一种继代式乳酸菌发酵剂、酸奶及其制备方法

技术领域

本发明涉及奶制品加工技术领域，具体涉及一种继代式乳酸菌发酵剂和利用该乳酸菌发酵剂制备的酸奶及其制备方法。

背景技术

发酵剂是指至少含有一种微生物、菌体浓度高、加入原料中可加速和控制生产发酵食品的微生物制剂。乳酸菌发酵剂被称为发酵乳制品的“心脏”，是生产高质量发酵乳的核心部分。乳酸菌发酵剂，按比例添加入原料后会产生乳酸，快速酸化，同时生成有机酸、芳香类化合物、胞外多糖等代谢产物，这些代谢产物能赋予发酵乳特有的风味、口感，并形成特定组织结构。

随着生活水平的提高，不同消费人群对发酵乳制品的认知与购买水平逐年提高，发酵乳制品的产量以年平均25％增量快速上升。在此背景下，乳制品对优质发酵剂的需求量也在大幅度增加。自1988年丹麦科汉森公司成功研制出直投式乳酸菌发酵剂，到现在的国外巨头，科汉森、丹尼斯克、帝斯曼等，对我国乳酸菌发酵剂市场占有率达到90％以上。而国内美华，弗蒙特，一然等品牌虽然在崛起，但市场占有率依然不足10％。近些年，乳酸菌发酵剂逐渐渗透到更多的食品领域中，国内的研宄学者也加强了对乳酸菌发酵剂的研究。侯保朝团队、陆嘉诚团队、陈世贤团队、王凡团队、冯丽莉团队从发酵剂益生菌的选择，风味物质与直投式发酵剂对比，发酵状态、时间、发酵特性研究、菌株复配后最佳发酵比例、产品后酸控制、活菌数等方面进行了研究与评价。但与进口发酵剂相比在技术上还是存在很大的差距，而且拥有自主知识产权的商业发酵剂也相对较少。针对国内缺乏优质发酵剂现状，筛选出低成本，菌种活力强，发酵风味优良，后酸化弱的乳酸菌发酵剂尤为重要，并将其研制为具有自主知识产权的益生菌发酵剂，具有重要的经济和社会价值。

现有技术中公开了一种改进的酸奶继代菌株的使用方法，(专利申请号：200710114505.0，公开号：CN 101176484A)，该专利使用两株德氏乳杆菌保加利亚亚种，一株嗜热链球菌，按比例1：0.5-1.5：1-4组合制得生产发酵剂，按接种量3％接入基料发酵，4-8℃保存活菌数第十天能达到10

本发明针对酸乳发酵剂需求，以嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种为研宄对象，建立乳酸菌菌株发酵相关特性数据库，同时开发出具有自主知识产权的酸乳菌发酵剂。根据发酵剂产酸、产香能力、质构特性、发酵过程中活力以及贮藏期间的菌种活力，28℃下后酸等方面进行评价。研发出继代式乳酸菌发酵剂，检测生产发酵剂中双乙酰含量22.8-24.6ug/kg，胞外多糖为226.5-248.3mg/L，活菌数7.3-8.1×10

本发明的目的是提供一种继代式乳酸菌发酵剂、酸奶及其制备方法。

一种继代式乳酸菌发酵剂，由下述菌株接种液组成：嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)LSE-2018DH003-G3、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)LSE-2018DH003-G9、德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)LSR-L-L1、德氏乳杆菌保加利亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)LSR-L-L4；

其中，所述嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3保藏编号为CGMCC NO.21841，所述嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9保藏编号为CGMCC NO.21842，所述德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1保藏编号为CGMCC NO.14750，所述德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4保藏编号为CGMCCNO.14752；

优选地，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3接种液8～15份，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9接种液8～15份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1接种液0.5～1.5份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4接种液0.5～1.5份；

优选地，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3接种液12份，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9接种液12份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1接种液1份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4接种液1份；

