效突变的F1代；针对F1代鱼类个体进行目的检测片段扩增和测序工艺所设计的检测引物中，正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，在步骤P2中，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物中，第一靶位点的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，第二靶位点的正向引物的序列如SEQID NO.6所示，第一靶位点和第二靶位点的通用反向引物的序列如SEQ ID NO.7所示。

优选的，在步骤S4中，所述伪雄鱼为具有正常精巢结构和精子发生的雄鱼，但无雄性的第二性征；所述伪雄鱼的筛选过程为：通过性别标记的方式筛选出 XX性别遗传型的cyp17a1纯合子鱼。

优选的，所述鱼类为水产养殖经济鱼类。

优选的，所述鱼类为雄性异配遗传决定型(XX/XY性别遗传决定型)的水产养殖经济鱼类。

优选的，所述鱼类为鲤科鱼类。

实施例1

本发明实施例1提供了一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法，包括如下步骤：

S1，获得cyp17a1基因编辑的注射混合物，并注射至所述鱼类的胚胎中，利用基因编辑技术敲除鱼类中的cyp17a1基因，得到获得F0代；

S11，通过应用http://zifit.partners.org/ZiFiT/Disclaimer.aspx在线工具寻找 cyp17a1基因编辑靶位点，基因靶位点位于cyp17a1基因1号外显子上，分为第一靶位点和第二靶位点，前述两者的序列分别为TGGCTTTTCTGTTCATGCC和 CCAAGCCTCCCATCACTCCC(如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和图2中标注的序列所示)；

S12，根据所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点设计相应的引物(如表1所示，第一靶位点的正向引物的序列如SEQ ID NO.5所示，第二靶位点的正向引物的序列如SEQ ID NO.6所示，第一靶位点和第二靶位点的通用反向引物的序列如 SEQ ID NO.7所示)。利用该引物以pUC19-gRNA-scaffold质粒为模板，合成含有所述鱼类cyp17a1基因编辑靶位点的扩增片段，合成RNA，记为gRNA1和 gRNA2；具体为：利用Thermo公司的TranscriptAid T7HighYield Transcription Kit 合成包含上述2个cyp17a1靶位点的gRNA，分别记为gRNA1和gRNA2，合成后跑琼脂糖凝胶进行检测(如图3所示)，测浓度后，稀释为500ng/μL，置于 -80℃备用；

表1为合成cyp17a1的靶位点gRNA1和gRNA2的引物

S13，Cas9 mRNA转录自pXT7-Cas9载体，具体为：利用Invitrogen公司的 mMESSAGEmMACHINE mRNA转录合成试剂盒合成Cas9加帽mRNA。测浓度后，稀释为500ng/μL，置于-80℃备用；

S14，配制gRNA和Cas9 mRNA的注射混合物，配制比例如表2所示；

表2为gRNA和Cas9 mRNA的注射混合物

S15，将cyp17a1基因编辑的混合物利用显微注射仪注射进入1-或2-细胞的鲤胚胎中，注射体积为1.0nL；

S16，注射后的鱼卵养至性成熟，得到F0代，通过对cyp17a1基因进行特异性切割，实现cyp17a1的基因编辑，使F0代上的cyp17a1基因由于突变而失活，造成最终功能的缺失。

S2，用注射用复方绒促性素B型将F0代雄鲤鱼与野生型雌鲤鱼催产后人工授精，进行杂交，获得F1代，对F1代基因组进行PCR，检测子代突变情况，引物序列见表3(正向引物的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.4所示)；获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼，其基因型为cyp17a1+/-，测序结果为在第一个靶点开始产生双峰(如图4所示)。

表3为cyp17a1的靶点突变检测引物

S3，将含有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼进行自交，获得F2代。

S4，在所述F2代中，筛选获得杂合子雌鱼(cyp17a1+/-XX)和伪雄鱼 (cyp17a1-/-XX)。

请参阅图6所示，将F2代中的cyp17a1-/-XX个体和cyp17a1+/-XX个体分别进行解剖和性腺切片分析，cyp17a1-/-XX个体可见明显精巢结构和精子发生，发现其已明显发育为雄鱼；而cyp17a1+/-XX个体可见清晰的卵泡结构。

