BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器及其制备和应用

技术领域

本发明属于荧光分析检测技术领域，涉及基于荧光共振能量转移的核酸适配体传感器，具体为一种BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器及其制备和应用。

背景技术

双酚A(Bisphenol A)，又称BPA，在工业上双酚A被用来合成聚碳酸酯(PC)和环氧树脂等材料。近年来，它被用于制造塑料(奶)瓶、幼儿用的吸口杯、食品和饮料(奶粉)罐内侧涂层。BPA无处不在，从矿泉水瓶、医疗器械到食品包装的内里，都有它的身影，全世界生产的BPA塑料大约2700万吨。但BPA也能导致内分泌失调，威胁胎儿和儿童的健康。最新研究表明癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与此有关。因此，欧盟认为含双酚A奶瓶会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含化学物质双酚A(BPA)的婴儿奶瓶。对此，关于环境中双酚A的检测是十分重要的。

基于核酸适配体的荧光检测技术是近年来较为新颖的一种检测技术，具有选择性强，易操作，响应速度快等优点。随着人工合成适配体技术越来越成熟，其中核酸适配体被逐渐运用到生物传感器、免疫印迹与生物标志物鉴定，已经成为人们建立生物传感器中不可或缺的一部分。

发明内容

为了能够高灵敏度高选择性的确定食品中或者实际水样中的双酚A的残留量，本发明提出一种BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器及其制备和应用。基于BCNO-CQDs-aptamer和CoOOH NSs之间的荧光共振能量转移，以及适配体选择，极大的提高了对目标检测物的选择性和敏感度。基于本发明的荧光核酸适配体传感器，能够实现对双酚A含量的快速检测，使用方法简单，具有很高的使用价值。

为了实现上述目的，本发明提供了一种BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器，包括作为荧光共振能量转移中的供体的BCNO-CQDs(碳氧氮化硼和碳量子点复合物)荧光复合材料，作为荧光共振能量转移中的受体的CoOOH NSs(羟基氧化钴纳米片)和用于将供体和受体连接的双酚A适配体。

具体的双酚A适配体核苷酸序列为：5'-COOH-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'。

本发明还提供了上述BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：

将一定浓度的双酚A适配体滴入EDC和NHS的混合水溶液中，获得活化的适配体溶液；随后加入BCNO-CQDs溶液，得到BCNO-CQDs-aptamer溶液；最后加入CoOOH NSs，充分搅拌均匀，得到所述基于BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs的高灵敏和选择性荧光传感器。

BCNO-CQDs是通过BCNO QDs、柠檬酸和乙二胺混合后经过水热反应制得。具体的，BCNO-CQDs的制备方法包括：在基于柠檬酸和乙二胺制备CQDs(碳量子点)的过程中加入BCNO QDs(碳氧氮化硼量子点)水热反应得到BCNO-CQDs复合材料。BCNO QDs的荧光强度大约在20000左右，CQDs的荧光强度大约在30000，经过水热复合后荧光强度是CQDs的3倍，而且相比于单纯将BCNO QDs与CQDs混合的方法(BCNO QDs中的N-H键与C QDs中的C＝O键发生酰胺化反应从而减少了与适配体连接的可能性)，可以使得量子点表面有更多的官能团修饰，以便后期适配体的连接，提高检测灵敏度。

更具体的，配置含有4g柠檬酸和1.43mL乙二胺混合10mL水中，用玻璃棒搅拌30min，至澄清透明，加入5mL BCNO QDs,将混合溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中反应5h，160℃，冷却至室温后，冷冻干燥得到固体BCNO-CQDs。

更进一步的，BCNO QDs的制备：将乙二醇和硼酸溶解在水中，获得清晰透明的前体溶液，然后将前体溶液在高压釜中进行水热反应，透析一段时间后，可得到BCNO QDs溶液。

具体的，在100μL乙醇胺和0.309g硼酸溶解在10mL水中，并将混合物在聚四氟乙烯高压釜中200℃下加热12h,然后用透析袋透析所得溶液12h以除去小分子，得到BCNO QDs溶液。

进一步的，CoOOH NSs的制备方法包括将NaOH、NaClO溶液加入CoCl

具体的，在剧烈搅拌下，将1mL,0.8M NaOH和1mL,0.2M NaClO溶液加入2mL,10mMCoCl

本发明还提供了BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器在检测双酚A中的应用，包括如下步骤：

步骤1，配制双酚A溶液，将预设量的双酚A溶液加入到pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，得到一系列不同浓度的双酚A标准溶液，浓度范围为1.0×10

步骤2，将BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器作为荧光测试的液体样本，进行发射光谱的扫描，控制激发波长为325nm，狭缝宽度为5nm，起始扫描波长为335nm，结束扫描波长为630nm，得到一系列浓度-荧光强度对应关系，进而得到双酚A的标准曲线，建立加入双酚A后的荧光强度与双酚A浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

步骤3，样品检测，样品过滤除杂后在调节pH为7.4，按上述步骤进行测试并获得荧光强度，所得荧光强度用步骤2中所得的线性回归方程进行计算，得出样品中双酚A的浓度。

作为优选，步骤2中基于荧光共振能量转移的核酸适配体传感器孵育时间为50min，这样可以保证传感器与检测物更好的结合。

本发明的显著优点是开发了一种检测双酚A的BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器及其制备方法，采用荧光共振能量转移机制对BCNO-CQDs进行“开-关-开”实验，从而达到检测目的，与普通的荧光传感器相比，具有以下两方面的显著优点：

(1)本发明将BCNO-CQDs作为荧光供体，CoOOH NS作为猝灭剂，CoOOH NS的加入使得BCNO-CQDs的荧光强度一定程度上被猝灭；适配体的加入使得该传感器可以特异性检测双酚A且该供体-受体的制备更有利于双酚A检测灵敏度的提高；

(2)荧光共振能量转移系统的引入使得该传感器的灵敏度更高、特异性更强，双酚A的检测限为1.0×10

附图说明

图1是本发明实施例中的BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs荧光传感器的制备以及对双酚A的检测的简要流程图。

图2是不同浓度双酚A的荧光发射光谱图。其中双酚A的浓度按曲线峰值高低从上到下依次为：1.0×10

图3是加入双酚A前后荧光强度的差值和双酚A浓度对数的标准曲线。

图4是干扰性能测试结果。

图5是本发明实施例中BCNO-CQDs与BCNO QDs、CQDs荧光强度测试。

具体实施方式

本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明实施例中基于BCNO-CQDs作为荧光共振能量转移中的供体，CoOOH NSs作为荧光共振能量转移中的受体。供体与受体之间通过适配体连接，从而在溶液中构建一种BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs核酸适配体传感器，用于双酚A的检测，测试结果显示该核酸适配体传感器灵敏度高，检测线低，操作简单。

本发明下面结合实施例作进一步详述：

实施例1：

(1)BCNO-CQDs复合材料的制备：

配置含有4g柠檬酸和1.43mL乙二胺混合10mL水中，用玻璃棒搅拌30min，至澄清透明，加入5mL BCNO QDs,将混合溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中反应5h，160℃，冷却至室温后，冷冻干燥得到固体BCNO-CQDs；

(2)BCNO-CQDs-aptamer混合溶液的制备：

将1.5μM,30μL aptamer加入到170μL 4mg/mL·EDC·2mg/mL·NHS中振荡30min，再加入步骤(1)中的BCNO-CQDs溶液，振荡2h，得到BCNO-CQDs-aptamer混合溶液；

(3)CoOOH NSs的制备:

在剧烈搅拌下，将1mL,0.8M NaOH溶液和1mL,0.2M NaClO溶液加入2mL,10mMCoCl

(4)BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs的高灵敏和选择性荧光传感器的制备：

取步骤(2)中制备的BCNO-CQDs-aptamer；然后，将CoOOH NSs加入到BCNO-CQDs-aptamers溶液中，得到所述基于BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs的高灵敏和选择性荧光传感器。

上述传感器中，适配体核苷酸序列如下所示：(订购于生工生物工程(上海)股份有限公司)

适配体：5'-COOH-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'。

(5)标准曲线的绘制

配置双酚A标准溶液，将预设量的双酚A溶液加入PBS缓冲液(具体的，pH＝7.4的0.1mol/L PBS缓冲溶液)中，得到一系列不同浓度的溶液标准溶液；

将基于BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs的高灵敏和选择性荧光传感器BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs溶液作为荧光测试的液体样本，进行发射光谱的扫描，用于检测双酚A。所述基于BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs的高灵敏和选择性荧光传感器孵育时间为50min。

将该传感器置于一系列双酚A浓度(1.0×10

(6)样品的检测

取一定量过滤除杂后的河水加入到pH为7.4的0.1mol/L PBS的缓冲溶液中，用于荧光光谱检测，按上述步骤(5)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中双酚A浓度，其结果列于表1中。

(7)干扰性能测试：

检测物中双酚A(Bisphenol A)的浓度为1.0x10

对比实施例1

(1)BCNO-CQDs-aptamer混合溶液的制备：

将30μL,1.5μΜaptamer加入到170μL 4mg/mL·EDC·2mg/mL·NHS中振荡30min，再加入步骤(1)中的BCNO-CQDs溶液，振荡2h，得到BCNO-CQDs-aptamer混合溶液；

(2)标准曲线的绘制

以BCNO-CQDs-aptamer混合溶液，作为荧光光谱测试的液体样本，用于一系列不同浓度双酚A标准溶液的检测。检测方法同实施例1。

其结果列于表1中。

对比实施例2：

(1)CoOOH NSs溶液的制备

将比色皿依次用无水乙醇和去离子水洗净，自然晾干待用。用微量进样器移去1mL,1.5mg/mL CoOOH NSs水溶液(CoOOH NSs水溶液的制备方法如实施例1)添加到洁净的比色皿中，得到CoOOH NSs液体样本。

(2)标准曲线的绘制

以CoOOH NSs水溶液，作为荧光光谱测试的液体样本，用于一系列不同浓度双酚A标准溶液的检测。检测方法同实施例1。

其结果列于表1中。

表1河水中双酚A的测定结果

备注：a为三次测定的平均值。

如表1所示，样品平行检测3次，相对标准偏差小于5％，加标回收率90％～104％。以上结果表明，不用BCNO-CQDs-aptamer/CoOOH NSs液体样本而单独用BCNO-CQDs-aptamer或是CoOOH NSs液体样本无法检测双酚A，本发明用于检测河水中的双酚A是可行的。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。