本发明还提供一种继代式乳酸菌发酵剂的制备方法，包括步骤：

1)单菌株发酵中间剂制备：菌株培养至4～8代，按体积比2～3％，单菌株接种于蛋白含量3.2～3.4％灭菌后脱脂乳奶瓶中，40～44℃发酵中间剂，球菌终点酸度84～92°T，杆菌终点酸度82～90°T；

2)复配菌株，生产发酵剂制备：将步骤1)中发酵好的中间剂，按照菌株接种量1～3％体积比复配，接种于蛋白含量3.0～3.2％脱脂乳培养基中，40～44℃发酵6～7h，终点酸度88～96度；

本发明还提供利用所述的继代式乳酸菌发酵剂制备的酸奶，由下述重量百分比的原辅料制成：

乳酸菌发酵剂0.6～0.8％、净乳后原料奶蛋白含量2.8～3.0％、0.5～1.5％琼脂、0.5～1.5％淀粉、0.005～0.015％海盐、0.5～1.5％稳定剂、0.5～1.5％白糖；

优选地，乳酸菌发酵剂0.7％、净乳后原料奶蛋白含量2.9％、1％琼脂、1％淀粉、0.01％海盐、1％稳定剂、1％白糖；

本发明还提供所述酸奶的制备方法，包括步骤：

1)酸奶基料制备：将净乳后原料奶蛋白含量2.8～2.9％，加热至60～70℃，添加0.5～1.5份琼脂、0.5～1.5份淀粉、0.01～0.03份海盐、0.5～1.5份稳定剂、0.5～1.5份白糖，再与其余成分混合，检测理化，定容，均质，巴氏杀菌，冷却备用。

2)酸奶制作：生产发酵剂0.6～0.8％接种至步骤1)基料中，40～44℃发酵4～4.5h，终点酸度62～66°T，发酵，破乳，后熟，灌装，微生物检测，后酸跟踪。

本发明使用皇氏来思尔乳业菌种资源库，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3、LSE-2018DH003-G9，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1、LSR-L-L4，四株登记保藏菌株，保藏说明如下：

分类命名：嗜热链球菌；

拉丁名：(Streptococcus thermophilus)；

参椐的生物材料(株)：LSE-2018DH003-G3；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：CGMCC；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2021年3月1日；

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.21841。

分类命名：嗜热链球菌；

拉丁名：(Streptococcus thermophilus)；

参椐的生物材料(株)：LSE-2018DH003-G9；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：CGMCC；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2021年3月1日；

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.21842。

分类命名：德氏乳杆菌保加利亚亚种；

拉丁名：(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)；

参椐的生物材料(株)：LSR-L-L1；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：CGMCC；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2017年9月26日；

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.14750。

分类命名：德氏乳杆菌保加利亚亚种；

拉丁名：(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)；

参椐的生物材料(株)：LSR-L-L4；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：CGMCC；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏日期：2017年09月26日；

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.14752。

与现有技术相比，本发明具有下述有益效果：本发明的4株菌均为登记保藏菌株，拥有优质发酵特性，具体特性如下：

1.可适应产品加工条件，两株球菌产酸快、后酸低、产香、产粘；两株杆菌不产黏，产香好，活菌数高；4株菌株通过继代培养4-8代，性状稳定；通过菌株复配控制球杆比，调节产品细腻度，粘度，后酸，得到具有自主知识产权的继代式乳酸菌发酵剂，球杆复配比LSE-2018DH003-G3+LSE-2018DH003-G9+LSR-L-L1+LSR-L-L4＝1.2％+1.2％+0.1％+0.1％。

2.发酵过程中产酸迅速，继代式乳酸菌发酵剂接种量600-800g/吨，发酵时间4-4.5h，与商业直投发酵剂相比，发酵时间相差甚小。

3.后酸低，活菌数高，制备的酸奶，酸香俱佳，组织细腻，28℃保温样后酸21天10批次样品极限酸度94-102°T，活菌数1.5-8.0×10

4.生产发酵剂双乙酰含量22.8-24.6ug/mL，胞外多糖含量226.5-248.3mg/L，增加产品的酸香及酸奶状态保持，酸奶21天析水率≤0.45％，使产品保持优质口感。

