一种胶体金-PS微球复合微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及聚苯乙烯微球(PS微球)，尤其涉及一种胶体金-PS微球复合微球及其制备方法。

背景技术

在当前的体外诊断领域中，已普遍采用纳米微球作为固相载体，从而实现目标待检分子的识别、捕获、控制与运输。

彩色PS微球是通过在聚苯乙烯基质或表面上结合发色基团制备而成。其具有色彩艳丽,粒径分布窄等特点。并可进行表面修饰，制备出不同功能基团的PS微球，包括PS羧基微球、PS氨基微球和PS环氧基微球，以便于生物活材的偶联负载。

胶体金(Colloidal gold)也称金溶胶(Goldsol)，是由氯金酸被还原成金纳米颗粒后形成的胶体溶液，颜色呈橘红色到紫红色。1971年Faulk和Taylor首次用免疫金标记技术研究沙门菌壁细胞抗原成分，将胶体金与抗体结合,应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体,建立间接免疫金染色法。此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术得到很快发展。免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,具有简单、快速、准确和无污染等优点,在医学、动植物检疫、食品安全监督等领域得到了日益广泛的应用。

虽然彩色PS微球已经得到广泛的应用，但是仍然存在一些难以避免的问题，如：比重小离心难度较大、易发生色彩漂白等。

在IVD领域，由于胶体金采用物理吸附的方法结合，抗原/抗体容易从金颗粒表面脱离，造成标记物不稳定；胶体金易受环境因素，如盐浓度、pH等而产生聚集；胶体金产品作为纳米载体还有粒径较小、检测灵敏度低等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种胶体金-PS微球复合微球，为一种固相载体，既能满足侧向层析技术定性易判读的要求，又能提高检测的灵敏性。本发明的纳米微球材料符合市场发展的需求，适用于推广。

具体地，胶体金-PS微球复合微球，包括表面官能化的胶体金纳米微球与表面能化的PS微球，胶体金纳米微球与PS微球之间的表面官能团共价偶联组装成复合微球，其中胶体金纳米微球位于PS微球的表面。复合微球为纳米微球与PS微球的共价偶联物，其结构是PS母球上偶联胶体金子球，即胶体金纳米微球偶联在PS微球表面，保留胶体金纳米微球的显色特征；同时因胶体金球与PS微球表面均具有官能团，在复合微球表面分布有修饰基团，可以与生物活材偶联反应，可以用于IVD领域中，作为侧向层析的固相载体材料。

胶体金-PS微球复合微球直径可以为150-250nm。

胶体金纳米微球和PS微球的表面官能团可以为羧基、氨基、醛基、环氧基、磺酸基、氯甲基、羟基等。

本发明的另一个目的是提供胶体金-PS微球复合微球的制备方法。

具体地，胶体金-PS微球复合微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)对胶体金纳米微球表面进行附膜保护；

(2)对附膜保护地胶体金纳米微球进行表面官能化修饰；

(3)对PS微球表面官能化修饰；

(4)表面官能化地胶体金纳米微球和PS微球共价偶联组装成复合微球。

步骤(1)中，使用两亲性高分子化合物对胶体金纳米微球进行包覆保护。在保护胶体金等纳米材料的同时，赋予胶体金稳定的结构，保护材料的球型形态以及结构。具体地，所述的胶体金纳米微球表面附膜可以但不局限于为表面进行包硅壳处理。

作为一个实施例，步骤(1)中，取≥1OD胶体金溶液，加入质量体积比为1：1的高分子聚合物水溶液，混匀后，静置反应得到溶液A，其中，胶体金的浓度越高，高分子聚合物附膜的效率越高。溶液A加入体积比为1:19的氨水-有机溶剂搅拌或者震荡混匀，得到溶液B；溶液B中添加含硅酸酯类化合物溶液，反应24小时，得到溶液C；溶液C离心去上清，清洗固体物，复溶并分散，得到表面附有硅壳类的胶体金纳米微球。

其中，高分子聚合物可以为PVP、PVA、泊洛沙姆等。含硅酸酯类化合物溶液中，硅酸类类化合物与有机溶剂的体积比为1:9。有机溶剂为甲醇、乙醇或者异丙醇。离心力10000g，固体物经有机溶剂反复清洗4-5次。

