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具有P2X4受体拮抗活性的N-苯乙酰胺用于治疗某些眼部疾病的用途

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明涵盖P2X4拮抗剂用于治疗干眼综合征的用途，更特别地，如本文中描述和定义的通式(I)的取代的N-苯乙酰胺化合物，用于制造治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的药物组合物的用途。

背景技术

眼痛是一种不愉快的感觉和情绪体验，包括感觉分辨、情绪、认知和行为性成分，并由不同的、相互联系的外周和中枢神经系统元素支持。由支配眼睛的三叉神经节(TG)神经元的感觉轴突的有害刺激激发的正常或生理性疼痛结果。这些在功能上是异质的。机械伤害性感受器仅被有害的机械力激发。多觉型伤害性感受器也对热、外源性刺激物和内源性炎症介质有反应，而冷热感受器检测适度的温度变化。它们对刺激力的独特敏感性取决于特定类别离子通道的表达：Piezo2用于机械力，TRPV1和TRPA1用于热和化学剂，TRPM8用于冷。刺痛是由机械伤害性感受器引起的，而多觉型伤害性感受器负责眼睛灼痛和刺痛；干燥的感觉似乎主要是由冷热感受器引起的。局部炎症释放的介质增加眼部多觉型伤害性感受器的兴奋性，导致其致敏和痛觉增强。在慢性炎症期间，刺激转导和电压敏感离子通道的表达和功能会发生额外的、持久的变化，从而改变多觉型末端的兴奋性并引起慢性炎性疼痛。当外伤、感染或代谢过程直接损伤眼神经末梢时，由于转导和兴奋性调节离子通道的异常表达，这些神经末梢会显示异常的脉冲放电。这种故障会引起“神经性疼痛”，这也可能是由于眼部TG神经元投射的高级大脑结构功能异常所致。眼部疾病或眼表手术引起不同程度的炎症和/或神经损伤，进而不同程度地激活眼睛的感觉纤维。当炎症占主导地位时(过敏性或光化性角膜结膜炎)，多觉型伤害性感受器主要受到刺激和敏化，从而引起疼痛。在简单的光折变手术和中度干眼中，似乎冷热感受器受到主要影响，引起明显的令人不快的干燥感。(“What Causes Eye Pain？”Carlos Belmonte et al.Curr Ophthalmol Rep(2015)3:111变化，从)

首次发现P2X4在治疗眼部疼痛中起着重要作用。

如下文所示的通式(I)的取代的N-苯乙酰胺是P2X4的拮抗剂或负变构调节剂。三磷酸腺苷ATP被广泛认为是一种重要的神经递质，其通过嘌呤能受体的不同亚型发挥作用而涉及各种生理和病理生理作用(Burnstock 1993,Drug Dev Res 28:196-206；Burnstock2011,Prog Neurobiol 95:229-274)。迄今为止，已克隆出P2X家族的七个成员，包括P2X1-7(Burnstock 2013,Front Cell Neurosci 7:227)。P2X4受体是一种配体门控离子通道，在多种细胞类型上表达，这些细胞类型主要参与炎症/免疫过程，具体包括单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和小神经胶质细胞(Wang et al.,2004,BMC Immunol 5:16；Brone et al.,2007Immunol Lett 113:83-89)。此外，已知通过细胞外ATP激活P2X4会导致促炎细胞因子和前列腺素(PGE2)的释放(Bo et al.,2003Cell Tissue Res 313:159-165；Ulmann etal.,2010,EMBO Journal 29:2290-2300；de Ribero Vaccari et al.,2012,J Neurosci32:3058-3066)。文献中使用动物模型的许多条证据表明P2X4受体参与伤害感受和疼痛。缺乏P2X4受体的小鼠在面对多种炎症攻击(例如完全弗氏佐剂(CFA)、角叉菜胶或福尔马林)时不会产生疼痛超敏反应(Ulmann et al.,2010,EMBO Journal 29:2290-2300)。此外，缺乏P2X4R的小鼠在外周神经损伤后不会发生机械性触诱发痛，表明P2X4在神经性疼痛病症中的作用非常显著(Tsuda et al.,2009,Mol Pain 5:28；Ulmann et al.,2008,JNeurocsci 28:11263-11268)。Moehring等人(Elife.2018Jan 16；7“Keratinocytesmediate innocuous and noxious touch via ATP-P2X4 signaling”)报道了识别P2X4信号传导为基线哺乳动物触觉的关键组成部分的实验。这些实验为发生在皮肤疼痛和瘙痒疾病中的功能失调信号传导的后续研究奠定了至关重要的基础。

EP2597088A1记载了P2X4受体拮抗剂和式(III)的二氮杂卓(diazepine)衍生物或其药理学上可接受的盐。所述文献还公开了式(I)、(II)、(III)所代表的P2X4受体拮抗剂二氮杂卓衍生物或其药理学上可接受的盐(具有P2X4受体拮抗作用)作为有效的预防或治疗伤害性、炎性和神经性疼痛的试剂的用途。更详细地，EP2597088A1记载了P2X4受体拮抗剂作为各种癌症、糖尿病性神经炎、病毒性疾病如疱疹和骨关节炎引起的疼痛的预防剂或治疗剂是有效的。根据EP2597088A1的预防剂或治疗剂还可以与其他药剂结合使用，例如阿片类镇痛剂(例如吗啡、芬太尼)、钠通道抑制剂(例如奴佛卡因(novocaine)、利多卡因(novocaine))或NSAID(例如阿司匹林、布洛芬)。用于由癌症引起的疼痛的P2X4受体拮抗剂也可以与制癌剂(carcinostatic)例如化学疗法结合使用。其他P2X4受体拮抗剂及其用途公开于WO2013105608、WO2015005467和WO2015005468、WO2016198374、WO2017191000、WO2018/104305、WO2018/104307中。

“Discovery and characterization of novel,potent and selective P2X4receptor antagonists for the treatment of pain”在2014年神经科学学会年会(Society for Neuroscience AnnualMeeting 2014)上发表(Carrie A Bowen et al.；poster N.241.1)。所述海报记载了识别跨物种抑制P2X4的新型、强效和选择性小分子拮抗剂的方法，以及如何在神经性和炎性疼痛的实验模型中评价所选化合物。特别是记载了基于人类、大鼠、小鼠P2X4R FLIPR的筛选方法、人类P2X4R电生理学测定、合适的小鼠神经病变模型和小鼠炎症模型。

现有技术中没有关于以下的文献：P2X4拮抗剂用于治疗用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的用途，特别是如本文所述和定义的通式(I)的取代的N-苯乙酰胺在制造用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的药物组合物中的用途，所述拮抗剂作为单独的药剂或与其他活性成分结合。

因此，通常的抑制剂，特别是本文公开的那些抑制剂代表了治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的有价值的治疗选择，所述抑制剂作为单一药物或与其他药物结合。

发明内容

根据主要方面，本发明涵盖用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的抑制P2X4的化合物。

根据第一方面，本发明涵盖用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的通式(I)的化合物及其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物和盐，以及它们的混合物：

其中A为CH或N

在第二方面，本发明涵盖用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的通式(Ia)的化合物及其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物和盐，以及它们的混合物：

其中

在另一方面，本发明涵盖用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的通式(Ib)的化合物及其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物和盐，以及它们的混合物：

另一方面涵盖根据WO2017191000的式(I)化合物

其中

X代表C-R

其中*表示所述基团与分子其余部分的连接点；

其中

被R

被两个相邻的取代基R

其中

彼此相邻的R

-O-CH

与它们连接的氮原子一起形成4元至6元含氮杂环，所述环任选地含有一个选自O、S、NH、NR

其中*表示所述基团与分子其余部分的连接点；

n代表0、1、2或3；

或所述化合物的N-氧化物、盐、水合物、溶剂合物、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐，用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛。

根据WO2017191000的式(I)化合物的合成记载于WO2017191000的第80至90页中并纳入本文。用于合成所述化合物和合成相关中间体的其他一般实验方法记载于WO2017191000的第98至228页中并纳入本文。根据WO2017191000的式(I)化合物的具体实例为

更特别地，涉及式2-(2-氯苯基)-N-[4-(4-氰基-1H-吡唑-1-基)-3-氨磺酰苯基]乙酰胺或所述化合物的N-氧化物、盐、水合物、溶剂化物、互变异构体或立体异构体，或所述N-氧化物、互变异构体或立体异构体的盐，纳入本文的WO2017191000第253页的实施例39，用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛。

2-(二甲基氨基)-N-[4-(2-氧代-2,3-二氢-1H-萘并[1,2-e][1,4]二氮杂卓-5-基)苯基]烟酰胺(US20180319752实施例15×2HCl，第0183-0184段纳入本文)

5-[4-(2-碘苯甲酰基氨基)苯基]-1H-萘并[1,2-b][1,4]二氮杂卓-2,4(3H,5H)-二酮(US2018201587实施例48，第0232-0233段纳入本文)

5-[4-[(2-(三氟甲基)苯甲酰基]氨基苯基]-1H-萘并[1,2-b][1,4]二氮杂卓-2,4(3H,5H)-二酮(US2018201587实施例2，第0128-0129段纳入本文)

5-[3-(1H-四唑-5-基)苯基]-1H-萘并[1,2-b][1,4]二氮杂卓-2,4(3H,5H)-二酮(US20130281441实施例1，第0093-0101段纳入本文)

2-(2-氯苯基)-N-[2-(二氟甲基)-4-氨磺酰基-2H-吲唑-6-基]乙酰胺(实施例1–WO2021104486第0824-0827段纳入本文)

2-(2-氯苯基)-N-(4-氨磺酰基-2H-吲唑-6-基)乙酰胺(实施例2–WO2021104486，第0828-0854段纳入本文)

2-(2-氯苯基)-N-(2-甲基-4-氨磺酰基-2H-吲唑-6-基)乙酰胺(实施例3a–WO2021104486，第0855-0868段纳入本文)

2-(2-氯苯基)-N-(1-甲基-4-氨磺酰基-1H-吲唑-6-基)乙酰胺(实施例3b–WO2021104486，第0855-0868段纳入本文)

定义

术语“包含”当在说明书中使用时包括“由......组成”。

如果在本文中将任何项目称为“如本文所述”，则意指它可在本文中的任何地方提及。

在本文中提及的术语具有以下含义：

术语“卤素原子”意指氟、氯、溴或碘原子，特别是氟、氯或溴原子，更特别是氟或氯原子。

在本发明的上下文中，除非另有说明，取代基和残基具有以下含义：

当本文中使用词语化合物、盐、多晶型物、水合物、溶剂化物等的复数形式时，这也被认为意指单一化合物、盐、多晶型物、异构体、水合物、溶剂化物等。

通过“稳定的化合物”或“稳定的结构”意指一种化合物，该化合物足够稳定(robust)，能够从反应混合物中分离到有用的纯度，并配制成有效的治疗剂。

本发明的化合物任选地含有一个或多个不对称中心，这取决于所需的各种取代基的位置和性质。(R)或(S)构型中可能存在一个或多个不对称碳原子，这会产生外消旋混合物。在某些情况下，由于绕特定键(例如，与指定化合物的两个取代芳环相邻的中心键)的旋转受限，也可能存在不对称性。

这些物质的纯化和分离可通过本领域已知的标准技术来完成。

本发明的光学活性化合物同样可通过使用光学活性起始材料的手性合成来获得。

为了彼此区分不同类型的异构体，参考IUPAC Rules Section E(Pure Appl Chem45,11-30,1976)。

本发明还涵盖本发明化合物的有用形式，例如代谢物、水合物、溶剂化物、前药、盐，特别是药学上可接受的盐，和/或共沉淀物。

本发明的化合物可以水合物或溶剂化物的形式存在，其中本发明的化合物含有极性溶剂，特别是例如水、甲醇或乙醇作为化合物晶格的结构元素。极性溶剂，特别是水的量可以化学计量比或非化学计量比存在。在化学计量溶剂化物的情况下，可分别为例如一水合物、半-(hemi-)、(半-(semi-))、单-、倍半-、二-、三-、四-、五-等溶剂化物或水合物。本发明包括所有这些水合物或溶剂化物。

此外，本发明的化合物可以游离形式存在，例如作为游离碱，或作为游离酸，或作为两性离子，或以盐的形式存在。所述盐可为任何盐，有机或无机加成盐，特别是任何药学上可接受的有机或无机加成盐，其通常用于药学，或用于例如分离或纯化本发明的化合物。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的无机酸或有机酸加成盐。例如，参见S.M.Berge,et al.“Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.1977,66,1-19。

本发明化合物的合适的药学上可接受的盐可为例如在链中或环中带有氮原子的本发明化合物的酸加成盐(例如其为足够碱性的)，例如与无机酸或“矿物酸(mineralacid)”，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、双硫酸(bisulfuric acid)、磷酸或硝酸的酸加成盐，或与有机酸，例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟碱酸、双羟萘酸、果胶酸、3-苯基丙酸、新戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、三氟甲磺酸、十二烷基磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、D-葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸或硫氰酸的酸加成盐。

此外，本发明化合物的另一种合适的药学上可接受的盐(其为足够酸性的)是碱金属盐，例如钠盐或钾盐，碱土金属盐，例如钙盐、镁盐或锶盐，或铝盐或锌盐，或衍生自氨或衍生自具有1至20个碳原子的有机伯胺、仲胺或叔胺的铵盐，例如乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲氨基乙醇、二乙氨基乙醇、三(羟甲基)氨基甲烷、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、1,2-乙二胺、N-甲基哌啶、N-甲基-葡糖胺、N,N-二甲基-葡糖胺、N-乙基-葡糖胺、1,6-己二胺、葡萄糖胺、肌氨酸、丝氨醇、2-氨基-1,3-丙二醇、3-氨基-1,2-丙二醇、4-氨基-1,2,3-丁三醇或与具有1至20个碳原子的季铵离子的盐，例如四甲基铵、四乙基铵、四(正丙基)铵、四(正丁基)铵、N-苄基-N,N,N-三甲基铵、胆碱或苯甲烃铵。

本领域技术人员将进一步认识到，要求保护的化合物的酸加成盐可通过多种已知方法中的任一种使化合物与合适的无机酸或有机酸反应来制备。或者，本发明酸性化合物的碱金属盐和碱土金属盐可通过多种已知方法使本发明化合物与合适的碱反应来制备。

本发明包括本发明化合物的所有可能的盐，作为单一盐，或作为所述盐以任何比例的任何混合物。

在本文中，特别是在实验部分，对于中间体和本发明的实施例的合成，当化合物作为与相应的碱或酸的盐形式被提及时，通过相应的制备和/或纯化方法获得的所述盐形式的确切化学计量组成在大多数情况下是未知的。

除非另有说明，与盐有关的化学名称或结构式的后缀，例如“盐酸盐”、“三氟乙酸盐”、“钠盐”或“×HCl”、“×CF

这类似地适用于合成中间体或实施例化合物或其盐已通过所描述的制备和/或纯化方法作为具有(如果定义的)未知化学计量组成的溶剂化物(例如水合物)获得的情况。

此外，本发明包括本发明化合物的所有可能的结晶形式或多晶型物，作为单一多晶型物，或作为多于一种多晶型物以任何比例的混合物。

此外，本发明还包括本发明化合物的前药。本文的术语“前药”是指本身可具有生物活性或无活性，但在它们在体内停留期间被转化(例如代谢或水解)成本发明化合物的化合物。

在第一方面的另一个实施方案中，本发明涵盖上述式(I)的化合物，其中R

根据本发明的另一个实施方案，R

此外，关于本发明的另一种形式，R

在本发明的另一个具体实施方案中，R

本发明的一个具体实施方案是其中R

根据本发明的另一个实施方案，R

在本发明的另一个具体实施方案中，R

此外，关于本发明的另一种形式，R

本发明进一步包括特定的实施方案，其中R

在本发明的另一个具体实施方案中，R

在第一方面的另一个实施方案中，本发明涵盖在标题“本发明的第一方面的其他实施方案”下的两个或更多个上述实施方案的结合物。

本发明涵盖上述通式(I)化合物的本发明的任何实施方案或方面内的任何子结合。

本发明涵盖通式(VII)、(VIII)、(XIII)、(XIV)的中间体化合物的本发明的任何实施方案或方面内的任何子结合。

本发明涵盖用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的通式(I)化合物，其公开于本文下文的实施例部分中，即：