5.中间剂与生产发酵剂，制备工艺简单，安全环保。从2019年至今为公司节约直接经济460多万元。

附图说明

图1为4株菌株生长曲线。

图2为4株菌株产酸曲线。

图3为双乙酰标曲线。

图4为胞外多糖标准曲线。

图5为LSE-2018DH003-G3、LSE-2018DH003-G9、LSR-L-L1、LSR-L-L4共培养生长曲线。

下面结合实施例，进一步阐述本发明，但不限于实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

继代式乳酸菌发酵剂的制备

菌株活化复壮制备中间剂：将来源于皇氏来思尔菌种资源库4株菌，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3保藏编号为CGMCC NO.21841，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9保藏编号为CGMCC NO.21842，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1保藏编号为CGMCC NO.14750、德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4保藏编号为CGMCC NO.14752，球菌使用TJA，杆菌MRS活化；复壮，向培养基中添加适量灭菌牛奶，胡萝卜汁，番茄汁，活菌数要求杆菌≥10

其中脱脂乳培养基：将脱脂粉，溶于50℃双蒸水中，制得中间剂脱脂乳3.5％，生产发酵剂3.1％，水合30min，0.70×10

生理盐水：将8.5g NaCl溶解于1000mL水中，分装试管，每只9mL，1.05×10

MRS液体培养基：将20g葡萄糖、10g酪蛋白胨、10g牛肉浸膏、5g酵母浸粉、5g无水乙酸钠、2g柠檬酸三铵、2g磷酸氢二钾、1mL吐温-80、0.25g硫酸锰和0.58g硫酸镁，加双蒸水溶解并定容至1000mL，其中硫酸镁、硫酸锰精密称取，单独溶解后与其余成分混合，PH值6.2-6.4。MRS固体培养基：MRS液体培养基+1.5％琼脂粉，1.05×10

TJA培养基：将50mL番茄汁、5g酵母浸粉、10g牛肉浸膏、20g乳糖、2g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、1g吐温-80、5g无水乙酸钠，加双蒸水定容至1000mL，调节pH至6.8±0.2。TJA固体培养基：TJA液体培养基+1.5％琼脂粉，1.05×10

复配菌株，生产发酵剂制备：将步骤(1)中发酵好的中间剂，按照菌株接种量2％体积比复配，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3接种液12份，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9接种液12份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1接种液1份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4接种液1份。接种于蛋白含量3.1％灭菌后脱脂乳培养基中，42℃恒温培养箱发酵6.5h，终点酸度90度，检测其微生物，待用。

继代式生产发酵剂4℃冷藏条件下保质期，每日查看其状态，检测活菌数，0.7％接入基料小样发酵，对比发酵状态，保温样后酸，活菌数。8天后发酵时间延长至4.8h，活菌数变化较小，保温样无变化，确定继代式益生菌发酵剂保质期为7天。

本实施例1制备的继代式乳酸菌中间剂：球菌发酵14h，其酸度84-92°T之间，杆菌发酵8h，酸度稳定在82-90°T，活菌数均大于10

实施例2

继代式乳酸菌发酵剂的制备

菌株活化复壮制备中间剂：将来源于皇氏来思尔菌种资源库4株菌，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3保藏编号为CGMCC NO.21841，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9保藏编号为CGMCC NO.21842，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1保藏编号为CGMCC NO.14750、德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4保藏编号为CGMCC NO.14752，球菌使用TJA，杆菌MRS活化；复壮，向培养基中添加适量灭菌牛奶，胡萝卜汁，番茄汁，活菌数要求杆菌≥10

其中脱脂乳培养基：将脱脂粉，溶于45℃双蒸水中，制得中间剂脱脂乳3.5％，生产发酵剂3.0％，水合30min，0.70×10

生理盐水：将8.5g NaCl溶解于1000mL水中，分装试管，每只9mL，1.05×10

MRS液体培养基：将20g葡萄糖、10g酪蛋白胨、10g牛肉浸膏、5g酵母浸粉、5g无水乙酸钠、2g柠檬酸三铵、2g磷酸氢二钾、1mL吐温-80、0.25g硫酸锰和0.58g硫酸镁，加双蒸水溶解并定容至1000mL，其中硫酸镁、硫酸锰精密称取，单独溶解后与其余成分混合，PH值6.2。MRS固体培养基：MRS液体培养基+1.5％琼脂粉，1.05×10

TJA培养基：将50mL番茄汁、5g酵母浸粉、10g牛肉浸膏、20g乳糖、2g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、1g吐温-80、5g无水乙酸钠，加双蒸水定容至1000mL，调节pH至6.8±0.2。TJA固体培养基：TJA液体培养基+1.5％琼脂粉，1.05×10

复配菌株，生产发酵剂制备：将步骤(1)中发酵好的中间剂，按照菌株接种量1％体积比复配，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3接种液8份，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9接种液8份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1接种液0.5份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4接种液0.5份。接种于蛋白含量3.0～3.2％灭菌后脱脂乳培养基中，40℃恒温培养箱发酵6h，终点酸度88度，检测其微生物，待用。

继代式生产发酵剂4℃冷藏条件下保质期，每日查看其状态，检测活菌数，0.6％接入基料小样发酵，对比发酵状态，保温样后酸，活菌数。8天后发酵时间延长至4.8h，活菌数变化较小，保温样无变化，确定继代式益生菌发酵剂保质期为7天。

实施例3

继代式乳酸菌发酵剂的制备

菌株活化复壮制备中间剂：将来源于皇氏来思尔菌种资源库4株菌，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3保藏编号为CGMCC NO.21841，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9保藏编号为CGMCC NO.21842，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1保藏编号为CGMCC NO.14750、德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4保藏编号为CGMCC NO.14752，球菌使用TJA，杆菌MRS活化；复壮，向培养基中添加适量灭菌牛奶，胡萝卜汁，番茄汁，活菌数要求杆菌≥10

其中脱脂乳培养基：将脱脂粉，溶于55℃双蒸水中，制得中间剂脱脂乳3.6％，生产发酵剂3.2％，水合30min，0.70×10

生理盐水：将8.5g NaCl溶解于1000mL水中，分装试管，每只9mL，1.05×10

MRS液体培养基：将20g葡萄糖、10g酪蛋白胨、10g牛肉浸膏、5g酵母浸粉、5g无水乙酸钠、2g柠檬酸三铵、2g磷酸氢二钾、1mL吐温-80、0.25g硫酸锰和0.58g硫酸镁，加双蒸水溶解并定容至1000mL，其中硫酸镁、硫酸锰精密称取，单独溶解后与其余成分混合，PH值6.4。MRS固体培养基：MRS液体培养基+1.5％琼脂粉，1.05×10

TJA培养基：将50mL番茄汁、5g酵母浸粉、10g牛肉浸膏、20g乳糖、2g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、1g吐温-80、5g无水乙酸钠，加双蒸水定容至1000mL，调节pH至6.8±0.2。TJA固体培养基：TJA液体培养基+1.5％琼脂粉，1.05×10

复配菌株，生产发酵剂制备：将步骤(1)中发酵好的中间剂，按照菌株接种量3％体积比复配，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G3接种液15份，嗜热链球菌LSE-2018DH003-G9接种液15份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L1接种液1.5份，德氏乳杆菌保加利亚种LSR-L-L4接种液1.5份。接种于蛋白含量3.0～3.2％灭菌后脱脂乳培养基中，44℃恒温培养箱发酵7h，终点酸度96度，检测其微生物，待用。

继代式生产发酵剂4℃冷藏条件下保质期，每日查看其状态，检测活菌数，0.8％接入基料小样发酵，对比发酵状态，保温样后酸，活菌数。8天后发酵时间延长至4.8h，活菌数变化较小，保温样无变化，确定继代式益生菌发酵剂保质期为7天。

实施例4

继代式乳酸菌发酵剂活菌数、生长曲线、产香与胞外多糖检测

(1)活菌数检测方法使用GB/T14699.1，杆菌培养基为MRS、球菌培养基TJA。

(2)采用芬兰Bioscreen全自动生长曲线分析仪，提前30min开启，预热。蜂窝板紫外杀菌30min，培养基做空白对照组，4株菌株按2％体积比接入液体培养基，震荡均匀后，快速接入蜂窝板200uL，每组设置3个平行样。

(3)将实施例1中的中间剂与生产发酵剂，参照邵亚东.传统发酵乳制品中乳酸菌产双乙酰特性的研究，使用邻苯二胺比色法检测乳制品双乙酰。

(4)将实施例1中的中间剂与生产发酵剂，使用苯酚-硫酸法，检测胞外多糖；

本实施例4中，单菌株4-8代活菌数检测，球菌大于10

继代式乳酸菌发酵剂，生长曲线如图5：延滞期为0-1h，对数期2-10h，第一次稳定期11-26h，二次增殖对数期为27-32h，33-48为稳定期，48h未见衰退期；进行7次稳定性实验，发酵剂发酵时6-7h，酸度在82-90°T，双乙酰含量22.8-24.6ug/mL，胞外多糖含量226.5-248.3mg/L。为后续产品发酵时间、产品细腻度、酸香味的调整提供数据依据。

实施例5

利用继代式乳酸菌发酵剂制备酸奶

酸奶基料制备：将净乳后原料奶蛋白含量2.7％(理化低加入脱脂乳粉增加蛋白含量)，加热至65℃待用，添加1份琼脂(冷溶解后添加)、1份淀粉、0.02份海盐、1份稳定剂、1份白糖(稳定剂与7％白砂糖先干混并溶解于75℃水中)，再与其余成分混合，FT120检测理化，定容，均质，巴氏杀菌，冷却备用。

酸奶制作：生产发酵剂0.7％接种至步骤1)基料中，42℃发酵4.3h，终点酸度64°T，发酵，破乳，后熟，灌装，微生物检测，后酸跟踪。

后酸跟踪：取灌装好产品22瓶，一半放置4℃冷藏，一半放入28℃保温样，进行后酸跟踪、活菌数检测及析水率。

本实施例5中，成品蛋白2.8-2.9％，脂肪3.6-3.8％，接种量0.6-0.8％，发酵时间4-4.5h，发酵酸度64±2°T，冷藏样后酸66-68°T，28℃保温样后酸21天10批次样品极限酸度94-102°T，活菌数1.5-8.0×10

实施例6

利用继代式乳酸菌发酵剂制备酸奶

酸奶基料制备：将净乳后原料奶蛋白含量2.8％(理化低加入脱脂乳粉增加蛋白含量)，加热至60℃待用，添加0.5份琼脂(冷溶解后添加)、0.5份淀粉、0.01份海盐、0.5份稳定剂、0.5份白糖(稳定剂与7％白砂糖先干混并溶解于70℃水中)，再与其余成分混合，FT120检测理化，定容，均质，巴氏杀菌，冷却备用。

酸奶制作：生产发酵剂0.6％接种至步骤1)基料中，40℃发酵4h，终点酸度62°T，发酵，破乳，后熟，灌装，微生物检测，后酸跟踪。

后酸跟踪：取灌装好产品22瓶，一半放置4℃冷藏，一半放入28℃保温样，进行后酸跟踪、活菌数检测及析水率。

实施例7

利用继代式乳酸菌发酵剂制备酸奶

酸奶基料制备：将净乳后原料奶蛋白含量2.9％(理化低加入脱脂乳粉增加蛋白含量)，加热至70℃待用，添加1.5份琼脂(冷溶解后添加)、1.5份淀粉、0.03份海盐、1.5份稳定剂、1.5份白糖(稳定剂与7％白砂糖先干混并溶解于80℃水中)，再与其余成分混合，FT120检测理化，定容，均质，巴氏杀菌，冷却备用。

酸奶制作：生产发酵剂0.8％接种至步骤1)基料中，44℃发酵4.5h，终点酸度66°T，发酵，破乳，后熟，灌装，微生物检测，后酸跟踪。

后酸跟踪：取灌装好产品22瓶，一半放置4℃冷藏，一半放入28℃保温样，进行后酸跟踪、活菌数检测及析水率。

对比例1

继代式乳酸菌发酵剂的制备及在酸奶中的应用

(1)通过实施例1的步骤进行实验，复配4株菌株，菌株比例球杆比10:1、11:1、13:1、14:1、1:1、5:1进行实验与LSE-2018DH003-G3+LSE-2018DH003-G9+LSR-L-L1+LSR-L-L4＝1.2％+1.2％+0.1％+0.1％(12:1)结果对比如下表1：

表1：不同复配比例，发酵时间、酸度、双乙酰、双乙酰检测

如上表所示：球杆比例10-14:1生产发酵剂，发酵时间6.8-6.0h，发酵酸度85-87°T，双乙酰与胞外多糖含量，球杆比12:1时产值最大。球杆比1:1时，发酵时间延长，胞外含量125.8mg/L，双乙酰29.8ug/mL，球杆比5:1时，发酵时间7.5h，胞外含量163.3mg/L，双乙酰28.6ug/mL。通过发酵时间、双乙酰与胞外多糖含量选择LSE-2018DH003-G3+LSE-2018DH003-G9+LSR-L-L1+LSR-L-L4＝1.2％+1.2％+0.1％+0.1％为发酵及比例。

(2)通过实施例5的步骤进行酸奶制作，继代式乳酸菌发酵剂发酵基料，发酵酸度定为64±2°T，对比发酵时间，21天28℃保温样后酸，析水率如下表2。

表2不同比例发酵基料，发酵时间，产品保温样后酸及析水率

如上表2所示：LSE-2018DH003-G3+LSE-2018DH003-G9+LSR-L-L1+LSR-L-L4＝1.2％+1.2％+0.1％+0.1％比例，发酵时间4.2h，21天28℃保温样后酸，极限酸度102°T，21天析水率小于0.45％，继代式乳酸菌发酵剂产酸快，后酸低，保水性能佳。

对比例2

继代式乳酸菌发酵剂与商业直投菌种发酵对比

商业菌种选择：丹尼斯克、科汉森、帝斯曼，类型为搅拌型，接种剂量按说明书接种，基料均为小酸奶基料，与本发明继代式乳酸菌发酵剂发酵基料，对发酵时间、酸度、析水率、后酸进行对比；产品细腻度，粘度，酸味，香味，综合口感进行打分，结果如下表3、4。

表3发酵时间、酸度、析水率、后酸

如上表3所示：4种发酵剂发酵酸奶，发酵时间4.5-5.0h，21天析水率为0.45-0.52％，21保温样后酸均未超过108°T，其中继代式发酵剂发酵时间最短，保温样后酸最低。

表4产品细腻度，粘度，酸味，香味，综合口感

如上表4所示：发酵、破乳、后熟后。将产品进行25人品鉴，4种不同发酵剂产品进行评价，均细腻，光滑，有拉丝，得分均为4.8分；通过粘度测定后继代式发酵剂粘度低于其它3种发酵剂，得分最低为4.6分；通过口感品尝酸、香味，继代式发酵剂继代式酸、香味最好，得分高于其余三种发酵剂产品；通过酸奶状态，粘度，酸香，回味，综合进行打分，25人取平均值，继代式发酵剂得分最高为4.6分。