在步骤(2)中，所述的胶体金表面官能化修饰，可以但不局限为氨基化修饰。可包括羧基化、氨基化、醛基化、环氧基化、磺酸基化、氯甲基化、羟基化等修饰。

作为一个实施例，步骤(2)中，附膜后的胶体金纳米微球，即表面硅壳类的胶体金纳米微球，与含有氨基类的硅烷偶联剂溶液反应。所述氨基硅烷偶联剂可为3-氨基丙基三乙氧基硅烷，γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷，N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷中任意一种；硅烷偶联剂溶液的溶剂为1:19的氨水-乙醇、氨水-甲醇或者氨水-异丙醇混合液。溶剂应与表面修饰氨基硅烷偶联剂极性保持一致。

在步骤(3)中，所述的PS微球表面官能化修饰，可以但不局限为羧基化修饰。可包括羧基化、氨基化、醛基化、环氧基化、磺酸基化、氯甲基化、羟基化等修饰。

作为一个实施例，步骤(3)中包括：

1)PS种子的制备：将重蒸苯乙烯单体加入含有乳化剂SDS(十二烷基硫酸钠)的水溶液中，通N

2)PS微球表面官能化修饰：得到溶液F后，取出一部分溶液F，加入含有乳化剂十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液中，补加一定量重蒸苯乙烯单体，通N

在步骤(4)中，所述的偶联组装方式，可以但不局限于胶体金与PS微球间通过羧基与氨基、氨基与氨基、羟基与氨基、羟基与羧基、氨基与环氧基等进行化学连接。

作为一个实施例，步骤(4)中包括：

1)将PS羧基微球用25mM氯化钠溶液洗涤3次后重新分散于25mM氯化钠中得到溶液H。

2)将氨基化胶体金纳米微球分散于25mM氯化钠中得到溶液I。

3)将溶液H与溶液I混合，随即在混匀仪上旋转反应30分钟。旋转反应结束后向反应体系中加入含有EDC/NHS活化剂的氯化钠溶液，继续在混匀仪上反应4h。反应结束后进行离心分离，并用乙醇反复清洗3次，最终得到胶体金-PS微球复合微球。

有益效果：

本发明提供的胶体金-PS微球复合微球作为侧向层析主要固相载体，既能解决PS微球离心难的问题，又能保留胶体金的显色特性且不易造成脱色，同时也能解决胶体金稳定性差、灵敏度低的问题。

附图说明

图1是本发明的胶体金-PS微球复合微球的TEM照片。

图2是本发明的实施例一的胶体金-PS微球的制备过程示意图。

图3是本发明的实施例二的胶体金-PS微球的制备过程示意图。

图4是本发明的实施例三的胶体金-PS微球的制备过程示意图。

图5是本发明的实施例四的胶体金-PS微球的制备过程示意图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在具体实施过程中涉及清洗操作步骤，离心弃去上清液，然后用溶剂复溶，再次离心去上清后复溶，此为完整的一次清洗过程。

(1)胶体金材料的表面附膜保护：使用两亲性高分子对胶体金进行包覆保护。在保护胶体金等纳米材料的同时，赋予胶体金稳定的结构，保护材料的球型形态以及结构。

在具体的实施过程中，取高浓度胶体金溶液(≥1OD)，加入质量体积比为1：1的高分子聚合物水溶液，这些高分子材料可以为PVP、PVA、泊洛沙姆等。胶体金与高分子材料混匀后，静置反应得到溶液A。其中，经过反复验证确认，胶体金的浓度越高，聚合物附膜的效率越高。

得到溶液A后，再加入体积比为1:19的氨水—乙醇、氨水—甲醇或氨水-异丙醇等溶液，搅拌或者震荡混匀，得到溶液B。

向溶液B中添加含硅酸酯类化合物溶液，此处溶剂应与溶液B的溶剂保持一致，相应的应该为甲醇、乙醇或者异丙醇等；进一步的，硅酸类与溶剂的体积比一般为1:9，反应24小时，得到溶液C。

