具有美白功效的油茶花黄酮纳米颗粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域。更具体地，涉及一种具有美白功效的油茶花黄酮纳米颗粒及其制备方法与应用。

背景技术

油茶是中国特有油料作物，每年10月至次年3月开花，其花朵富含蛋白质、氨基酸、还原糖、多糖、多酚、黄酮、花青素和维生素等营养物质和生物活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗衰老等生物活性，在食品、医药、化妆品等各领域都有广泛应用前景。但是，目前对油茶花的研究甚少，对其开发利用仅局限于将其直接作为花茶饮料或作为调理剂加入到面膜中，并未对其功能活性进行深入研究，未对油茶花资源进行合理的开发利用。

在油茶花活性成分中，黄酮化合物含量最为丰富，黄酮可以通过抑制与黑色素合成相关酶(酪氨酸酶)的催化活性，从来源处减少黑色素生成，阻止色素沉积，以减少皮肤老化斑、皱纹、黄褐斑等的形成，达到美白的效果，是一种绿色安全的天然美白剂；并且油茶花黄酮还具有抗氧化作用，能还原巴醌、DHI、DHICA等黑色素中间体，是作为抑制黑色素生成的另一种美白途径。如中国专利申请CN112263625A公开了一种油茶浓缩液，该浓缩液由油茶蒲、油茶枝叶、油茶花经丙二醇、丙三醇或丁二醇的水溶液加热提取得到，具有较好的抗氧化性能；但是在实际的应用过程中发现，油茶花黄酮在环境中不稳定，不仅暴露在酸碱、光照、高温等环境下很容易降解，室温环境中也不稳定，造成其生物活性显著降低，极大地限制了其应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有油茶花黄酮稳定性差的缺陷和不足，提供一种可显著提高稳定性的具有美白功效的油茶花黄酮纳米颗粒。

本发明的目的是提供所述具有美白功效的油茶花黄酮纳米颗粒的制备方法。

本发明另一目的是提供所述具有美白功效的油茶花黄酮纳米颗粒的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种具有美白功效的油茶花黄酮纳米颗粒，主要由油茶花黄酮、多糖类化合物、金属离子交联剂和烯基琥珀酸酐酯制成。

本发明的纳米颗粒基于多糖类化合物和金属离子交联剂之间的静电相互作用，交联形成具有聚合物网络的纳米粒，具有无毒、无有机溶剂、方便、可控等优点。通过氢键和疏水键与黄酮类物质相互作用，将油茶花黄酮化合物包裹在纳米颗粒中，可以减少外界环境造成的油茶花黄酮降解问题，进而显著提高其稳定性。同时加入表面活性剂烯基琥珀酸酐酯可以进一步提高油茶花黄酮的水溶性和纳米颗粒的稳定性，最终达到显著提高油茶花黄酮活性和生物利用度的效果。将油茶花黄酮制成纳米颗粒后，其粒径通常小于500nm，可以提高油茶花黄酮的溶解性和稳定性，通过加入烯基琥珀酸酐酯可以进一步提高纳米颗粒的稳定性。

进一步地，所述油茶花黄酮提取物、多糖类化合物、金属离子交联剂的质量比为(3～16):10:(5～1):(10～1)。

更进一步地，所述多糖类化合物选自壳聚糖、果胶、海藻酸钠、黄原胶中的一种或多种。

进一步地，所述金属离子交联剂选自多聚磷酸钠、氯化钙、氯化镁中的一种或多种。

更进一步地，所述油茶花黄酮提取物的制备包括以下步骤：

将油茶花加入乙醇溶液中，微波提取完全，后处理，即得油茶花黄酮提取物。

进一步地，所述乙醇溶液的体积浓度为30％～70％。优选地，所述乙醇溶液的体积浓度为40％～60％；更优选地，所述乙醇溶液的体积浓度为50％。

更进一步地，所述油茶花加入乙醇溶液中的料液比为1:(15～35)g/mL。优选地，所述油茶花加入乙醇溶液中的料液比为1:(25～35)g/mL；更优选地，所述油茶花加入乙醇溶液中的料液比为1:30g/mL。

进一步地，所述微波提取的功率为80～720W。优选地，所述微波提取的功率为80～400W；更优选地，所述微波提取的功率为240W。

更进一步地，所述微波提取的时间为(30～150)s。优选地，所述微波提取的时间为(60～120)s；更优选地，所述微波提取的时间为90s。

进一步地，所述油茶花提取前干燥，粉碎后用100目筛网过筛再进行提取。

优选地，所述后处理为过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥。

另外的，本发明还提供了所述油茶花黄酮纳米颗粒的制备方法，具体包括以下步骤：

于多糖类化合物溶液中加入烯基琥珀酸酐酯乙醇溶液，混合均匀，得混合液；将油茶花黄酮提取物溶液和金属离子交联剂溶液混合，加入上述混合液中，交联反应完全，得油茶花黄酮纳米颗粒悬浮液，真空干燥，得油茶花黄酮纳米颗粒。

进一步地，所述多糖类化合物溶液的浓度为1～5mg/mL。优选地，所述多糖类化合物溶液的浓度为1～3mg/mL；更优选地，所述多糖类化合物溶液的浓度为1mg/mL。

更进一步地，所述金属离子交联剂溶液的浓度为0.5～4.5mg/mL。优选地，所述金属离子交联剂溶液的浓度为1.5～3.5mg/mL；更优选地，所述金属离子交联剂溶液的浓度为2.5mg/mL。

进一步地，所述油茶花黄酮提取物溶液的浓度为2～10mg/mL。优选地，所述油茶花黄酮提取物溶液的浓度为2～6mg/mL；更优选地，所述油茶花黄酮提取物溶液的浓度为4mg/mL。

更进一步地，所述多糖类化合物与金属离子交联剂的质量比为(2～6):1。优选地，所述多糖类化合物与金属离子交联剂的质量比为(2～4):1；更优选地，所述多糖类化合物与金属离子交联剂的质量比为3:1。

进一步地，所述多糖类化合物与油茶花黄酮提取物的质量比为10:(3～16)。

更进一步地，所述多糖类化合物与烯基琥珀酸酐酯的质量比为(1～9):1。优选地，所述多糖类化合物与烯基琥珀酸酐酯的质量比为(3～7):1；更优选地，所述多糖类化合物与烯基琥珀酸酐酯的质量比为5:1。

优选地，所述混合均匀的温度为(40～60)℃，时间为(2～10)h。

优选地，所述交联反应在室温条件下进行，时间为(30～60)min。

本发明通过实验证明，油茶花黄酮制成油茶花黄酮纳米颗粒后，抗氧化和酪氨酸酶抑制活性显著提高，具有较好美白效果。

因此，本发明还要求保护所述油茶花黄酮纳米颗粒在美白产品中的应用。所述产品可以是化妆品、保健品等。

本发明具有以下有益效果：

本发明油茶花黄酮纳米颗粒基于多糖类化合物和金属离子交联剂之间的静电相互作用，交联形成具有聚合物网络的纳米粒，以烯基琥珀酸酐酯作为表面活性剂，用于提高纳米颗粒的稳定性，通过氢键和疏水键的作用，将油茶花黄酮化合物包裹在纳米颗粒中，可以提高油茶花黄酮的水溶性，减少环境造成的油茶花黄酮降解问题，进而显著提高其稳定性，最终达到显著提高油茶花黄酮活性和生物利用度的效果。

附图说明

图1为本发明实施例1中乙醇溶液体积分数对油茶花黄酮提取的影响研究数据统计图。

图2为本发明实施例1中料液比对油茶花黄酮提取的影响研究数据统计图。

图3为本发明实施例1中微波功率对油茶花黄酮提取的影响研究数据统计图。

图4为本发明实施例1中微波时间对油茶花黄酮提取的影响研究数据统计图。

图5为本发明实验例1中液相质谱联用检测到的色谱图。

图6为本发明实验例2抗氧化活性DPPH自由基清除能力的测定数据统计图。

图7为本发明实验例2抗氧化活性ABTS自由基清除能力的测定数据统计图。

图8为本发明实验例3油茶花黄酮纳米颗粒的酪氨酸酶抑制活性测定的数据统计图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1油茶花黄酮提取的条件筛选

1、乙醇溶液体积分数对油茶花黄酮提取的影响

以干燥过100目筛的1g油茶花粉为原料，设置乙醇溶液体积为单因素变量，分别采用30％、40％、50％、60％、70％体积浓度的乙醇溶液，使料液比为1:20g/mL，在400W的微波功率条件下，微波提取120s，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，即得油茶花黄酮提取物。

测定油茶花提取物中的黄酮含量，计算油茶花的黄酮含量，结果参见图1，由图可见，在30％～70％体积浓度的乙醇溶液提取条件下提取得到的黄酮含量均较高，其中，50％体积浓度的乙醇溶液提取量最大，可高达91.44mg/g。

2、料液比对油茶花黄酮提取的影响

以干燥过100目筛的1g油茶花粉为原料，加入50％体积浓度的乙醇溶液，设置料液比为单因素变量，分别采用料液比为1:15g/mL、1:20g/mL、1:25g/mL、1:30g/mL、1:35g/mL，在400W的微波功率条件下，微波提取120s，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，即得油茶花黄酮提取物。

测定油茶花提取物中的黄酮含量，计算油茶花的黄酮含量，结果参见图2，由图可见，在料液比1:(15～35)g/mL条件下提取得到的黄酮含量均较高，其中，1:30g/mL的料液比提取量最大，可高达93.92mg/g。

3、微波功率对油茶花黄酮提取的影响

以干燥过100目筛的1g油茶花粉为原料，加入50％体积浓度的乙醇溶液，使料液比为1:20g/mL，设置微波功率为单因素变量，分别在80W、240W、400W、560W、720W的微波功率条件下，微波提取120s，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，即得油茶花黄酮提取物。

测定油茶花提取物中的黄酮含量，计算油茶花的黄酮含量，结果参见图3，由图可见，在80～720W功率微波提取条件下提取得到的黄酮含量均较高，其中，240W微波功率时提取量最大，可高达90.39mg/g。

4、微波提取时间对油茶花黄酮提取的影响

以干燥过100目筛的1g油茶花粉为原料，加入50％体积浓度的乙醇溶液，使料液比为1:20g/mL，在400W的微波功率条件下，设置微波提取时间为单因素变量，分别微波提取30s、60s、90s、120s、150s，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，即得油茶花黄酮提取物。

测定油茶花提取物中的黄酮含量，计算油茶花的黄酮含量，结果参见图4，由图可见，微波提取时间(30～150)s提取得到的黄酮含量均较高，其中，微波提取90s时提取量最大，可高达94.64mg/g。

实施例2油茶花黄酮的提取

所述油茶花黄酮的提取具体包括以下步骤：

以干燥过100目筛的油茶花粉为原料，加入50％体积浓度的乙醇溶液，使料液比为1:30g/mL，在240W的微波功率条件下，微波提取90s，过滤，滤液减压浓缩，冷冻干燥，即得油茶花黄酮提取物。

实施例3油茶花黄酮纳米颗粒制备的条件筛选

1、壳聚糖(CS)与多聚磷酸钠(TPP)质量比对纳米颗粒粒径、PDI、包封率的影响

采用离子凝胶法，将质量浓度为3mg/mL的壳聚糖溶液和质量浓度为1mg/mL的烯基琥珀酸酐酯乙醇溶液混合(壳聚糖与烯基琥珀酸酐酯的质量比为5:1)，在40℃以550rmp的速度在磁力搅拌器上持续搅拌2h，得混合液；将1mL质量浓度为2mg/mL的油茶花黄酮提取物溶液(壳聚糖与油茶花黄酮提取物的质量比为3:1)和质量浓度为2.5mg/mL的多聚磷酸钠溶液混合均匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，通过微量注射泵以1滴/秒速度滴加到上述混合液中；其中，设置壳聚糖与TPP的质量比为单因素变量，分别为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1，继续搅拌30min即得油茶花黄酮纳米颗粒悬浮液，在-20℃真空干燥，得到油茶花黄酮纳米颗粒。测定所得油茶花黄酮纳米颗粒的颗粒粒径、PDI和包封率，结果参见表1。

表1 CS与TPP质量比对纳米颗粒粒径、PDI、包封率的影响

由表可见，壳聚糖与TPP的质量比在(2～6):1的范围内均能达到较好的颗粒粒径、PDI、包封率。采用灰色关联系数法对表中的数据进行统计分析，可知，不同CS与TPP质量比所制得纳米颗粒的综合评价值分别为：Z

2、壳聚糖(CS)浓度对纳米颗粒粒径、PDI、包封率的影响

采用离子凝胶法，设置壳聚糖的浓度为单因素变量，分别将质量浓度为1、2、3、4、5mg/mL的壳聚糖溶液和质量浓度为1mg/mL的烯基琥珀酸酐酯乙醇溶液混合混合(壳聚糖与烯基琥珀酸酐酯的质量比为5:1)，在40℃以550rmp的速度在磁力搅拌器上持续搅拌2h，得混合液；将1mL质量浓度为2mg/mL的油茶花黄酮提取物溶液(壳聚糖与油茶花黄酮提取物的质量比为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1)和质量浓度为2.5mg/mL的多聚磷酸钠溶液混合均匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，通过微量注射泵以1滴/秒速度滴加到上述混合液中，其中，壳聚糖与TPP的质量比为3:1，以550rmp的速度在磁力搅拌器上搅拌30min，即得油茶花黄酮纳米颗粒悬浮液，在-20℃真空干燥，得到油茶花黄酮纳米颗粒。测定所得油茶花黄酮纳米颗粒的颗粒粒径、PDI和包封率，结果参见表2。

表2CS浓度对纳米颗粒粒径、PDI、包封率的影响

由表可见，壳聚糖浓度在(1～5)mg/mL的范围内均能达到较好的颗粒粒径、PDI、包封率。采用灰色关联系数法对表中的数据进行统计分析，可知，不同CS浓度所制得纳米颗粒的综合评价值分别为：Z

3、多聚磷酸钠(TPP)浓度对纳米颗粒粒径、PDI、包封率的影响

采用离子凝胶法，将质量浓度为3mg/mL的壳聚糖溶液和质量浓度为1mg/mL的烯基琥珀酸酐酯乙醇溶液混合(壳聚糖与烯基琥珀酸酐酯的质量比为5:1)，在40℃以550rmp的速度在磁力搅拌器上持续搅拌2h，得混合液。将1mL质量浓度为2mg/mL的油茶花黄酮提取物溶液(壳聚糖与油茶花黄酮提取物的质量比为3:1)和多聚磷酸钠溶液混合均匀经0.45μm的微孔滤膜过滤，通过微量注射泵以1滴/秒速度滴加到上述混合液中，以550rmp的速度在磁力搅拌器上搅拌30min，设置TPP的浓度为单因素变量，分别将质量浓度为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5mg/mL的多聚磷酸钠溶液逐滴滴入混合液中，其中，壳聚糖与TPP的质量比为3:1，继续搅拌30min即得油茶花黄酮纳米颗粒悬浮液，在-20℃真空干燥，得到油茶花黄酮纳米颗粒。测定所得油茶花黄酮纳米颗粒的颗粒粒径、PDI和包封率，结果参见表3。

表3 TPP浓度对纳米颗粒粒径、PDI、包封率的影响

由表可见，TPP浓度在(0.5～4.5)mg/mL的范围内均能达到较好的颗粒粒径、PDI、包封率。采用灰色关联系数法对表中的数据进行统计分析，可知，不同TPP浓度所制得纳米颗粒的综合评价值分别为：Z

4、油茶花黄酮提取物溶液浓度对纳米颗粒粒径、PDI、包封率的影响

采用离子凝胶法，将质量浓度为3mg/mL的壳聚糖溶液和质量浓度为1mg/mL的烯基琥珀酸酐酯乙醇溶液混合(壳聚糖与烯基琥珀酸酐酯的质量比为5:1)，在40℃以550rmp的速度在磁力搅拌器上持续搅拌2h，得混合液；将1mL油茶花黄酮提取物溶液和多聚磷酸钠溶液混合均匀经0.45μm的微孔滤膜过滤，通过微量注射泵以1滴/秒速度滴加到多糖类化合物和烯基琥珀酸酐酯混合溶液中，设置油茶花黄酮提取物溶液的油茶花黄酮提取物浓度为单因素变量，浓度分别为2、4、6、8、10mg/mL(壳聚糖与油茶花黄酮提取物的质量比为0.6:1、0.75:1、1:1、1.5:1、3:1)，其中，壳聚糖与TPP的质量比为3:1，以550rmp的速度在磁力搅拌器上搅拌30min，继续搅拌30min即得油茶花黄酮纳米颗粒悬浮液，在-20℃真空干燥，得到油茶花黄酮纳米颗粒。测定所得油茶花黄酮纳米颗粒的颗粒粒径、PDI和包封率，结果参见表4。

表4油茶花黄酮提取物溶液浓度对纳米颗粒粒径、PDI、包封率的影响

由表可见，油茶花黄酮提取物溶液浓度在(2～10)mg/mL的范围内均能达到较好的颗粒粒径、PDI、包封率。采用灰色关联系数法对表中的数据进行统计分析，可知，不同TPP浓度所制得纳米颗粒的综合评价值分别为：Z

实施例4油茶花黄酮纳米颗粒的制备

所述油茶花黄酮纳米颗粒的制备具体包括以下步骤：

采用离子凝胶法，将质量浓度为1mg/mL的壳聚糖溶液和质量浓度为1mg/mL的烯基琥珀酸酐酯乙醇溶液混合(壳聚糖与烯基琥珀酸酐酯的质量比为5:1)，在40℃以550rmp的速度在磁力搅拌器上持续搅拌2h，得混合液；将1mL质量浓度为4mg/mL的油茶花黄酮提取物溶液(壳聚糖与油茶花黄酮提取物的质量比为3:2)和质量浓度为2.5mg/mL的多聚磷酸钠溶液混合均匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，通过微量注射泵以1滴/秒速度滴加到上述混合液中，其中，壳聚糖与TPP的质量比为3:1，以550rmp的速度在磁力搅拌器上搅拌30min，即得油茶花黄酮纳米颗粒悬浮液，在-20℃真空干燥，得到油茶花黄酮纳米颗粒。

测定可知，所得油茶花黄酮纳米颗粒的粒径为329.5nm、PDI为0.451、zeta电位为35.3mV。

实验例1油茶花黄酮提取物定性分析

将实施例2制备得到的油茶花黄酮提取物经过液相质谱联用仪进行定性分析，具体检测条件如下：

1、色谱条件

使用ACQUITY UHPLC BEH C

2、质谱条件

干燥气流(N

结果参见图5，结合图和现有文献，实施例2制备得到的油茶花黄酮提取物中共鉴定出6种黄酮化合物，具体为儿茶素、葡萄糖没食子鞣苷、山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮苷、杨梅苷和表儿茶素。

其中，成分1的精确分子式为C

成分2和成分3保留时间不同，但是分子式都为C

成分4在质谱分析软件下计算出精确分子式为C

成分5，在负离子模式下一级扫描产生离子碎片[M-H]

成分6经过质谱分析软件精确计算的分子式为C

实验例2不同载体纳米颗粒的活性测定

参考实施例4，替换掉壳聚糖及多聚磷酸钠，分别采用不同的载体(海藻酸钠CaCl

表5不同载体纳米颗粒的活性测定

由表可见，将油茶花黄酮提取物包埋在纳米颗粒载体中可以起到提高其生物活性的效果，以多糖为载体的纳米颗粒生物活性高于以蛋白质为载体的纳米颗粒，且在以多糖为载体的5种纳米颗粒中，壳聚糖纳米颗粒具有最高的生活活性，美白效果明显优于其他载体的纳米颗粒。

实验例3不同表面活性剂和烯基琥珀酸酐酯对比

参考实施例4，替换掉烯基琥珀酸酐酯，分别采用不同的表面活性剂(十二烷基硫酸钠、吐温80、聚乙二醇和缩水甘油三甲基氯化铵)，制成纳米颗粒。储存在25℃恒温培养箱中，30天后取出样品测定粒径和水溶性(水中黄酮的溶解量)变化。

表6不同表面活性剂和烯基琥珀酸酐酯对比

对比烯基琥珀酸酐酯和其他表面活性剂(十二烷基硫酸钠、吐温80、聚乙二醇和缩水甘油三甲基氯化铵)对制得的纳米颗粒稳定性和水溶性的影响，结果表明以烯基琥珀酸酐酯作为表面活性剂的纳米颗粒显示出优异的储存稳定性和水溶性，储存30天后粒径仅增长了87.7nm，水溶性是游离油茶花黄酮的880倍，且远高于加入其他表面活性剂的纳米颗粒。可见烯基琥珀酸酐酯可以显著提高纳米颗粒的稳定性和活性物质水溶性。

实验例4烯基琥珀酸酐酯添加量对纳米颗粒储存稳定性的影响

采用离子凝胶法，将质量浓度为3mg/mL的壳聚糖溶液和质量浓度为1mg/mL的烯基琥珀酸酐酯乙醇溶液混合，设置壳聚糖与烯基琥珀酸酐酯质量比为单因素变量，分别为1:1、3:1、5:1、7:1、9:1，在40℃以550rmp的速度在磁力搅拌器上持续搅拌2h，得混合液，将1mL质量浓度为2mg/mL的油茶花黄酮提取物溶液(壳聚糖与油茶花黄酮提取物的质量比为3:1)和质量浓度为2.5mg/mL的多聚磷酸钠溶液混合均匀，经0.45μm的微孔滤膜过滤，通过微量注射泵以1滴/秒速度滴加到上述混合液中，其中，壳聚糖与TPP的质量比为3:1，以550rmp的速度在磁力搅拌器上搅拌30min，即得油茶花黄酮纳米颗粒悬浮液，在-20℃真空干燥，得到油茶花黄酮纳米颗粒。

将不同烯基琥珀酸酐酯添加量的纳米颗粒在室温下放置7、14、21、28、35天，测定颗粒粒径的变化，结果参见表7。

表7壳聚糖与烯基琥珀酸酐酯质量比对纳米颗粒储存过程粒径变化的影响

如表所示，加入表面活性剂烯基琥珀酸酐酯的纳米颗粒稳定性增加，烯基琥珀酸酐酯添加量越大纳米颗粒越稳定，但当添加量过大时会造成絮凝，导致纳米颗粒粒径增大，认为粒径小于500nm为纳米颗粒，所以选择以壳聚糖与烯基琥珀酸酐酯质量比为5:1为最佳烯基琥珀酸酐酯添加量。

实验例5油茶花黄酮提取物和纳米颗粒的抗氧化活性测定

分别采用DPPH和ABTS法对油茶花黄酮(COAF)、油茶花黄酮纳米颗粒(COAF-NPs)的抗氧化性能进行比较：

1、DPPH自由基清除能力的测定：吸取0.5mL样品(浓度分别为5、10、15、20、25μg/mL)与2.5mL浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液混合，在黑暗中反应30min，以无水乙醇调零，维生素C(Vc)作为阳性对照，测定517nm处的OD值，结果参见图6。

由图可见，在5～25μg/mL浓度范围内，油茶花黄酮和纳米颗粒的DPPH自由基清除能力最大分别为29.92％和47.67％，即油茶花黄酮包埋在纳米颗粒后DPPH自由基清除能力提高了1.59倍。

2、ABTS自由基清除能力的测定：吸取0.5mL样品(浓度为5、10、15、20、25μg/mL)与2.5mL ABTS溶液混合，在黑暗中反应5min，维生素C(Vc)作为阳性对照，测定734nm处的OD值，结果参见图7。

由图可见，在5～25μg/mL浓度范围内，油茶花黄酮和纳米颗粒的ABTS自由基清除能力最大分别为89.16％和99.47％，即油茶花黄酮包埋在纳米颗粒后ABTS自由基清除能力提高了1.12倍。

实验例6油茶花黄酮纳米颗粒的酪氨酸酶抑制活性测定

将40μL样品(浓度分别为22.5、32.5、42.5、52.5、62.5μg/mL)与40μL浓度为124U/mL的酪氨酸酶溶液和80μL磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 6.8)混合，在37℃下黑暗中反应10min，然后加入40μL浓度为5mmol/L的底物左旋多巴(L-DOPA)，继续在37℃下再反应30分钟，使用酶标仪测定475nm处的OD值，结果参见图8。

由图可见，在22.5～62.5μg/mL浓度范围内，油茶花黄酮和纳米颗粒的酪氨酸酶抑制活性最大分别为70.12％和94.53％，即油茶花黄酮包埋在纳米颗粒后DPPH自由基清除能力提高了1.35倍。

实验例7负载油茶花黄酮纳米颗粒的稳定性研究

1、储藏稳定性研究

将油茶花黄酮提取物溶液和实施例4负载油茶花黄酮的纳米颗粒储存在25℃恒温培养箱中，每隔7天取出样品测定其抑制酪氨酸酶活性和抗氧化能力，结果参见表8。

表8储藏稳定性实验结果

由上表可看出，与油茶花黄酮提取物溶液相比，将油茶花黄酮负载在纳米颗粒中随着储存时间的增加其抑制酪氨酸酶活性和抗氧化性变化趋势较小，证明纳米颗粒可以提高油茶花黄酮储存稳定性。

2、热稳定性研究

将油茶花黄酮提取物溶液和实施例4负载油茶花黄酮纳米颗粒分别在20℃、40℃、60℃或80℃恒温水浴锅中温育5min，测定其抑制酪氨酸酶活性和抗氧化能力变化情况，结果参见表9。

表9热稳定性实验结果

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由上表可看出，与油茶花黄酮提取物溶液相比，将油茶花黄酮负载在纳米颗粒中温度对其抑制酪氨酸酶活性和抗氧化性影响较小，证明纳米颗粒可以提高油茶花黄酮热稳定性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。