结果分析

本发明制得的中间发酵剂、生产发酵剂，酸奶，检测其中酸度、活菌数，双乙酰，胞外多糖、酸奶乳清析出率检测方法如下：

酸度滴定方法使用GB5009.239-2016；

所有实施例中活菌数检测方法使用GB/T14699.1，所用培养基为MRS与TJA固体培养基。

双乙酰检测：参照邵亚东的方法。

胞外多糖检测：苯酚-硫酸法

酸奶乳清析出率检测：使用注射器吸取上清液，经过滤后称量，计算乳清析出率。

检测结果如下：

本发明4株菌株选取4-8代进行实验，中间剂发酵时间，酸度、活菌数、双乙酰、胞外多糖检测值如下表5：

表5中间剂发酵时间，酸度、活菌数、双乙酰、胞外多糖检测值

如上表5：单菌株按体积比2％接种，脱脂乳发酵。球菌活菌数能达到10

本发明制备的生产发酵剂，将制作好的中间剂进行复配，制备生产发酵剂，按接种量2％，复配比例LSE-2018DH003-G3+LSE-2018DH003-G9+LSR-L-L1+LSR-L-L4＝1.2％+1.2％+0.1％+0.1％。发酵时间、酸度、活菌数、双乙酰、胞外多糖含量如下表6。

表6发酵剂发酵时间、酸度、活菌数、双乙酰、胞外多糖

如上表6：4株菌株经过中间剂发酵后，按比例复配，通过球杆菌互利共生，生产发酵剂发酵时6-7h，酸度在82-90°T，双乙酰含量22.8-24.6ug/mL，胞外多糖含量226.5-248.3mg/L。

本发明制备的酸奶：将制备的生产发酵剂，按质量比0.6-0.8％接种，发酵小酸奶基料，破乳，后熟。4℃21天的酸度、活菌数，10批次样品28℃保温样后酸、与其中一批次活菌数，21天析水率，如下表3、4、5。

表7 4℃21天的酸度、活菌数

如上表7：产品冷藏条件下酸度变化较小，21天酸度，稳定在66-68°T之间，活菌数4.5-18.0×10

表8 28℃保温样后酸、活菌数

如上表8：21天28℃保温样，酸度变化，10批次样品极限酸度在94-102°T之间，后酸低。21天28℃保温样活菌数为1.5-8.0×10

表9 21天析水率

如上表9：21天样品析水率≤0.45，保水率较好，基本无乳清析出，状态细腻。

综上所述，本发明的4株菌均为登记保藏菌株，拥有优质发酵特性，具体特性如下：

1.可适应产品加工条件，两株球菌产酸快、后酸低、产香、产粘；两株杆菌不产黏，产香好，活菌数高；4株菌株通过继代培养4-8代，性状稳定；通过菌株复配控制球杆比，调节产品细腻度，粘度，后酸，得到具有自主知识产权的继代式乳酸菌发酵剂，球杆复配比LSE-2018DH003-G3+LSE-2018DH003-G9+LSR-L-L1+LSR-L-L4＝1.2％+1.2％+0.1％+0.1％。

2.发酵过程中产酸迅速，继代式乳酸菌发酵剂接种量600-800g/吨，发酵时间4-4.5h，与商业直投发酵剂相比，发酵时间相差甚小。

3.后酸低，活菌数高，制备的酸奶，酸香俱佳，组织细腻，28℃保温样后酸21天10批次样品极限酸度94-102°T，活菌数1.5-8.0×10

4.生产发酵剂双乙酰含量22.8-24.6ug/mL，胞外多糖含量226.5-248.3mg/L，增加产品的酸香及酸奶状态保持，酸奶21天析水率≤0.45％，使产品保持优质口感。

5.制备的酸奶组织细腻、拉丝好，后酸低，活菌数高；最大限度的节约了直投菌种带来的高成本问题，从2019年至今为公司节约460多万元。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。