溶液C离心去上清，离心力10000g，优选相应的溶剂反复清洗4-5次后，复溶并分散，得到表面附有硅壳类的胶体金纳米微球。

(2)胶体金纳米微球表面修饰：在表面硅壳类的胶体金纳米微球，与含有氨基类的硅烷偶联剂溶液反应。此处所述氨基硅烷偶联剂可为3-氨基丙基三乙氧基硅烷，γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷，N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷中任意一种；溶剂为1:19的氨水-乙醇、氨水-甲醇或者氨水-异丙醇混合液，相应地，溶剂应与表面修饰氨基硅烷偶联剂极性保持一致，得到溶液D。

溶液D，10000g条件下离心，去除上清液后，优选相应溶剂复溶，并在相同条件下清洗3-4次，最后一次复溶后，超声分散悬浊，得到表面修饰氨基的胶体金溶液E。

(3)PS种子的制备：将重蒸苯乙烯单体加入含有乳化剂SDS(十二烷基硫酸钠)的水溶液中，通N

PS微球表面官能化修饰：取出一部分溶液F，加入含有乳化剂十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液中，补加一定量重蒸苯乙烯单体，通N

(4)胶体金和PS微球的组装：取溶液G和溶液D混合反应偶联，即得到胶体金-PS微球复合微球。

实施例一

(1)取500μl 200OD 40nm粒径的胶体金溶液，加入(m/v)为50％的PVP水溶液10-100μl，混匀后静置反应15分钟；加入含3-5％ TEOS的乙醇溶液100μl，混匀后加入5μl氨水，震荡反应24小时；得包硅后的胶体金纳米微球，用无水乙醇离心清洗4次(10000g，10min/次，超声分散)；超声分散至500μl乙醇中备用。

(2)将包硅后的胶体金纳米微球逐滴加入1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液30-60μl，室温搅拌24小时；离心弃去上清，用无水乙醇离心清洗4次(10000g，10min/次，超声分散)，最后用纯化水复溶得到氨基化胶体金纳米微球。

(3)室温下，取100ml纯化水、100mg SDS、9ml重蒸苯乙烯加入三口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气30分钟。加热升温至75℃，加入1ml 30mg/ml的KPS水溶液，保持氮气气氛，聚合反应8h，得到PS种子微球。

取100ml纯化水、100mg SDS、10ml PS种子微球、5ml苯乙烯单体加入三口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气30分钟；加入1ml 30mg/ml的KPS水溶液，缓慢升温至75℃，反应3h。取500ul的丙烯酸(AA)加入三口瓶中，继续反应10h。待反应结束后，关闭加热使之冷却至室温，将乳胶球溶液离心并去除上清(10000g，20min)，用无水乙醇清洗2-3次，最后用纯化水复溶，即得羧基化PS微球。

(4)取PS羧基微球3mg，用25mM氯化钠溶液洗涤2-3次后重新分散于300μl 25mM氯化钠中。取氨基化胶体金纳米微球8mg，分散于300u l 25mM氯化钠中。将1中所得PS微球逐滴加入到2中所得到的胶体金溶液中，随即在混匀仪上旋转反应30分钟。旋转反应结束后向反应体系中加入EDC/NHS各10mg，EDC/NHS用25mM氯化钠作溶剂，继续在混匀仪上反应4h。反应结束后进行离心分离，5000g，10分钟，用乙醇反复清洗2-3次，最终得到胶体金-PS微球复合微球。

(5)取1ml 10mg/ml的胶体金-PS微球复合微球，加入终浓度为1％戊二醛，活化1h后1000g离心10分钟，加入已确定量的最佳待标记HCG抗体蛋白，摇匀，并加入5％的BSA，封闭非特异性结合，4℃下5000rpm离心，吸掉上清液，将沉淀重悬于含有1％BSA和0.05％NaN

(6)将共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀在玻璃纤维纸上，12小时过夜烘干后，裁成合适长度大小组装成试剂条。

实施例二

(1)取500μl 200OD 40nm粒径的胶体金溶液，加入(m/v)为50％的PVP水溶液10-100μl，混匀后静置反应15分钟；加入含3-5％ TEOS的乙醇溶液100μl，混匀后加入5μl氨水，震荡反应24小时；用无水乙醇离心清洗4次(10000g，10min/次，超声分散)；超声分散至500μl乙醇中备用。