S5，将步骤S4得到的基因型为cyp17a1+/-XX的杂合子雌鱼和基因型为cyp17a1-/-XX的所述伪雄鱼进行人工催产和授精。

S6，将人工催产和授精后获得的F3代群体饲养至8月龄，如如图7所示，F3代雄鱼全部是基因型为cyp17a1-/-XX的伪雄鱼，其理论数量占比为50％，实际统计为48.1％。因此，实现了为生产全雌鱼而大规模提高了伪雄鱼亲本的种群数量。

需要注意的是，本领域的技术人员应当理解，上述步骤S5中的杂合子雌鱼(cyp17a1+/-XX)也可从有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼中获取，在此并不做限定，其均能够和伪雄鱼(cyp17a1-/-XX)进行有效杂交。

对比例1

选择cyp17a1+/-杂合子鲤鱼自交为对照组，进行遗传分离各基因型的个体数量和比例统计。请参阅表4所示，通过2年的实验数据统计，得到F2代样本组1和F2代样本组2，cyp17a1+/-XX的杂合子鲤鱼自交后代中伪雄鱼cyp17a1-/- XX的比例仅仅为14％(表4中斜体加粗数字)。

表4为cyp17a1杂合子自交后代(F2代)中各基因型个体的数量和比例

请参阅图7所示，对实施例1提供的cyp17a1+/-XX的杂合子鲤鱼和基因型为cyp17a1-/-XX伪雄鱼杂交，后代中伪雄鱼cyp17a1-/-XX的比例可以提高到50％左右，而且筛选方便，后代群体中可通过腹部挤压出白色精液的个体即判断为伪雄鱼。较对比例1提供的传统意义上的cyp17a1+/-杂合子自交方法，本发明的育种方法更为便捷和稳定，且可大规模获得伪雄鱼亲本。

需要注意的是，本领域技术人员应当理解，本发明所提供的方法不仅适应于实施例1中的二倍体鲤的育种，还能够适用于其他倍性的XX/XY性别决定的水产养殖经济鱼类的育种。

需要注意的是，本领域技术人员还应当理解，在其他实施方式中，所述性类固醇激素合成通路的催化酶编码基因还可以为cyp19a1、hsd17b等其他关键催化酶编码基因中的一种，通过基因编辑技术对其进行敲除，均能够达到阻断鱼类的性类固醇激素合成通路的功能。

综上所述，本发明提供一种规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法及其应用。该方法通过利用CRISPR/Cas9系统特异性切割鱼类的cyp17a1 基因，获得有效突变的F1代cyp17a1杂合子鱼，并进行自交，通过性别标记筛选出XX性别遗传型的cyp17a1纯合子(cyp17a1-/-XX)的伪雄鱼，或通过提高 CRISPR/Cas9系统的工作效率直接获得通过性别标记筛选出的XX遗传决定型的cyp17a1纯合子(cyp17a1-/-XX)的伪雄鱼，并将其与杂合子雌鱼(cyp17a1+/- XX)进行杂交，可获得数量占比高达50％的伪雄鱼群体(cyp17a1-/-XX)，从而达到大规模扩大伪雄鱼亲本种群数量的效果。且通过与传统方法对比实验显示，本发明提供的伪雄鱼群体比例远高于对照实验组，有效实现了伪雄鱼种群数量扩繁和简易筛选，提升了生产效率，为后续获得全雌鱼提供更多后备亲本。本发明提供的方法具有很强的应用性，在水产养殖经济鱼类中有广泛的适应性和扩展性，大大扩展了本发明提供的方法在水产养殖经济鱼类性别决定育种领域中的应用范围。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQ ID NO.1

TGGCTTTTCTGTTCATGCC

SEQ ID NO.2

CCAAGCCTCCCATCACTCCC

SEQ ID NO.3

CCGATGACACTTAGATAGTTG

SEQ ID NO.4

CATGTTGGCTGCAGTGATACTC

SEQ ID NO.5

TAATACGACTCACTATAGGGCATGAACAGAAAAGCCAGTTTTAGA GCTAGAAATAGC

SEQ ID NO.6

TAATACGACTCACTATAGGGGAGTGATGGGAGGCTTGGGTTTTAG AGCTAGAAATAGC

SEQ ID NO.7

AGCACCGACTCGGTGCCACT。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 规模化获得XX/XY性别决定的伪雄鱼亲本的育种方法及应用

<141> 2021-03-15

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA