一种高收率多相复式合成制备PCN的方法

技术领域

本发明涉及农药原料制备技术领域，更具体地，涉及微生物源农药杀菌剂的合成与制备技术领域，为一种高收率多相复式合成制备PCN的方法。

背景技术

申嗪霉素是一种吩嗪类农用广谱杀菌剂，为具有高效、安全、广谱及环境友好等特点的新型微生物源农药，其主要成分是甜瓜根际促生拮抗菌M18产生的次级代谢产物吩嗪-1-羧酸(PCA)，该菌株属于荧光假单胞菌菌株，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.0462，在中国专利CN00119857.2中，发明人许煜泉、冯镇泰描述了生物农药促生拮抗菌M18及其制备方法，该专利被参考并结合于本申请中。促生拮抗菌M18产生的次级代谢产物PA可有效控制稻麦果蔬等作物真菌性、细菌性和线虫引起的多种病害，并且同时具有促进植物生长的作用。作为一种高效、安全、广谱及环境友好的新型微生物源农药，在当前″农药使用量零增长行动″以及农业发展对环境要求越来越严格的大趋势大背景下，应用前景非常广阔。

最近的研究发现，另一种吩嗪类抗生素吩嗪-1-甲酰胺(PCN)较PA具有更好的安全性、稳定性，以及对植物病原菌具有更高的抑菌活性，同时较之PA，PCN的抗真菌的活性不受使用环境的pH值的影响，而且在pH中性和碱性环境中，PCN抗真菌的活性是PCA的5～10倍。目前利用M18菌发酵制备PA已经实现了多相复式合成的工业化生产，而且M18菌具有优良的PA发酵产率以及长期的生产制备经验，技术条件较为成熟。但是目前无法以原材料通过M18菌菌体发酵等手段直接高效地制备PCN。上述的多相复式合成为多步反应是在同一反应釜中逐步进行，可以同批投料或者分批投料，当每步反应结束之后无需进行中间产物的精制与分离，让上一步反应的产物作为下一步反应的原料，逐步进行后续反应，最终直接获得结构复杂的目标产物。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供了一种高收率的多相复式合成制备PCN的方法。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：

一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.75％N1％质量份配比的CDI，控制温度26℃N30℃，保温反应1.5h～2.5h，得到活性中间体发酵液；步骤(3)中所述的质量份配比为向PCA发酵液中加入为PCA发酵液质量0.75％～1％的CDI；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入5～9％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应2.5h～3.5h，得到收率为88.5％N95％的PCN发酵液；步骤(4)中所述的质量份配比为向活性中间体发酵液中加入为活性中间体发酵液质量5～9％的碳酸氢铵。

作为优选，所述的发酵原料体系由以下配比的原料组成：黄豆粉8-12g/L，玉米粉12-18g/L，植物饼粕脱氯氨基酸液25-35g/L，葡萄糖12-18g/L，甘油20-30g/L，谷氨酸钠12-18g/L，溶剂为水。

作为优选，所述的黄豆粉为黄豆经粉碎机粉碎后过100目筛制得黄豆粉；所述的玉米粉为玉米经粉碎机粉碎后过100目筛制得玉米粉。

作为优选，所述的植物饼粕脱氯氨基酸液为豆粕、火麻粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h，再经减压蒸馏得到的脱氯氨基酸液，所述的豆粕、火麻粕的质量份比为2∶1。

作为优选，步骤(2)中所述的接种M18菌体的发酵菌种接入量占发酵原料体系配方总质量的3％-6％，接种条件为：温度26℃-28℃、转速200-300r/min，保温发酵68-72h，得到的PCA的发酵效价为7980-8340mg/L；接种的M18菌体为保藏号CGMCC NO.0462的甜瓜根际促生拮抗菌M18。

步骤(3)、步骤(4)中所述的PCA发酵液中PCA与CDI反应获得活性中间体发酵液的活性中间体，以及活性中间体在碳酸氢铵作用下反应生成PCN的具体反应流程如下：

与现有技术相比，本发明具备的有益效果为：

N，N-碳酰二咪唑(CDI)在有机合成中主要被用作甲酰基转移试剂和羧酸的活化试剂，由于该试剂反应活性高、廉价和反应后处理简单，具有很高的应用价值。本发明将CDI加入到带有活性氢官能团的PCA发酵液中，生成相应的活性中间体，从而使得该羧酸的酰基被活化，再与加入的碳酸氢铵进行亲核取代反应，生成甲酰胺。CDI结构上的羰基碳原子受到发酵液中PCA结构中羧酸上和氢原子相连的氧原子的攻击，氢离子发生转移，生成一分子带有咪唑的酸酐和一分子具有较强亲核性的咪唑，在咪唑的作用下，酸酐中的碳氧键发生断裂，脱去一分子的二氧化碳，从而生成活性中间体酰基咪唑。而羧酸活化及氨基化的过程中产生的CO

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地说明。

实施例1：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入1％质量份配比的CDI，控制温度26℃N30℃，保温反应2h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入9％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，得到收率为94.2％的PCN发酵液。

实施例2：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.75％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应2h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，得到收率为95％的PCN发酵液。

实施例3：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.75％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应2h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，得到收率为88.5％的PCN发酵液。

实施例4：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.75％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应1.5h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应2.5h，得到收率为90.5％的PCN发酵液。

实施例5：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.85％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应2.5h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3.5h，得到收率为94.3％的PCN发酵液。

实施例6：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入1％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应1.5h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入6％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，得到收率为89.4％的PCN发酵液。

对比例1：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.75％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应2h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入3％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，得到收率为78.5％的PCN发酵液。

对比例2：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.75％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应2h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入12％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，得到收率为95.1％的PCN发酵液。

对比例3：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.75％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应1h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应2h，得到收率为78.3％的PCN发酵液。

对比例4：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.75％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应1h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应1h，得到收率为67.9％的PCN发酵液。

对比例5：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.6％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应2h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，得到收率为82.7％的PCN发酵液。

对比例6：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入1.5％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应2h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，得到收率为85％的PCN发酵液。

对比例7：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.6％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应3h，得到活性中间体发酵液；

(4)向步骤(3)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应4h，得到收率为80.5％的PCN发酵液。

对比例8：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)得到的活性中间体发酵液中加入7.5％质量份配比的碳酸氢铵，保温反应3h，无得到含PCN的发酵液。

对比例9：一种高收率多相复式合成制备PCN的方法，包括以下步骤：

(1)备取M18菌体发酵原料体系；

(2)发酵原料体系灭菌后接种M18菌体，控制发酵条件发酵，得到PCA发酵液；

(3)向步骤(2)中得到的PCA发酵液中加入0.6％质量份配比的CDI，控制温度26℃～30℃，保温反应3h，得到活性中间体发酵液，对该活性中间体发酵液进行检测，无得到含PCN的发酵液。

以上实施例中，所述的发酵原料体系由以下配比的原料组成：黄豆粉10g/L，玉米粉15g/L，植物饼粕脱氯氨基酸液30g/L，葡萄糖15g/L，甘油25g/L，谷氨酸钠15g/L，溶剂为水；所述的黄豆粉为黄豆经粉碎机粉碎后过100目筛制得黄豆粉；所述的玉米粉为玉米经粉碎机粉碎后过100目筛制得玉米粉；所述的植物饼粕脱氯氨基酸液为豆粕、火麻粕经过6mol/L盐酸在110℃水解24h，再经减压蒸馏得到的脱氯氨基酸液，所述的豆粕、火麻粕的质量份比为2∶1；步骤(2)中所述的接种M18菌体的发酵菌种接入量占发酵原料体系配方总质量的6％，接种条件为：温度28℃、转速200r/min，保温发酵72h，得到的PCA的发酵效价为8340mg/L。

实施例2、对比例5、对比例6对比，当往含PCA的发酵液中加入CDI时，PCA结构中活性氢官能团附近的氧原子不断攻击CDI结构中羰基碳原子，羧酸被活化，氢离子发生转移，生成具有活性的酸酐。当CDI添加比例不足时，PCA结构中的羧酸未能全部被活化，则活性酸酐的含量相对降低，导致PCN的收率下降；当继续增加CDI的添加比例时，发酵液中PCA结构中羧酸被全部活化生成相应的活性酸酐，这时过量的CDI会和活性酸酐争夺氨，与氨反应得到脲的副产物，剩余的氨被亲核取代活性酸酐上与羰基碳原子相连的咪唑，生成部分含甲酰胺的PCN，未被氨亲核取代的活性酸酐则留存在发酵液中，进而导致PCN的纯度及收率下降。

实施例2、对比例1、对比例2对比，羧酸化阶段产生的咪唑会进攻活性酸酐上的碳氧键，由于咪唑具有较强的亲核性，会使碳氧键断裂，这时往发酵液中加入NH

实施例1和实施例6、实施例4和对比例4、对比例5和对比例7对比，羧酸活化阶段的反应时间越长，羧酸能充分的转化为中间产物的同时，还会增加副产物生成的概率；若降低羧酸化反应时间，羧酸未能完全转化为中间产物，会导致氨基化反应的原料不足，从而致使PCN收率下降。若增加氨基化反应时间，羧酸能充分的转化为活性中间体，使氨气能更充分的进行亲核取代，氨基化反应更能充分的进行，如继续增加氨基化反应时间，可能增加副产物生成的概率；若降低氨基化反应时间，则氨气不能充分的进行亲核取代，发酵液中活性中间体活化酸酐未能完全转化，氨基化反应不能充分进行，PCN收率呈下降趋势。

对比例8、对比例9和实施例对比发现，无羧酸活化及无氨基化反应，不能从PCA转化为PCN，这说明羧酸需要转化为中间产物，再与NH

应当说明的是，以上所举实施例为本发明的较佳实施方式，仅用来方便说明本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，任何本技术领域人员在不脱离本发明所提技术特征的范围内，利用本发明所揭示技术内容作出的局部改动或修饰的等效实施例，并且未脱离本发明的技术特征内容，均仍属于本发明技术特征的范围。