一种细胞标准化传代方法及在多能干细胞上的应用

技术领域

本发明是一种细胞标准化传代方法及在多能干细胞上的应用，属于多能干细胞传代技术领域。

背景技术

多能干细胞是一类具有极强自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种APSC多能细胞，多能干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官，在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值，标准化传代培养在该过程中起到重要作用。

标准化传代培养常见的方法有酶消化法、直接吹打法、过筛分割法。其中，酶消化法适用于贴壁细胞，酶消化后以得到单细胞为主，但该方法在规模化制备大量细胞的时候存在耗时耗力等缺点；直接吹打法适用于贴壁不紧密或细胞间连接不紧密的各类细胞，并不适用于贴壁紧密和细胞间连接紧密的多能干细胞；过筛分割法在国际公开第2013/077423号中记载到，已有将平均直径约在200-300μm范围内的均匀尺寸的多能干细胞的细胞块通过筛网并进行分割的传代方法，并且，国际公开第2013/077423号中记载有将筛网的孔径设为50μm左右并将分割后的细胞块的直径设为约80-120μm范围内，申请公布号为CN109153972A的发明多能干细胞的传代方法中公开了将筛网的孔径设为30-80μm左右，并将分割后的细胞块的直径设为19.6-133.1μm的现有技术。由此可见，现有技术中的过筛分割法传代细胞仅将200-300μm的细胞团通过单层的筛网，过筛后得到的细胞团大小差异极大，甚至可产生长条状的细胞块，既难以标准化，又会导致同一批次培养的细胞生长状况不一致，造成后续操作繁琐耗时。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种细胞标准化传代方法及在多能干细胞上的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述第一个目的，提供一种细胞标准化传代方法，本发明通过如下技术方案实现。

一种细胞标准化传代方法，包括如下工序：

S1.培养工序

用液体培养基培养细胞得到平均直径≥200μm的细胞团；

S2.分割工序

将步骤S1培养得到的细胞团以1-20mm/sec的流速通过相对运动的双层筛网进行分割，得到平均直径≤120μm的细胞团。

优选的，所述步骤S2中使用的双层筛网包括上层筛网和下层筛网，上层筛网的圆孔开口尺寸在80-300μm范围内，下层筛网的圆孔开口尺寸在40-160μm范围内。

优选的，所述上层筛网和下层筛网之间发生相对运动，根据运动状态定义为固定层筛网和运动层筛网。

优选的，所述运动层筛网以固定层筛网的中心为轴发生转动，转速为10-50转/sec。

优选的，所述运动层筛网相对固定层筛网发生水平移动。

为了实现上述第二个目的，提供一种细胞标准化传代方法在多能干细胞上的应用，本发明通过如下技术方案实现。

运用上述任一所述的一种细胞标准化传代方法在多能干细胞上的应用，包括如下工序：

S1.培养工序

用液体培养基培养多能干细胞，得到平均直径≥200μm的多能干细胞细胞团；

S2.分割工序

将步骤S1培养得到的细胞团以1-20mm/sec的流速通过相对运动的双层筛网进行分割，得到平均直径≤120μm的细胞团。

本发明的有益效果：

(1)本发明涉及一种用于多能干细胞标准化传代的方法，该方法将培养得到的细胞团以1-20mm/sec的流速通过相对运动的双层筛网进行分割，以实现多能干细胞的标准化传代细胞，标准化细胞培养以及传代流程，同时制备得到大小均一的细胞团，保证同一批次中细胞生长情况一致，节约后续操作的时间成本。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明实施例1-6中所使用的传代分割器的结构示意图。

图中：1壳体，2细胞入口端，3细胞出口端，4固定层筛网，5运动层筛网，6中心轴，7轴承，8第一齿轮，9微型电机，10第二齿轮。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

实施例1

1.hESC细胞单层培养

取100μl的Matrigel(源于EHS小鼠肉瘤的基底膜基质)溶于12mL预冷的DMEM培养基中，预冷温度控制在0-4℃范围内，混匀，以2mL/孔的添加量转移至预冷后的6孔板中，使用前1h置于37℃培养箱中备用。

用细胞消化液将hESC细胞消化为单细胞，离心收集细胞，加入适量含有10μM的Y27632抑制剂(ROCK抑制剂)的mTeSR1完全培养基重悬细胞，以1×10

2.hESC细胞转换为悬浮培养

当单层细胞的汇合度达到80-90％范围内时，弃去培养基，用细胞消化液消化后离心收集细胞，加入适量含有10μM的Y27632抑制剂的mTeSR1完全培养基重悬细胞，以1×10