1.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

2.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

3.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-(二氟甲基)苯基]乙酰胺

4.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-(二氟甲基)苯基]乙酰胺

5.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-(二氟甲基)苯基]乙酰胺

6.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-(三氟甲基)苯基]乙酰胺

7.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-(三氟甲基)苯基]乙酰胺

8.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-(三氟甲基)苯基]乙酰胺

9.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-(三氟甲基)苯基]乙酰胺

10.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[4-氰基-3-(三氟甲基)苯基]乙酰胺

11.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[4-氰基-3-(三氟甲基)苯基]乙酰胺

12.N-[4-氰基-3-(三氟甲基)苯基]-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

13.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基苯基)乙酰胺

14.N-(3-氰基苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

15.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基苯基)乙酰胺

16.N-(4-氯-3-氰基苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

17.N-(4-氯-3-氰基苯基)-N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

18.N-(4-氯-3-氰基苯基)-N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

19.N-(4-氯-3-氰基苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

20.N-(4-{2-[2-氯-3-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)-N-(3-氰基-4-氟苯基)乙酰胺

21.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-4-氟苯基)乙酰胺

22.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-4-氟苯基)乙酰胺

23.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-4-氟苯基)乙酰胺

24.N-(3-氰基-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

25.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-苯乙酰胺

26.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-苯乙酰胺

27.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-苯乙酰胺

28.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-苯乙酰胺

29.N-{4-[2-(2,3-二甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

30.N-(4-氟苯基)-N-(4-{2-[2-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

31.N-(4-{2-[4-氯-2-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)-N-(4-氟苯基)乙酰胺

32.N-(4-氟苯基)-N-(4-{2-[3-氟-2-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

33.N-{4-[2-(2-氯-6-氰基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

34.N-{4-[2-(2,6-二甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

35.N-(4-{2-[2-氯-3-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)-N-(4-氟苯基)乙酰胺

36.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

37.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

38.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

39.N-{4-[2-(2,6-二氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

40.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

41.N-{4-[2-(2-氯-4,6-二氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

42.N-(4-氟苯基)-N-(4-{2-[2-(三氟甲氧基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

43.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-甲基苯基)乙酰胺

44.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-甲基苯基)乙酰胺

45.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-甲基苯基)乙酰胺

46.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-甲基苯基)乙酰胺

47.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[4-(二氟甲氧基)苯基]乙酰胺

48.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[4-(二氟甲氧基)苯基]乙酰胺

49.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[4-(二氟甲氧基)苯基]乙酰胺

50.N-(3-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

51.N-(3-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

52.N-(3-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

53.N-(3-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

54.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

55.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

56.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

57.N-{4-[2-(2,6-二氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

58.N-(4-氯-3-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

59.N-(4-氯-3-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

60.N-(4-氯-3-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

61.N-(4-氯-3-氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

62.N-(3,4-二氟苯基)-N-{4-[2-(2,3-二甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

63.N-(3,4-二氟苯基)-N-(4-{2-[2-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

64.N-{4-[2-(2,4-二氯-6-甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

65.N-{4-[2-(2-氯-4,6-二甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

66.N-(3,4-二氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

67.N-{4-[2-(2,4-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

68.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

69.N-{4-[2-(2-氯-4-硝基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

70.N-{4-[2-(2-氯-4-甲氧基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

71.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

72.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

73.N-{4-[2-(2,6-二氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

74.N-{4-[2-(2,6-二氯-4-甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

75.N-{4-[2-(2,6-二氯-4-乙基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

76.N-(3,4-二氟苯基)-N-(4-{2-[2-(三氟甲氧基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

77.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)乙酰胺

78.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)乙酰胺

79.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)乙酰胺

80.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)乙酰胺

81.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-氟-4-(甲磺酰基)苯基]乙酰胺

82.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-氟-4-(甲磺酰基)苯基]乙酰胺

83.N-(3,5-二氟苯基)-N-{4-[2-(2,3-二甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

84.N-(3,5-二氟苯基)-N-(4-{2-[2-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

85.N-(3,5-二氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二甲基苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

86.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

87.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

88.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

89.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

90.N-{4-[2-(2,6-二氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

91.N-(3,5-二氟苯基)-N-(4-{2-[2-(三氟甲氧基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

92.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟-4-甲基苯基)乙酰胺

93.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟-4-甲基苯基)乙酰胺

94.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟-4-甲基苯基)乙酰胺

95.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟-4-甲基苯基)乙酰胺

96.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟-4-甲氧基苯基)乙酰胺

97.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟-4-甲氧基苯基)乙酰胺

98.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟-4-甲氧基苯基)乙酰胺

99.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,5-二氟-4-甲氧基苯基)乙酰胺

100.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-甲氧基苯基)乙酰胺

101.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-甲氧基苯基)乙酰胺

102.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酰胺

103.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟-3-甲氧基苯基)乙酰胺

104.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟-3-甲氧基苯基)乙酰胺

105.N-(2-氯苯基)-N-(4-{2-[2-氯-3-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

106.N-(2-氯苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

107.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2-氯苯基)乙酰胺

108.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2-氯苯基)乙酰胺

109.N-(2-氯苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

110.N-(2-氯-5-氟苯基)-N-(4-{2-[2-氯-3-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)乙酰胺

111.N-(2-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

112.N-(2-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

113.N-(2-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

114.N-(2-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

115.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2-氟苯基)乙酰胺

116.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2-氟苯基)乙酰胺

117.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2-氟苯基)乙酰胺

118.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2-氟苯基)乙酰胺

119.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]乙酰胺

120.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[2-氟-4-(三氟甲基)苯基]乙酰胺

121.N-(4-{2-[2-氯-3-(三氟甲基)苯基]乙酰氨基}吡啶-2-基)-N-(2,3-二氟苯基)乙酰胺

122.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,3-二氟苯基)乙酰胺

123.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,3-二氟苯基)乙酰胺

124.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,3-二氟苯基)乙酰胺

125.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,3-二氟苯基)乙酰胺

126.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二氟苯基)乙酰胺

127.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二氟苯基)乙酰胺

128.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二氟苯基)乙酰胺

129.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二氟苯基)乙酰胺

130.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二氟苯基)乙酰胺

131.N-(3-氯苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

132.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氯苯基)乙酰胺

133.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氯苯基)乙酰胺

134.N-(3-氯苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

135.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氯苯基)乙酰胺

136.N-(3-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

137.N-(3-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

138.N-(3-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

139.N-(3-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

140.N-(3-氯-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

141.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)丁酰胺

142.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)丁酰胺

143.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)丁酰胺

144.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)丁酰胺

145.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-5-氟苯基)乙酰胺

146.N-(3-氰基-5-氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

147.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-5-氟苯基)乙酰胺

148.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-5-氟苯基)乙酰胺

149.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-5-氟苯基)乙酰胺

150.N-(2-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

151.N-(2-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

152.N-(2-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

153.N-(2-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

154.N-(2-氯-4-氟苯基)-N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

155.N-[3-氯-4-(甲基磺酰基)苯基]-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

156.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-氯-4-(甲基磺酰基)苯基]乙酰胺

157.N-[3-氯-4-(甲基磺酰基)苯基]-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

158.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-氯-4-(甲基磺酰基)苯基]乙酰胺

159.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[3-氯-4-(甲基磺酰基)苯基]乙酰胺

160.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-5-甲氧基苯基)乙酰胺

161.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-5-甲氧基苯基)乙酰胺

162.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-5-甲氧基苯基)乙酰胺

163.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-5-甲氧基苯基)乙酰胺

164.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氟-5-甲氧基苯基)乙酰胺

165.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[2-(二氟甲基)苯基]乙酰胺

166.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[2-(二氟甲基)苯基]乙酰胺

167.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[2-(二氟甲基)苯基]乙酰胺

168.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[2-(二氟甲基)苯基]乙酰胺

169.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-[2-(二氟甲基)苯基]乙酰胺

170.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺

171.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺

172.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺

173.N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺

174.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(2,4-二甲基苯基)乙酰胺

175.N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-5-甲基苯基)乙酰胺

176.N-(3-氰基-5-甲基苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

177.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-5-甲基苯基)乙酰胺

178.N-{4-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-5-甲基苯基)乙酰胺

179.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氰基-5-甲基苯基)乙酰胺

180.N-(3-氯-4-甲基苯基)-N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

181.N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氯-4-甲基苯基)乙酰胺

182.N-(3-氯-4-甲基苯基)-N-{4-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}乙酰胺

183.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3-氯-4-甲基苯基)乙酰胺

184.N-{4-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟-2,3-二甲基苯基)乙酰胺

185.N-{5-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-苯乙酰胺

186.N-{5-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-苯乙酰胺

187.N-{5-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-苯乙酰胺

188.N-{5-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-苯乙酰胺

189.N-{5-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

190.N-{5-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

191.N-{5-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

192.N-{5-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

193.N-{5-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

194.N-{5-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

195.N-{5-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

196.N-{5-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

197.N-{5-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

198.N-{5-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3-氟苯基)乙酰胺

199.N-{5-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

200.N-{5-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

201.N-{5-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

202.N-{5-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

203.N-{5-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

204.N-{5-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

205.N-{5-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

206.N-{5-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

207.N-{5-[2-(2-氯-4-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

208.N-{5-[2-(2-氯-6-氟苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-(3,5-二氟苯基)乙酰胺

通式(I)的化合物可根据以下方案1、2和3制备。下文描述的方案和方法说明了通式(I)的化合物的合成途径且并非旨在限制。本领域技术人员清楚的是，如方案1、2和3中示例的转化顺序可以各种方式修改。因此，这些方案中示例的转化顺序并非旨在限制。此外，任何取代基R

方案1描述了从式(II)的芳族胺和式(III)的合成子开始的合成，其中Hal代表Cl、Br、I或三氟甲磺酸酯，优选Br；其中A代表CH。两种起始材料可通过本领域技术人员已知的Pd介导的反应(Buchwald-Hartwig-偶联)交叉偶联。使用合适的溶剂，例如N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二噁烷或甲苯，并加入碱，例如碳酸钾、磷酸钾、碳酸铯或叔丁醇钾。合适的钯催化剂与合适的膦配体结合被用作催化剂催化剂-配体体系，例如双(二亚苄基丙酮)钯(0)和4,5-双-(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos)。反应在80℃和120℃之间、优选在100℃的温度下进行，直至完全转化，通常持续18小时。通式(IV)的芳族胺可根据标准方法与羧酸酐(V)或相应的乙酰氯(VI)反应，以生成通式(VII)的酰胺。在使用酸酐(V)例如乙酸酐的情况下，它也可用作溶剂。N,N-二甲基氨基吡啶可用作催化剂(0.1当量)。反应通常发生在100℃和130℃之间发生，直到完全转化(2-18小时)。在使用酰氯例如乙酰氯的情况下，可使用二氯甲烷作为溶剂并加入碱例如三乙胺。通式(VII)化合物中的硝基通过本领域技术人员已知的方法还原成通式(VIII)化合物的相应氨基，例如通过在合适的催化剂如钯或铂(例如活性炭负载10％ Pd)的存在下氢化。优选地，使用大气氢气压力。使用合适的溶剂如乙醇、甲醇或乙酸乙酯(其为优选)。或者，使用其他还原方法，最特别的是在乙酸中用铁粉(5当量)还原。剧烈搅拌混合物直至完全转化(2-18小时)。通式(VIII)的芳族胺可通过本领域技术人员已知的方法与通式(IX)的羧酸反应，以得到通式(I)的酰胺化合物。该反应是通过用试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、N-羟基苯并三唑(HOBT)、N-[(二甲基氨基)-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)亚甲基]-N-甲基甲胺六氟磷酸盐(HATU)或丙基磷酸酐(T3P)活化通式(IX)的羧酸介导的。例如，与HATU或T3P的反应在惰性溶剂如N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或二甲亚砜中在适当的通式(VIII)芳族胺和叔胺(如三乙胺或二异丙基乙胺)的存在下在-30℃和+80℃之间的温度下发生。

方案1(A＝CH)

其中A为CH且R

作为替代，方案1中所述的第一步也可使用通式(X)的芳族卤化物和通式(XI)的合成子进行(方案2)。

方案2(A为CH)

其中A为CH且R

合成步骤的顺序可适当改变。

例如，在A＝N的情况下，该步骤如方案3中概述的那样进行。化合物(XII)用作起始材料。首先，使用(IX)型的羧酸进行酰胺偶联，然后进行Pd催化的与通式(II)的芳族胺的交叉偶联，以及与(VI)型的酰氯的酰化。

方案3-(A为N)

其中A为N且R

化合物(II)、(III)、(V)、(VI)、(IX)、(X)和(XI)为市售的，或者可根据如本领域技术人员理解的公知领域可得的方法制备。具体实例在实验部分中描述。

方案3A中描绘了合成通式(I)的化合物的替代方法。

方案3A-(A为CH)

该合成从式(II)的芳族胺和式(XII)的合成子开始，其中Hal代表Cl、Br、I或三氟甲磺酸酯，优选Cl；其中A代表CH。可通过在盐酸(1当量)的存在下，在更高沸点的溶剂中，优选在环丁砜中加热(60℃-130℃，10-20小时，通常130℃，持续18小时)来偶联两种起始材料。或者，也可通过本领域技术人员已知的通过Pd介导的反应进行交叉偶联(Buchwald-Hartwig-偶联)。

通式(XV)的芳族胺可通过本领域技术人员已知的方法与通式(IX)的羧酸反应，得到通式(XIV)的酰胺化合物。特别地，偶联可通过在优选N,N-二甲基乙酰胺作为溶剂中用1,1'-羰基二咪唑(1.0-1.5当量)活化来进行。反应混合物通常在室温和80℃之间的温度(通常为40℃)下搅拌10小时至24小时(通常为18小时)。

通式(XIV)的芳族胺可根据标准方法与羧酸酐(V)或相应的酰氯(VI)反应生成通式(I)的酰胺。在使用酸酐(V)例如乙酸酐的情况下，它也可用作溶剂。N,N-二甲基氨基吡啶可用作催化剂(0.1当量)。反应通常发生在100℃和130℃之间，直到完全转化(2-18小时)。在使用酰氯例如乙酰氯的情况下，可使用二氯甲烷或更优选外消旋-2-甲基四氢呋喃作为溶剂。加入碱，例如三乙胺或N,N-二异丙基乙胺(1-2当量，通常为1.4当量)。转化通常在室温下在1至24小时、通常在18小时内发生。

通式(I)的化合物可通过本领域技术人员已知的任何方法转化为本文所述的任何盐，更特别地是药学上可接受的盐。类似地，本发明通式(I)化合物的任何盐可通过本领域技术人员已知的任何方法转化为游离化合物。

根据本发明，将P2X4抑制剂用于制造用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的药物。

本发明的化合物用于制造用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的药物。

本发明的通式(I)的化合物展示了不可预测的有价值的药理学作用谱。出人意料地，已发现本发明的化合物作为拮抗剂或负变构调节剂可有效抑制P2X4，因此，所述化合物可用于治疗或预防疾病，特别是用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛。

本发明的化合物可用于抑制、拮抗、负变构调节等用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛的P2X4受体。该方法包括向需要其的哺乳动物(包括人)给药一定量的本发明化合物或其药学上可接受的盐、异构体、多晶型物、代谢物、水合物、溶剂化物或酯；这对治疗这种疾病是有效的。

这些病症已在人类中得到很好的表征，而且在其他哺乳动物中也存在类似的病因，并且可通过给药本发明的药物组合物来治疗。

如本文中使用的术语“治疗(treating或treatment)”按惯例使用，例如，为了对抗、缓解、减少、减轻、改善疾病或病症的状况的目的而对受试者进行管理或护理，例如上述那些。

本发明的化合物可用于以下综合征、疾病或病症的疗法和防范，即预防：

-眼科适应症，干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛。

根据另一方面，本发明涵盖如上所述的通式(I)的化合物或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物和盐，特别是其药学上可接受的盐，或其混合物，其用于治疗或预防疾病，特别是上述疾病。

本发明化合物的药物活性可通过它们作为抑制剂拮抗和/或负变构调节眼中P2X4受体的活性来解释。

根据另一方面，本发明涵盖如上所述的通式(I)化合物或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物和盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物用于治疗或预防疾病，特别是上述疾病的用途。

根据另一方面，本发明涵盖如上所述的通式(I)化合物或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物和盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物，在治疗或预防疾病，特别是上述疾病的方法中的用途。

根据另一方面，本发明涵盖如上所述的通式(I)化合物或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物和盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物用于制备用于预防或治疗疾病，特别是上述疾病的药物组合物，优选药物的用途。

根据另一方面，本发明涵盖使用有效量的如上所述的通式(I)化合物或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物和盐，特别是其药学上可接受的盐，或它们的混合物治疗或预防疾病，特别是上述疾病的方法。

根据另一方面，本发明涵盖包含如上所述的通式(I)化合物，或其立体异构体、互变异构体、N-氧化物、水合物、溶剂化物、盐(特别是药学上可接受的盐)，或它们的混合物，和一种或多种赋形剂，特别是一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，特别是药物，其用于治疗或预防干眼综合征，特别是干眼、眼部神经性疼痛、眼部外伤和术后眼部疼痛。可使用用于制备呈适当剂型的此类药物组合物的常规方法。

本发明还涵盖药物组合物，特别是药物，其包含至少一种本发明的化合物，通常连同一种或多种药学上合适的赋形剂，以及它们用于上述目的的用途。

本发明的化合物可具有全身和/或局部活性。为此目的，它们可以合适的方式给药，例如眼部途径、结膜，或作为植入物或眼部装置。

对于这些给药途径，本发明的化合物可以合适的给药形式给药。

适用于眼部给药途径的实例是药物剂型，如滴眼剂、眼膏剂、洗眼液(eye bath)、眼部嵌入剂(ocular inserts)或缓释制剂(例如，可注射的微球或纳米球)、溶液剂、水性混悬液(洗剂、振荡混合剂(mixturae agitandae))、亲脂性混悬剂、乳剂、软膏剂、霜剂。

可将本发明的化合物掺入所述的给药形式中。这可以本身已知的方式通过与药学上合适的赋形剂混合来实现。

本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种本发明的化合物，通常连同一种或多种药学上合适的赋形剂，并涉及它们根据本发明的用途。

本发明的化合物可作为单独的药剂或与一种或多种其他药物活性成分结合给药，其中所述结合不会引起不可接受的副作用。本发明还涵盖此类药物结合物。

基于已知的用于评估可用于治疗和防范(prevention)(即预防(prophylaxis))上述综合征、疾病或病症的化合物的标准实验室技术，通过标准毒性检验以及通过用于确定对哺乳动物中上述病况的治疗的标准药理学试验，并通过将这些结果与用于治疗这些病症的已知活性成分或药物的结果进行比较，可以容易地确定本发明化合物用于治疗每种所期望的适应症的有效剂量。在治疗这些病症之一中所给药的活性成分的量可根据如下考虑因素而相差很大，如使用的具体化合物和剂量单位、给药方式、治疗周期、所治疗患者的年龄和性别以及所治疗疾病的性质和程度。

通过注射如眼内注射和使用输注技术给药的平均日剂量优选为0.01至200mg/kg总体重。平均每日局部剂量方案优选为每天给药0.1至200mg一至四次。经角膜或经巩膜的浓度优选为维持0.01至200mg/kg的日剂量所需的浓度。

当然，每个患者的具体初始和后续给药方案将根据主治诊断医生确定的病症的性质和严重程度、所用特定化合物的活性、患者的年龄和一般状况、给药时间、给药途径、药物排泄速率、药物结合物等而不同。本发明化合物或其药学上可接受的盐或酯或组合物的所需治疗方式和给药次数可由本领域技术人员使用常规治疗试验确定。

具体实施方式

NMR峰的形式是按照它们在光谱中出现的形式说明的，未考虑可能的更高阶效应。化学位移以ppm为单位给出；所有光谱都校准到溶剂残留峰。积分以整数给出。

或者，所选化合物的

尖锐信号的强度与打印的NMR谱中信号的高度(以cm为单位)相关。当与其他信号相比时，该数据可与信号强度的实际比率相关。在宽信号的情况下，显示多于一个峰或信号中心及它们与光谱中显示的最强信号相比的相对强度。

化学名称是使用ACD/Labs的ACD/Name软件生成的。在某些情况下，使用市售试剂的普遍接受的名称代替ACD/Name生成的名称。

下表1列出了本段和实施例部分中使用的缩写，只要它们未在正文中进行解释。其他缩写具有对技术人员而言其本身惯用的含义。

表1：缩写

下表列出了本文中使用的缩写。

其他缩写具有对技术人员而言其本身惯用的含义。

本申请中描述的本发明的各个方面通过以下实施例进行说明，这些实施例并不意味着以任何方式限制本发明。

本文中描述的实施例测试实验用于说明本发明并且本发明不限于给出的实施例。

所有未在实验部分描述其合成的试剂均为市售的，或为已知化合物或者可由本领域技术人员通过已知的方法由已知化合物形成。

根据本发明的方法制备的化合物和中间体可能需要纯化。有机化合物的纯化是本领域技术人员所公知的，并且可能存在多种纯化相同化合物的方法。在某些情况下，可以不需要纯化。在一些情况下，化合物可通过结晶来纯化。在一些情况下，可使用合适的溶剂将杂质搅拌出来。在一些情况下，化合物可通过色谱法纯化，特别是快速柱色谱法，使用例如预装填硅胶柱(cartidge)，例如Biotage SNAP柱

在一些情况下，如上所述的纯化方法可提供呈盐形式的那些具有足够碱性或酸性官能度的本发明的那些化合物，例如，在足够碱性的本发明化合物的情况下，例如三氟乙酸盐或甲酸盐，或者，在足够酸性的本发明化合物的情况下，例如铵盐。这种类型的盐可通过本领域技术人员已知的各种方法分别转化为其游离碱或游离酸形式，或作为盐用于随后的生物学测定中。应当理解，如分离的和如本文所述的本发明化合物的特定形式(例如盐、游离碱等)不必是唯一形式，其中所述化合物可用于生物学测定以量化特定的生物活性。

UPLC-MS标准方法

如下所述进行分析性UPLC-MS。除非指定负模式(ESI-)，否则从正模式电喷雾电离报告质量(m/z)。在大多数情况下，使用方法1。如果没有使用，则表明。

方法1：

仪器：Waters Acquity UPLCMS SingleQuad；色谱柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；洗脱液A：水+0.2体积％氨水(32％)，洗脱液B：乙腈；梯度：0-1.6min 1-99％B，1.6-2.0min 99％B；流量0.8ml/min；温度：60℃；DAD扫描：210-400nm。

方法2：

仪器：Waters Acquity UPLCMS SingleQuad；色谱柱：Acquity UPLC BEH C18 1.7μm，50×2.1mm；洗脱液A：水+0.1体积％甲酸(99％)，洗脱液B：乙腈；梯度：0-1.6min 1-99％B，1.6-2.0min 99％B；流量0.8ml/min；温度：60℃；DAD扫描：210-400nm。

方法3：

仪器：Waters Acquity Platform ZQ4000；色谱柱：Waters BEHC 18,50mm×2.1mm，1.7μ；洗脱液A：水/0.05％甲酸，洗脱液B：乙腈/0.05％甲酸；梯度：0.0分钟98％A→0.2分钟：98％A→1.7分钟：10％A→1.9分钟：10％A→2分钟：98％A→2.5分钟：98％A；流量：1.3ml/min；柱温：60℃；UV检测：200-400nm。

实验部分-通用方法

通用方法A：

从芳族酰胺和2-溴-4-硝基吡啶形成双芳基胺(GP A)：

将芳族胺(1.0当量)和2-溴-4-硝基吡啶(1.4当量)溶解在甲苯或1,4-二噁烷或DMF(约70当量)中。在惰性气氛(氩气)下，加入双(二亚苄基丙酮)钯(0)(CAS[32005-36-0],0.03当量)、4,5-双-(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos，CAS[161265-03-8],0.07当量)和碳酸铯(1.6当量)，并将混合物在100℃下搅拌约18小时。冷却至室温后，通过硅藻土滤出催化剂并用乙酸乙酯冲洗。将滤液在水和乙酸乙酯之间分配并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并真空除去溶剂。将粗产物通过色谱法纯化。

通用方法B：

从芳基卤化物和2-氨基-4-硝基-吡啶形成双芳基胺(GP B)：

将芳族溴化物(1.0-1.4当量，或者，可使用相应的碘化物)、4-硝基吡啶-2-胺(1.0当量)和碳酸铯(1.6当量)溶解在1,4-二噁烷或甲苯中。将混合物脱气，并在氩气气氛下，加入双(二亚苄基丙酮)钯(0)(CAS[32005-36-0],0.03当量)和4,5-双-(二苯基膦基)-9,9-二甲基氧杂蒽(Xantphos,CAS[161265-03-8],0.07当量)。将混合物在100℃下搅拌18小时。冷却至室温后，滤出固体并用乙酸乙酯冲洗。将滤液在水和乙酸乙酯之间分配并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并真空除去溶剂。将粗产物通过色谱法纯化。

通用方法C：

双芳基胺的酰化(GP C)：

将双芳基胺溶解在作为试剂和溶剂的乙酸酐(或各自相应的同系物)(约50当量)中，加入4-N,N-二甲基氨基吡啶(0.1当量)并将混合物在110-130℃下搅拌直至完全转化(2-18小时)。冷却至室温后，将混合物真空浓缩至干并直接通过色谱法纯化或进行水性处理。在这种情况下，将混合物在乙酸乙酯和水之间分配，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并真空除去溶剂。将粗产物通过色谱法纯化。

通用方法D：

通过催化氢化还原硝基化合物(GP D)：

将硝基化合物溶解在乙酸乙酯中并加入钯催化剂(活性炭负载10％Pd，0.1当量Pd)。将混合物脱气并充入氢气并在1atm氢气压力下氢化直至完全转化。然后滤出催化剂并将滤液浓缩至干。可获得产物无需进一步纯化。

通用方法E：

用铁还原硝基化合物(GP E)：

将硝基化合物溶解在乙酸中并加入铁粉(5当量)。将混合物剧烈搅拌2-18小时，直至完全转化。通过硅藻土垫滤出固体并用乙酸乙酯冲洗。将有机相蒸发至干。任选地，将残余物与甲苯共蒸馏数次直至除去所有乙酸，或将其在乙酸乙酯和水之间分配并加入饱和碳酸氢钠水溶液直至pH>7。分离各相，将水层用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤并用硫酸钠干燥。真空除去溶剂，产物未经进一步纯化即用于下一步骤。

通用方法F：

氨基-哒嗪的酰化(GP F)：

将6-氯-4-氨基哒嗪和羧酸(1-2当量)溶解在DMF中并加入T3P(1-丙烷次膦酸酐(propanephosphinic anhydride)，50％于DMF中，CAS[68957-94-8]，4.8当量)和N,N-二异丙基乙胺(6当量)并将混合物在80℃下搅拌直至完全转化。然后将混合物蒸发至小体积，倒入水中并滤出。然后将固体原样或如果需要将其通过HPLC纯化用于下一步骤。

通用方法G：

氯哒嗪的芳族亲核取代(GP G)：

将N-酰化(6-氯哒嗪-4-基)乙酰胺溶解在乙醇中并加入苯胺衍生物(1当量)。任选地，可加入4-甲基苯磺酸水合物(1当量)以提高转化率。然后将混合物在80℃下搅拌48小时并蒸发。将残余物通过HPLC纯化。

通用方法H：

利用HATU形成酰胺(GP H)：

将胺和羧酸(1.2当量)溶解在DMF中并加入HATU(2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐，CAS[148893-10-1]，1.2当量)和三乙胺(5当量)，将混合物在室温下搅拌直至完全转化。然后将混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并将溶剂蒸发。将粗产物通过色谱法纯化。

通用方法I：

利用T3P形成酰胺(GP I)：

将胺和羧酸(1-2当量)溶解在DMF中，加入T3P(1-丙烷次膦酸酐，50％于DMF中，CAS[68957-94-8]，3当量)和三乙胺(6当量)并将混合物在室温下搅拌直至完全转化。然后将混合物倒入水中，用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并将溶剂蒸发。将粗产物通过色谱法纯化。

通用方法J：

乙酰化氨基吡嗪(GP J)：

将氨基吡嗪溶解在二氯甲烷中并加入乙缩醛氯化物(1.5当量)和三乙胺(1.8当量)并将混合物在室温下搅拌18小时。将混合物真空浓缩并直接通过色谱法纯化。

实验部分-中间体

中间体1：

N-(3,4-二氟苯基)-4-硝基吡啶-2-胺

根据GP A，将甲苯(25mL)中的3,4-二氟苯胺(454mg，3.52mmol)和2-溴-4-硝基吡啶(1.00g，4.93mmol，1.4当量)转化为658mg为黄色固体形式的标题化合物(理论值的74％)。

LCMS(方法1)：Rt＝1.24分钟，MS(ESIpos)m/z＝252[M+H]

中间体2：

N-(3-氟苯基)-4-硝基吡啶-2-胺

根据GP B，将甲苯(75mL)中的4-硝基吡啶-2-胺(2.00g，14.4mmol)和1-溴-3-氟苯(3.52g，20.1mmol，1.4当量)转化为810mg为微红色固体形式的标题化合物(理论值的20％)。

LCMS(方法3)：Rt＝1.13分钟，MS(ESIpos)m/z＝234[M+H]

表1-中间体3-38：

中间体39：

N-(3,4-二氟苯基)-N-(4-硝基吡啶-2-基)乙酰胺

根据GP C，将655mg(2.61mmol)N-(3,4-二氟苯基)-4-硝基吡啶-2-胺(中间体1)溶解在13mL乙酸酐中，加入DMAP(0.1当量，32mg，0.26mmol)并将混合物在100℃下搅拌18小时。冷却至室温后，将反应混合物在乙酸乙酯和水之间分配，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并真空除去溶剂。将粗产物通过色谱法纯化，得到765mg(理论值的93％)标题化合物。

LCMS(方法1)：Rt＝1.08分钟，MS(ESIpos)m/z＝294[M+H]

表2-中间体40-77：

表3-中间体78：

中间体79：

N-(4-氨基吡啶-2-基)-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

根据GP D，将N-(3,4-二氟苯基)-N-(4-硝基吡啶-2-基)乙酰胺(中间体39，745mg，2.54mmol)溶解在乙酸乙酯(15mL)中，加入钯催化剂(活性炭负载10％ Pd，270mg，0.1当量)并将混合物在室温下氢化(1atm氢气)3小时。将催化剂滤出并将溶剂蒸发至干，得到669mg(理论值的94％)标题化合物。

LCMS(方法1)：Rt＝0.78分钟，MS(ESIpos)m/z＝264[M+H]

中间体80：

N-(4-氨基吡啶-2-基)-N-(4-氟苯基)乙酰胺

根据GP E，将N-(4-氟苯基)-N-(4-硝基吡啶-2-基)乙酰胺(中间体47，1.70g，6.18mmol)溶解在乙酸(70mL)中并分批加入铁粉(5当量，1.72g，30.9mmol)。将混合物在室温下剧烈搅拌2小时。然后通过硅藻土垫滤出固体，用乙酸乙酯冲洗，并真空浓缩滤液。产物未经进一步纯化即用于下一步骤。

LCMS(方法2)：Rt＝0.58分钟，MS(ESIpos)m/z＝246[M+H]

表4-中间体81-116：

表5-中间体117：

中间体118-具有哒嗪核心的中间体：

N-(6-氯哒嗪-4-基)-2-(2,6-二氯苯基)乙酰胺

根据GP F，将6-氯-4-氨基哒嗪(500mg，3.86mmol)和2,6-二氯苯基乙酸(1.8g，1.5当量)溶解在DMF(10mL)中并加入T3P(11ml，18.5mmol，4.8当量)和二异丙基乙胺(4ml，23mmol，6当量)。将混合物在80℃下搅拌18小时，然后将其蒸发至小体积，倒入水中并滤出，得到为固体形式的标题化合物。

LCMS(方法1)：Rt＝1.01分钟，MS(ESIpos)m/z＝314[M-H]

表6-中间体119-122：

中间体123：

N-(6-苯胺基哒嗪-4-基)-2-(2,6-二氯苯基)乙酰胺

根据GP G，将N-(6-氯哒嗪-4-基)-2-(2,6-二氯苯基)乙酰胺(100mg，0.31mmol)溶解在3ml乙醇中，加入苯胺(29μl，0.31mmo)并将混合物在80℃下搅拌48小时。然后将混合物蒸发并通过HPLC纯化。产生75mg(63％)的标题化合物。

LCMS(方法1)：Rt＝1.10分钟，MS(ESIpos)m/z＝373[M+H]

表7-中间体124-146：

中间体147：

将110mL(1.5当量，1.2mol)4-氟苯胺溶解在500mL环丁砜中。加入24mL(1.0当量，780mmol)浓缩的HCl水溶液并将悬浮液加热至60℃。分批加入100g(1.0当量，778mmol)2-氯吡啶-4-胺(1.0当量，778mmol)。将反应溶液在130℃下搅拌18小时。将仍然温热的反应混合物用水稀释，并使用半浓缩的NaOH水溶液将pH值调节至pH＝10-11。将混合物倒入4000mL水中并剧烈搅拌2小时。滤出沉淀物并将其用水强烈洗涤。将固体物质在50℃下真空干燥。获得为淡紫色固体形式的159g标题化合物(理论值的63％)。

LCMS(方法1)：R

中间体148：

2-(2-氯-3-氟苯基)-N-[2-(4-氟苯胺基)吡啶-4-基]乙酰胺

将115g(1.15当量，610mmol)2-(2-氯-3-氟苯基)乙酸溶解在700mL N,N-二甲基乙酰胺中并在室温下分批加入103g(1.2当量，636mmol)1,1'-羰基二咪唑。将反应混合物加热至40℃保持4小时。分批加入108g(1.0当量，530mmol)N

LCMS(方法1)：R

实验部分-实施例

实施例1：

N-{4-[2-(2-氯苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺

根据GP H，将N-(4-氨基吡啶-2-基)-N-(3,4-二氟苯基)乙酰胺(中间体79，70mg，0.27mmol)和2-氯苯乙酸(54mg，1.2当量)溶解在DMF(2mL)中，加入HATU(121mg,0.32mmol,1.2当量)和三乙胺(135mg,1.33mmol,5当量)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后将其倒入水中，用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并将溶剂蒸发。将粗产物通过快速色谱法纯化，得到30mg(理论值的24％)为淡黄色泡沫形式的标题化合物。

LC-MS(方法1)：R

实施例2：

N-{4-[2-(2-氯-3-氟苯基)乙酰氨基]吡啶-2-基}-N-(4-氟苯基)乙酰胺

根据GP I，将N-(4-氨基吡啶-2-基)-N-(4-氟苯基)乙酰胺(中间体80，200mg,0.82mmol)和2-(2-氯-3-氟苯基)乙酸(154mg，1当量)溶解在DMF(10mL)中，加入T3P(778mg，2.45mmol，3当量)和三乙胺(495mg，4.89mmol，6当量)。将混合物在室温下搅拌18小时，然后将其倒入水中，用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并将溶剂蒸发。将粗产物通过制备型HPLC纯化，得到191mg(理论值的56％)为淡黄色固体形式的标题化合物。在替代方法中，将250g(1当量，669mmol)2-(2-氯-3-氟苯基)-N-[2-(4-氟苯胺基)吡啶-4-基]乙酰胺(中间体148)和160mL(1.4当量，940mmol)N,N-二异丙基乙胺溶解在2000mL外消旋-2-甲基四氢呋喃中。在室温下逐滴加入71mL(1.5当量，1.0mol)乙酰氯并将反应混合物在室温下搅拌18小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并通过加入水进行淬灭。将有机相用饱和NaHCO

LC-MS(方法1)：R

表8-实施例3-184：

实施例185(具有哒嗪核心的实施例)：

N-{5-[2-(2,6-二氯苯基)乙酰氨基]哒嗪-3-基}-N-苯乙酰胺

根据GP J，将N-(6-苯胺基哒嗪-4-基)-2-(2,6-二氯苯基)乙酰胺(中间体123，56mg，0.15mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)中，加入乙酰氯(18mg，0.22mmol，1.5当量)和三乙胺(27mg，0.27，1.8当量)。将混合物在室温下搅拌18小时，然后真空浓缩并通过制备型HPLC纯化，得到45mg(理论值的73％)标题化合物。

LC-MS(方法1)：Rt＝1.10分钟；MS(ESIpos):m/z＝415[M+H]

表9-实施例186-208：

实验部分-生物测定

将实施例在选定的生物学测定中测试一次或多次。当测试多于一次时，数据报告为平均值或中值，其中

·平均值，也称为算术平均值，代表所得值的总和除以测试次数，和

·中值代表按升序或降序排列时值组的中间数。如果数据集中的值的数量是奇数，则中值是中间值。如果数据集中的值的数量是偶数，则中值是中间两个值的算术平均值。

将实施例合成一次或多次。当合成多于一次时，来自生物学测定的数据代表利用从一个或多个合成批次的测试中获得的数据集计算的平均值或中值。

体外研究

本发明化合物的体外活性可在以下测定中证明：

人P2X4 HEK细胞FLIPR测定

将化合物在稳定表达人P2X4的HEK293细胞系上进行测试。将细胞以15,000细胞/孔的密度在涂有聚-D-赖氨酸的384孔板上培养，并在37℃、5％ CO

在加入Bz-ATP之前和之后，分别在470-495nm和515-575nm的激发波长和发射波长下记录反映细胞内钙变化的荧光强度。

将化合物一式三份进行测试，将荧光强度原始数据与激动剂对照进行归一化处理，并拟合为四参数的逻辑方程式：

Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((LogIC50-X)*希尔斜率(HillSlope)))

将激动剂BzATP的饱和浓度(3μM)的功效设置为最大响应(100％Emax)并将底部定义为由0.5％ DMSO得到的信号。

测定板接受(acceptance)是基于信号窗(S/B)≥1.8，Z’≥0.5和±3σ内的参考化合物pIC50，化合物的历史pIC50的平均值。未能满足三个标准中的两个标准，则确定排除该板的结果。

用于大鼠P2X4 1321N1星形细胞瘤细胞的FLIPR方法

将化合物在稳定表达大鼠P2X4的1321N1细胞系上测试。将细胞以10,000细胞/孔的密度在涂有胶原-I的384孔板上培养，并在37℃、5％ CO

在加入MgATP之前和之后，分别在470-495nm和515-575nm的激发波长和发射波长下记录反映细胞内钙变化的荧光强度。

将化合物一式三份进行测试，将荧光强度原始数据与激动剂对照进行归一化处理，并拟合为四参数逻辑方程式：

Y＝底部+(顶部-底部)/(1+10^((LogIC50-X)*希尔斜率))

将激动剂MgATP的饱和浓度(5μM)的功效设置为最大响应(100％Emax)并将底部定义为由0.5％ DMSO得到的信号。

测定板的验收是基于信号窗(S/B)≥1.5，Z’≥0.5和±3σ内的参考化合物pIC50，化合物的历史pIC50的平均值。未能满足三个标准中的两个标准，则确定排除该板的结果。

在下面的表10中记载了测定的结果

表10

P2X4受体在人角膜组织中的表达

人角膜是通过角膜银行SightLife(Seattle,WA)获得的，并在嵌入OCT之前在10％天然缓冲福尔马林(Millipore,Germany)中在4℃下固定4小时。角膜组织用第一抗体：1:100P2X4(Abcam ab134559)在4℃下印迹18小时，用第二抗体1:500Alexa Fluror555(Molecular Probe A21432)在室温下印迹2小时。

图像通过LSM700荧光显微镜(Zeiss)获得。

检查了P2X4受体的角膜组织表达。对来自三个供体的角膜组织进行处理和染色以进行P2X4受体定位。在所有三个样本中，P2X4受体表达见于角膜的中央和周边区域以及连接结膜和角膜组织层的角膜缘边界区。仅用第二抗体染色的组织中未见标记。

体内研究

读出疼痛行为的泪腺切除模型

材料与方法：

动物模型：

将Sprague Dawley大鼠通过腹膜内注射75mg/kg氯胺酮+7.5mg/kg盐酸甲苯噻嗪进行麻醉。去除面部毛发后，在颞盖边缘和颧弓之间小心地做一个2mm的切口。钝性分离下层组织，暴露覆盖眶内泪腺的筋膜，避开神经和血管。在筋膜上做一个小切口，轻轻拉出眶内腺体并切除。用8-0polysorb缝合线缝合切口，并用5-0polysorb缝合线(Ethilon；Ethicon Inc，Somerville,NJ)闭合皮肤。在耳垂正下方做一个3mm的切口，将眶外泪腺拉出并沿其主干切除。该切口以与上述类似的方式闭合。

擦拭测试：

使大鼠在安静、干净、透明的笼子中适应15分钟。轻轻握住大鼠头部，在大鼠右眼中加入1滴5M NaCl，并开始计数擦拭(前肢擦过面部)，持续30秒。在左眼重复擦拭测试。用10ml NS清洗每只眼睛。

擦拭眼睛的频率被用作评估动物疼痛水平的行为终点，以评估与单独的赋形剂(vehicle)相比用化合物治疗后疼痛改善的水平。确定每只动物在三十秒内擦拭眼睛的次数，并在不同的时间点取平均值。在泪腺切除之前建立基线擦拭次数。泪腺切除后两周，在治疗开始前再次对擦拭行为进行第二次计数。在治疗两周和四周后进行额外的擦拭行为计数。在泪腺切除后和治疗开始前的两周内，在所有动物中观察到擦拭率增加。虽然在单独用赋形剂治疗的动物中观察到擦拭计数增加，但在用化合物治疗的动物中未观察到擦拭计数明显进一步增加。

(图1-用P2X4拮抗剂治疗，实施例2)。

神经密度测量：

-SNP测量：

对于每只术后4周的大鼠，通过IVCM(体内共聚焦显微镜)记录10个随机SNP区域，并通过ImageJ(美国国立卫生研究院和光学与计算仪器实验室开发的基于Java的图像处理方法)分析神经密度、神经长度、神经反射率(LOCI,University of Wisconsin.SchneiderCA,Rasband WS,Eliceiri KW(2012)."NIH Image to ImageJ:25years of imageanalysis".Nat Methods.9(7):671-675.)并通过CCMetrics分析神经迂曲度(CCMetrics是一种图像分析软件，其允许手动追踪神经并自动量化来自角膜共聚焦显微镜(CCM)图像的神经纤维测量值：Dabbah MA et al.Automatic Analysis of Diabetic PeripheralNeuropathy using Multi-scale Quantitative Morphology of Nerve Fibres inCorneal Confocal Microscopy Imaging.Journal of Medical Image Analysis.2011；15(5),738-747；Petropoulos IN et al.Rapid automated diagnosis of diabeticperipheral neuropathy with in vivo corneal confocal microscopy.Investigativeophthalmology&visual science 2014；55:2071-2078；Tavakoli M et al.Normativevalues for corneal nerve morphology assessed using corneal confocalmicroscopy:a multinational normative data set.Diabetes Care 2015；38:838-843.)。

-通过个体间质神经追踪进行纵向角膜监测：

对于每只术前大鼠，在4个象限中的3个象限内手动绘制并记录深度为50-80um的3个个体间质神经。通过IVCM对整个角膜厚度进行体积采集。在治疗前(手术后2周)、治疗后2周(手术后4周)和治疗后4周(手术后6周)的接下来几周内，将发现相同的间质神经并进行了体积采集。通过ImageJ测量SNP神经密度，并将神经纤维数量通过术前基线进行归一化。

在基线(泪腺切除前)，泪腺切除后两周、四周和六周进行角膜神经密度追踪，并在进行两周测量后开始治疗。将神经密度绘制为与基线的倍数差异，在治疗开始前去除腺体两周后，所有动物的神经密度均有所增加。尽管在仅用赋形剂治疗的动物中未观察到明显的变化，但在用化合物治疗的动物中可以观察到神经密度的下降。

(图2-用P2X4拮抗剂治疗实施例2和对角膜神经密度的影响)

药代动力学评价

为了评估测试物质的体内药代动力学，将这些测试物质溶解在合适的制剂赋形剂(例如蓖麻油)中。然后在四至七天内将这些测试物质作为滴眼液局部给药于大鼠。给药剂量范围通常为0.1至5mg/mL。血液样本和眼组织样本是在预期的谷浓度时采集的，即恰好在下一次给药发生之前。通过在含有适当抗凝血剂(例如肝素锂或EDTA钾)的小瓶中放血，回收血液样本。血浆是通过离心从血液中产生的。将眼睛摘除并在PBS中简单清洗以去除可能残留的局部制剂。解剖眼睛并分别收集感兴趣的组织，例如角膜、泪腺和泪管、晶状体和体液以及眼后组织。将每只个体动物的眼部组织汇集在一起，用适量的0.9％ NaCl水溶液稀释，并使用Tissuelyzer或等效系统进行均质化。使用相应矩阵中的校准曲线对样品中的测试物质进行定量测量。使用乙腈或甲醇沉淀样品的蛋白质含量。此后，使用HPLC结合反相色谱柱分离样品。HPLC系统通过电喷雾界面耦合至三重四极质谱仪。具体而言，HPLC是使用C18柱(例如Phenomenex Kinetex C18 5mm 5μm 2.1×50)和10mM乙酸铵pH 6.8与在有机溶剂比例递增的梯度中的乙腈的混合物进行的。实施例2的化合物的保留时间例如约为2.6分钟。

数据：测试化合物的平均浓度(μg/L血浆或μg/kg湿组织重量)，浓度低于定量下限(LOQ)的样品表示为“

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：S·布勒;W·舒伯特;J·纳格尔;C·特吉望;D·菲尼斯;S·姚;H·林;M·陈;S·徐;
专利申请人：拜耳公司;约翰斯·霍普金斯大学;

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