(2)将包硅后的胶体金逐滴加入1％的γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷乙醇溶液30-60μl，室温搅拌24小时；离心弃去上清，用无水乙醇离心清洗4次(10000g，10min/次，超声分散)，最后用纯化水复溶得到氨基化胶体金纳米微球；

(3)室温下，取100ml纯化水、100mg SDS、9ml重蒸苯乙烯加入三口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气30分钟。加热升温至75℃，加入1ml 30mg/ml的KPS水溶液，保持氮气气氛，聚合反应8h，得到PS种子微球。

取100ml纯化水、100mg SDS、10ml PS种子微球、5ml苯乙烯单体加入三口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气30分钟。加入1ml 30mg/ml的KPS水溶液，缓慢升温至75℃，反应3h。取500ul的丙烯酸(AA)加入三口瓶中，继续反应10h。待反应结束后，关闭加热使之冷却至室温，将乳胶球溶液离心并去除上清(10000g，20min)，用无水乙醇清洗2-3次，最后用纯化水复溶，即得羧基化PS微球。

(4)取PS羧基微球3mg，用25mM氯化钠溶液洗涤2-3次后重新分散于300μl 25mM氯化钠中。取氨基化胶体金纳米微球8mg，分散于300u l 25mM氯化钠中。将1中所得PS微球逐滴加入到2中所得到的胶体金溶液中，随即在混匀仪上旋转反应30分钟。旋转反应结束后向反应体系中加入EDC/NHS各10mg，EDC/NHS用25mM氯化钠作溶剂，继续在混匀仪上反应4h。反应结束后进行离心分离，5000g，10分钟，用乙醇反复清洗2-3次，最终得到胶体金-PS微球复合微球。

(5)取1ml 10mg/ml的胶体金-PS微球复合微球，加入戊二醛，使体系的终浓度为1％，活化1h后1000g离心10分钟，加入已确定量的最佳待标记HCG抗体蛋白，摇匀，并加入5％的BSA，封闭非特异性结合，4℃下5000rpm离心，吸掉上清液，将沉淀重悬于含有1％BSA和0.05％NaN

(6)将共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀在玻璃纤维纸上，12小时过夜烘干后，裁成合适长度大小组装成试剂条。

实施例三

(1)取500μl 200OD 40nm粒径的胶体金溶液，加入(m/v)为50％的PVP水溶液10-100μl，混匀后静置反应15分钟；加入含3-5％ TEOS的乙醇溶液100μl，混匀后加入5μl氨水，震荡反应24小时；用无水乙醇离心清洗4次(10000g，10min/次，超声分散)；超声分散至500μl乙醇中备用。

(2)将包硅后的胶体金逐滴加入1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液30-60μl，室温搅拌24小时；离心弃去上清，用无水乙醇离心清洗4次(10000g，10min/次，超声分散)，最后用纯化水复溶得到氨基化胶体金纳米微球；

(3)室温下，取100ml纯化水、100mg SDS、9ml重蒸苯乙烯加入三口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气30分钟。加热升温至75℃，加入1ml 30mg/ml的KPS水溶液，保持氮气气氛，聚合反应8h，得到PS种子微球。

取100ml纯化水、100mg SDS、10ml PS种子微球、5ml苯乙烯单体加入三口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气30分钟。加入1ml 30mg/ml的KPS水溶液，缓慢升温至75℃，反应3h。取500ul的甲基丙烯酸(MAA)加入三口瓶中，继续反应10h。待反应结束后，关闭加热使之冷却至室温，将乳胶球溶液离心并去除上清(10000g，20min)，用无水乙醇清洗2-3次，最后用纯化水复溶，即得羧基化PS微球。

(4)取PS羧基微球3mg，用25mM氯化钠溶液洗涤2-3次后重新分散于300μl 25mM氯化钠中。取氨基化胶体金纳米微球8mg，分散于300μl 25mM氯化钠中。将1中所得PS微球逐滴加入到2中所得到的胶体金溶液中，随即在混匀仪上旋转反应30分钟。旋转反应结束后向反应体系中加入EDC/NHS各10m g，EDC/NHS用25mM氯化钠作溶剂，继续在混匀仪上反应4h。反应结束后进行离心分离，5000g，10分钟，用乙醇反复清洗2-3次，最终得到胶体金-PS微球复合微球。