3.hESC细胞分割

将悬浮培养后的细胞团转移至15mL或50mL的离心管中，以200*g的转速离心5min，弃上清，加入新鲜的含有10μM的Y27632抑制剂的mTeSR1完全培养基重悬细胞，对应使用的离心管，用15mL或50mL的注射器吸取重悬液，通过软管连接到传代分割器的入口端，打开分割器开关使其以一定速度运转，保证运动层筛网的转速为10-50转/sec，并将注射器装填到注射泵中，开启注射泵以挤出含有细胞团的悬浮液，使悬浮液通过运转的传代分割器并对细胞团进行分割，利用注射泵控制悬浮液的流量以改变含有细胞团的悬浮液在双层筛网中的通过速度，确保细胞团以10mm/sec的流速通过相对运动的双层筛网。

具体的，双层筛网包括上层筛网和下层筛网，上层筛网的圆孔开口尺寸为280μm，下层筛网的圆孔开口尺寸为140μm；上层筛网和下层筛网之间发生相对运动，根据运动状态定义为固定层筛网和运动层筛网，本实施例中运动层筛网以固定层筛网的中心为轴发生转动，转速为10转/sec。

4.hESC细胞分割后培养

将通过传代分割器后的含有细胞团的悬浮液以1000个/ml的接种量接种于T25细胞培养瓶或T75细胞培养瓶中，静置于培养箱中在37℃以及5％CO

实施例2-6

如表1所示，实施例2-6在实施例1的基础上改变下述四项变量的数值：(1)悬浮培养的细胞团的当量圆直径尺寸(2)细胞团流经双层筛网的流速(3)上层筛网和下层筛网的圆孔开口尺寸(4)运动层筛网的转速，分割细胞团后继续进行悬浮培养。

表1细胞分割培养变量控制

实施例7

实施例1-6中应用到的传代分割器以及内部的双层筛网如图1所示，传代分割器包括壳体1，分别开设在壳体1上下两端的细胞入口端2和细胞出口端3，固定在壳体1内部的固定层筛网4，以及与固定层筛网4同轴转动连接的运动层筛网5，其中，固定层筛网4的中心轴6与壳体1中心线重合，运动层筛网5通过轴承7套设在中心轴6上，轴承7下端固定有第一齿轮8，壳体1内部靠近运动层筛网5的内壁上固定有微型电机9，微型电机9的输出轴上固定有第二齿轮10，第二齿轮10与第一齿轮8相啮合，传代分割器表面均匀涂覆有防腐涂层，且传代分割器内部各部件表面经过加工打磨，最大限度的减小对细胞团的伤害，进一步的，微型电机9、第二齿轮10、第一齿轮8这三个部件可通过密封结构进行保护，防止接触到含有细胞团的悬浮液。

进行细胞分割时，启动微型电机9，微型电机9带动第二齿轮10转动，第二齿轮10带动与之啮合的第一齿轮8转动，进一步带动运动层筛网5绕中心轴6转动；将含有细胞团的悬浮液送至细胞入口端2，细胞团依次流经固定层筛网4和运动层筛网5，最后从细胞出口端3流出，实现细胞的分割。

实施例8

不同于实施例1，本实施例的运动层筛网相对固定层筛网发生水平移动，水平移动的速度为10-40mm/sec。

对比例1

用含有Matrigel的DMEM培养基扩大培养单层的hESC细胞，在其汇合度为80-90％时，使用T25细胞培养瓶或T75细胞培养瓶进行悬浮培养，当hESC细胞团培养至当量圆直径尺寸接近300μm的球体时，用圆孔开口尺寸为100μm的单层筛网对其进行细胞分割，细胞团以1cm/sec的流速通过单层筛网，分割后的细胞在T25细胞培养瓶或T75细胞培养瓶中再次进行悬浮培养。

对比例2

不同于对比例1，本对比例采用双层筛网对细胞团进行过滤，上层筛网的圆孔开口尺寸为100μm，下层筛网的圆孔开口尺寸为70μm，细胞团以1cm/sec的流速通过双层筛网，分割后的细胞在T25细胞培养瓶或T75细胞培养瓶中再次进行悬浮培养。

为进一步验证产生相对运动的双层筛网对细胞团的分割效果，对实施例1-7以及对比例1、对比例2分割后悬浮培养的细胞团的平均当量圆直径进行测量，同时观察分割后的细胞团形状，并测定悬浮培养5天后的细胞增值率，结果如表2所示。

表2细胞团分割后状态判定

由上述试验可看出，采用本发明的标准化传代方法进行传代的细胞团形状完整，后期细胞增殖率较高。此外：该标准化传代的方法不限于应用于上述实施例中的多能干细胞包括但不限于胚胎干细胞、诱导多能干细胞、成体多能干细胞等，且多能干细胞的来源无特殊限制；扩大培养的培养液除DMEM外还可是营养混合物、BME等，以及还可在上述培养基中添加细胞生长因子、抗生素、维生素、糖源、氨基酸、无机盐、蛋白质、激素或其他成分而得到的培养基。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。