一种肾上腺素中间体有关物质的HPLC检测方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种肾上腺素中间体有关物质的HPLC检测方法。

背景技术

肾上腺素作为α和β受体激动剂，主要收缩小动脉和毛细血管前括约肌，其次收缩静脉和大动脉。肾上腺素(epinephrine)是由人体分泌的一种激素，也是一种在中枢神经系统的一些神经元和肾上腺髓质的嗜铬细胞中产生的儿茶酚胺类神经递质。肾上腺素在体内具有许多功能，包括调节心率，呼吸频率和代谢转换。肾上腺素会使心脏收缩力上升，使心脏、肝、和筋骨的血管扩张和皮肤、粘膜的血管收缩，是拯救濒死的人或动物的必备品。肾上腺素于1895年被波兰生理学家Napoleon Cybulski分离出来并鉴定，1904年由FriedrichStolz首次人工合成。肾上腺素注射液于1951年12月首次在加拿大获批上市。适应症为缓解因支气管痉挛引起的呼吸窘迫；迅速缓解药物和其他过敏原的过敏反应，并延长浸润麻醉药的作用；各种原因引起的心脏骤停，但不用于心力衰竭或出血性创伤或心源性休克。

药用肾上腺素人工合成方法则包括氯乙酰化法、环氧乙烷法、氢氰酸法等。拟以邻苯二酚为原料合成肾上腺素原料，首先经过氯乙酰化生成2-氯-3，4-二羟基苯乙酮，接下来经过胺亲核取代反应生成3,4-二羟苯基N-苄基-N-甲基胺甲酮、再经过钯碳催化氢化脱苄和还原羰基，酒石酸拆分及氨水游离酒石酸盐得到肾上腺素。其中2-氯-3，4-二羟基苯乙酮(中间体ADR-3)和3,4-二羟苯基N-苄基-N-甲基胺甲酮(中间体ADR-4)为关键中间体，且由于反应体系复杂、副产物较多，目前各国药典均未有收载对其中间体质量进行控制的检测方法，开发具有专属性强、分析时间短的检测方法，对关键中间体进行质量控制，以保证肾上腺素及其制剂产品的质量。

结合合成工艺，起始原料邻苯二酚(ADR-1)、氯乙酰氯(ADR-2)、N-甲基苄胺及成品的杂质，分析了潜在杂质，以下表-1是各个杂质名称和结构式。

表-1肾上腺素合成方法中可能潜在杂质

申请人通过查阅大量中外专利与非专利文献，目前并无较好的高效液相色谱法来检测肾上腺素中间体有关物质的文献报道，不利于企业对产品质量的把控。

为了解决现有技术中存在问题，本申请发明人通过大量理论调研和试验探索，提供了一种分析肾上腺素中间体多种杂质的方法，从而更好地控制肾上腺素的产品质量。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本申请发明人通过大量理论调研和实验探索，提供了一种分离分析肾上腺素中间体有关物质(20种杂质)的液相方法，从而更好地控制肾上腺素产品质量。

为了实现本发明的目的，本发明提供的技术方案是：

一种肾上腺素中间体有关物质的HPLC检测方法：采用十八烷基键合硅胶(反相)为填充剂的色谱柱，以50mmol/L高氯酸钠和5mmol/L磷酸二氢钾的混合液(50mmol/L和5mmol/L指高氯酸钠和磷酸二氢钾在混合液中的浓度)，pH＝3.0(用磷酸调节)为弱洗脱流动相，乙腈-甲醇(3:7，V/V)混合物为强洗脱流动相，以弱洗脱流动相:强洗脱流动相＝(95～20):(5～80)(v/v)进行梯度洗脱，对肾上腺素中间体20种杂质进行分离测定，所述HPLC检测采用如下色谱条件：

流动相流速为0.8～1.2mL/min；

色谱柱柱温为30℃～50℃；

检测器采用紫外检测器，检测波长为205nm～240nm；

优选的，所述色谱柱为Waters Atlantis T3(4.6mm×150mm)，填充剂粒径为3μm；

优选的，所述色谱柱的柱温为35℃；

优选的，所述检测波长为230nm；

优选的，所述流动相流速为1.0mL/min；

优选的，进样量为10μL。

进一步的，所述检测方法包括如下步骤：

1.1用稀释剂配制待测品溶液，所述稀释剂为：乙腈:水＝20:80，v/v；

1.2将步骤1.1所得的待测品溶液注入到高效液相色谱仪的色谱柱中进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1、实现了对肾上腺素中间体20种杂质的有效分离和检测，因此本发明的检测方法能够更好地实现对肾上腺素中间体的质量控制，提高最终产品的品质，保证了其临床用药的安全有效。

2、本发明的检测方法将多个中间体检测融合进一个检测方法，操作简便，成本低，能够有效分离肾上腺素中间体20种杂质，所有杂质之间分离度均大于1.5，为产品研发和生产提供了简便、稳定、可靠的分析检测方法。

需要说明的是：本发明中“％”未作特别说明的话，均是指体积百分比。

附图说明

图1为ADR-1以及相关杂质LogD图；

图2为ADR-3以及相关杂质LogD图；

图3为ADR-4以及相关杂质LogD图；

图4为分别采用pH2.5、pH5.0、pH7.5、pH10.0的流动相对ADR及有关物质进行检测谱图，从上至下：依次为pH5.0、pH10.0、pH2.5、pH7.5；

图5为分别采用不同色谱柱对ADR及有关物质进行检测谱图；

图6为分别采用不同流动相A对ADR及有关物质进行检测谱图；

图7为分别采用不同盐浓度流动相A对ADR及有关物质进行检测谱图；

图8为ADR中间体以及有关物质ACD/LC-Simulator创建梯度-温度-有机相种类3D模型；

图9为ADR中间体以及有关物质实样测试图；

图10为ADR中间体以及有关物质ACD/LC-Simulator创建梯度-温度-流动相pH3D模型；

图11为ADR中间体以及有关物质实样测试图；

图12为ADR中间体以及有关物质分析方法波长筛选(释释剂)；

图13为ADR中间体以及有关物质分析方法波长筛选(供试品及各杂质)。

具体实施方式

为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不应以任何形式限制本发明权利要求书请求保护的范围。

以下各实施例中，所用试剂如下：

ADR-1、ADR-1-IMP-01、ADR-1-IMP-02和ADR-1-IMP-04购自中国食品药品检定研究院；

ADR-3、ADR-3-IMP-01、ADR-3-IMP-02、ADR-3-IMP-03、ADR-3-IMP-04、ADR-3-IMP-06和ADR-3-IMP-07为申请人根据现有技术自制；

ADR-4-IMP-01和ADR-4-IMP-02购自阿拉丁，ADR-4、ADR-4-IMP-03、ADR-4-IMP-04、ADR-4-IMP-06、ADR-4-IMP-07、ADR-4-IMP-09和ADR-4-IMP-10为申请人根据现有技术自制；

ADR-5为申请人根据现有技术自制。

实施例1

稀释剂筛选

经试验，各杂质在20v/v％乙腈水溶液中均溶解性较好，故使用20v/v％乙腈水溶液作为稀释剂配制杂质储备液。

pH值筛选

图1为ADR-1以及相关杂质LogD图(ACD/Auto Chrom绘制)。通过ADR-1以及相关杂质LogD图可知，所有化合物的LogD均大于0，在普通的C18色谱柱上均有一定的保留，且在pH小于9的流动相条件下，各化合物表现出分子形态，出峰顺序不受pH的影响，当流动相的pH大于9时，各化合物的保留急剧减弱，当流动相的pH大于12时，所有化合物的LogD均小于0。因此，对于ADR-1及其有关物质的检测，适合在酸性条件下进行。

图2为ADR-3以及相关杂质LogD图。通过ADR-3以及相关杂质LogD图可知，化合物2(1-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基乙酮)的LogD最小，疏水性最差，保留最弱，但所有化合物的LogD均大于0，在普通的C18色谱柱上均有一定的保留。化合物4在pH1-14范围内均呈分子态，说明该化合物是一个中性化合物，不受pH的影响。ADR-3及有关物质中，除化合物4外的6个化合物在pH大于8的流动相条件下，各化合物呈现出分子离子形态，保留急剧减弱，在pH小于6的流动相条件下，各化合物呈现出分子形态，出峰顺序不受pH的影响。因此，对于ADR-3及其有关物质的检测，适合在酸性条件下进行。

图3为ADR-4以及相关杂质LogD图。通过ADR-4以及相关杂质LogD图可知，各个化合物在不同pH条件下的保留行为各不相同。化合物6在pH1-14范围内均呈分子态，说明该化合物是一个中性化合物，不受pH的影响。整体来看，各化合物在酸性条件下的保留较碱性条件下强。因此，对于ADR-4及其有关物质的检测，适合在酸性条件下进行。

综上所述，中间体ADR-3、ADR-4及相关杂质在不同的pH条件下存在不同的保留行为。在酸性条件下，大部分化合物存在单一形态；随着pH的升高，化合物出现分子离子态，且大部分化合物的保留降低。

分别采用pH2.5、pH5.0、pH7.5、pH10.0的流动相对ADR及有关物质进行检测，具体色谱条件如下表-2。

样品溶液准备(后续参数优化检测所用样品与流动相pH值筛选所用样品相同，故不再赘述)：

ADR-1混合溶液：取ADR-1、ADR-1-IMP-01、ADR-1-IMP-02和ADR-1-IMP-04各5mg于10mL量瓶中，用20％乙腈溶解稀释制成0.5mg/mL的溶液。

ADR-3混合溶液：取ADR-3、ADR-3-IMP-01、ADR-3-IMP-02、ADR-3-IMP-03、ADR-3-IMP-04、ADR-3-IMP-06和ADR-3-IMP-07各2mg于10mL量瓶中，用20％乙腈溶解稀释制成0.2mg/mL的溶液。

ADR-4混合溶液：取ADR-4、ADR-4-IMP-01、ADR-4-IMP-02、ADR-4-IMP-03、ADR-4-IMP-04、ADR-4-IMP-06、ADR-4-IMP-07、ADR-4-IMP-09和ADR-4-IMP-10各2mg于10mL量瓶中，用20％乙腈溶解稀释制成0.2mg/mL的溶液。

ADR混合溶液：取ADR-1混合溶液、ADR-3混合溶液和ADR-4混合溶液各2mL，混匀，即得。

表-2pH筛选的色谱条件

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图4为分别采用pH2.5、pH5.0、pH7.5、pH10.0的流动相对ADR及有关物质进行检测谱图。

结果分析：通过不同pH的筛选结果可知，在pH2.5条件下，化合物的保留和峰形较好；在pH5.0条件下，色谱图的基线波动较大，主要是因为pH5.0条件下的流动相为乙酸铵缓冲溶液，该溶液的紫外吸收截止波长为210nm，存在着末端吸收，影响检测灵敏度；在pH7.5、pH10.0条件下，化合物的保留和峰形均较差。因此，pH2.5的流动相体系更适用于ADR中间体有关物质的检测。

结论：选择pH2.5的流动相体系用于ADR中间体有关物质的检测。

色谱柱筛选

根据图1-3的LogD图可知，ADR及有关物质的疏水性较弱，选择普通的C

表-3色谱柱筛选的色谱条件

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注：色谱柱1购自沃特世公司，色谱柱2购自赛默飞公司，色谱柱3购自沃特世公司，色谱柱4购自安捷伦公司，色谱柱5购自岛津公司，色谱柱6购自ACE公司，色谱柱7购自ACE公司。

图5为分别采用不同色谱柱对ADR及有关物质进行检测谱图。色谱柱筛选的检测结果汇总见表-4。

表-4色谱柱筛选的检测结果汇总表

结果分析：对色谱柱筛选得到的色谱图和结果汇总表进行分析，在WatersAtlantis T3条件下，ADR中间体及有关物质色谱峰检出个数最多，色谱峰的保留和峰形对称性较好，基线较为平稳。因此，选择Waters Atlantis T3作为ADR中间体有关物质检测的色谱柱。

流动相筛选

流动相筛选的色谱条件见表-5。

表-5流动相筛选的色谱条件

注：TFA为三氟乙酸。

图6为分别采用不同流动相A对ADR及有关物质进行检测谱图。流动相A筛选的检测结果汇总见表-6。

表-6流动相筛选的检测结果汇总表

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结果分析：通过流动相筛选的典型色谱图可知，三种流动相条件下，ADR中间体及有关物质均有保留，部分化合物均存在拖尾现象，考虑到在流动相3的条件下，ADR中间体及有关物质的色谱峰检出个数最多。综合考虑，选择流动相3用于ADR中间体及有关物质的检测。

盐浓度筛选

流动相中盐浓度筛选的色谱条件见表-7。

表-7流动相中盐浓度筛选的色谱条件

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图7为分别采用不同盐浓度流动相A对ADR及有关物质进行检测谱图。

结果分析：通过盐浓度筛选的典型色谱图可知，在10mmol/LNaClO

梯度温度有机相种类优化

HPLC方法建立的一个共同目标是将所有的目标色谱峰与它们相邻的峰分开(即Rs≥1.5)。分离度Rs的公式如下：

Rs＝(1/4)[k/(1+k)](α-1)N

不同的分离条件对色谱峰保留因子(k)、选择性(α)的影响不同。色谱柱的类型、流动相的pH、有机相种类对选择性(α)起到主要影响，而温度和梯度对色谱峰的保留和选择性(尤其是结构类似物)有着不可忽视的影响。本研究设计了温度(logk＝logA+B/Tk)、梯度

表-8梯度温度有机相种类优化的色谱条件

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利用ACD/LC-Simulator创建梯度温度有机相种类3D模型，并优化出最佳梯度-温度-有机相种类模型，图8为ADR中间体以及有关物质ACD/LC-Simulator创建梯度-温度-有机相种类3D模型。

通过ACD/LC-Simulator预测的色谱图可知，当柱温35℃、有机相种类乙腈-甲醇(30：70)、梯度0min(5％B)-33min(80％B)的条件下各杂质的分离度最佳，ADR中间体及有关物质的最小分离度Rs为1.9。ACD/LC-Simulator预测的色谱条件详见表-9。

表-9ACD/LC-Simulator预测的色谱条件

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利用ACD/LC-Simulator预测的色谱条件进行实样测试。图9为ADR中间体以及有关物质实样测试图。

结果分析：利用ACD/LC-Simulator预测的色谱条件进行实样测试图和ACD软件预测的色谱图无差异，各杂质的分离度Rs≥1.5。

梯度温度流动相pH优化

梯度温度流动相pH优化的色谱条件见表-9。

表-9梯度温度流动相pH优化的色谱条件

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利用ACD/LC-Simulator创建梯度温度流动相pH3D模型，并优化出最佳梯度-温度-流动相pH模型，图10为ADR中间体以及有关物质ACD/LC-Simulator创建梯度-温度-流动相pH3D模型。

通过ACD/LC-Simulator预测的色谱图可知，当柱温35℃、流动相pH为3.0、梯度0min(5％B)-28min(80％B)的条件下各杂质的分离度最佳，ADR中间体及有关物质的最小分离度Rs为1.6。ACD/LC-Simulator预测的色谱条件详见表-10。

表-10ACD/LC-Simulator预测的色谱条件

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利用ACD/LC-Simulator预测的色谱条件进行实样测试。图11为ADR中间体以及有关物质实样测试图。

结果分析：利用ACD/LC-Simulator预测的色谱条件进行实样测试图和ACD软件预测的色谱图无差异，各杂质的分离度Rs≥1.64。

检测波长的筛选

检测波长筛选的色谱条件见表-10。

表-10检测波长筛选的色谱条件

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图12为ADR中间体以及有关物质分析方法波长筛选(稀释剂)。

图13为ADR中间体以及有关物质分析方法波长筛选(供试品及各杂质)。ADR混合溶液在不同波长下的检测结果见表-11。

表-11同一样品在不同波长下的检测结果

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结果分析：通过对空白(稀释剂)提取不同检测波长，分别提取检测波长205nm、210nm、220nm、230nm和240nm。由图12可以看出，空白基线的波动随着检测波长的不断提高而减小，当检测波长为230nm和240nm时，空白基线波动较为平稳，对样品检测影响较小。通过对ADR混合溶液提取不同检测波长，分别提取检测波长205nm、210nm、220nm、230nm和240nm。由图13和表-11可以看出，随着检测波长的不断提高，ADR中间体及杂质的响应在不断降低。通过比较检测波长230nm和检测波长240nm条件下各杂质峰的峰面积发现，ADR-1-IMP-04的峰面积在检测波长240nm条件下较在检测波长230nm条件下减小了8倍，ADR-1和ADR-1-IMP-01的峰面积在检测波长240nm条件下较在检测波长230nm条件下减小了6倍，ADR-4-IMP-04和ADR-1-IMP-02的峰面积在检测波长240nm条件下较在检测波长230nm条件下减小了5倍。综合考虑杂质检出情况、杂质的灵敏度以及基线的波动情况，最终确定以230nm作为检测波长。

根据上述各条件优化的结果，确定最终的分析方法，以列表的形式阐述，肾上腺素中间体检测方法色谱条件见表-12。

表-12肾上腺素中间体检测方法色谱条件

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