(5)取1ml 10mg/ml的胶体金-PS微球复合微球，加入戊二醛，使体系的终浓度为1％，活化1h后1000g离心10分钟，加入已确定量的最佳待标记HCG抗体蛋白，摇匀，并加入5％的BSA，封闭非特异性结合，4℃下5000rpm离心，吸掉上清液，将沉淀重悬于含有1％BSA和0.05％NaN

(6)将共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀在玻璃纤维纸上，12小时过夜烘干后，裁成合适长度大小组装成试剂条。

实施例四

(1)取500μl 200OD 40nm粒径的胶体金溶液，加入(m/v)为50％的PVP水溶液10-100μl，混匀后静置反应15分钟；加入含3-5％ TEOS的乙醇溶液100μl，混匀后加入5μl氨水，震荡反应24小时；用无水乙醇离心清洗4次(10000g，10min/次，超声分散)；超声分散至500μl乙醇中备用。

(2)将包硅后的胶体金逐滴加入1％的γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷乙醇溶液30-60μl，室温搅拌24小时；离心弃去上清，用无水乙醇离心清洗4次(10000g，10min/次，超声分散)，最后用纯化水复溶得到氨基化胶体金纳米微球。

(3)室温下，取100ml纯化水、100mg SDS、9ml重蒸苯乙烯加入三口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气30分钟。加热升温至75℃，加入1ml 30mg/ml的KPS水溶液，保持氮气气氛，聚合反应8h，得到PS种子微球。

取100ml纯化水、100mg SDS、10ml PS种子微球、5ml苯乙烯单体加入三口瓶中，以200rpm机械搅拌，并通氮气30分钟。加入1ml 30mg/ml的KPS水溶液，缓慢升温至75℃，反应3h。取500ul的甲基丙烯酸(MAA)加入三口瓶中，继续反应10h。待反应结束后，关闭加热使之冷却至室温，将乳胶球溶液离心并去除上清(10000g，20min)，用无水乙醇清洗2-3次，最后用纯化水复溶，即得羧基化PS微球。

(4)取PS羧基微球3mg，用25mM氯化钠溶液洗涤2-3次后重新分散于300μl 25mM氯化钠中。取氨基化胶体金纳米微球8mg，分散于300u l 25mM氯化钠中。将1中所得PS微球逐滴加入到2中所得到的胶体金溶液中，随即在混匀仪上旋转反应30分钟。旋转反应结束后向反应体系中加入EDC/NHS各10mg，EDC/NHS用25mM氯化钠作溶剂，继续在混匀仪上反应4h。反应结束后进行离心分离，5000g，10分钟，用乙醇反复清洗2-3次，最终得到胶体金-PS微球复合微球。

(5)取1ml 10mg/ml的胶体金-PS微球复合微球，加入戊二醛，使体系的终浓度为1％，活化1h后1000g离心10分钟，加入已确定量的最佳待标记HCG抗体蛋白，摇匀，并加入5％的BSA，封闭非特异性结合，4℃下5000rpm离心，吸掉上清液，将沉淀重悬于含有1％BSA和0.05％NaN

(6)将共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀在玻璃纤维纸上，12小时过夜烘干后，裁成合适长度大小组装成试剂条。

胶体金试纸条的组装：

将样品垫、共价结合的复合微球抗体蛋白复合物涂匀的玻璃纤维纸、包被硝酸纤维素NC膜及吸水纸依次搭接粘贴成试纸带，用切割机将试纸带切割成合适宽度的试纸条，即可用于临床样本的快速检测。

将三种不同标记方法金标试纸条用HCG参考品检测，进行灵敏度和稳定性对比，对比数据如下：

灵敏度的比较

表1:

备注：“－”阴性；“+”阳性，越多“+”表示显色程度越深，阳性越强；“±”弱阳性，肉眼隐约可见。

在以上的实施例中，未详细描述的各种方法过程和方法是本领域中公知的常规方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术用户员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。