一种通过核磁共振氢谱测定枸橼酸托法替布片中有效含量的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种通过核磁共振氢谱测定枸橼酸托法替布片中有效含量的方法。

背景技术

枸橼酸托法替布(Tofacitinib Citrate Tablets)，化学名称为3-[(3R，4R)-4-甲基-3-[甲基(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]-1-哌啶基]-3-氧代丙腈-2-羟基丙烷-1,2,3-三甲酸盐，结构式如式I所示。

式I枸橼酸托法替布的化学结构式

枸橼酸托法替布是美国辉瑞公司研发，于2012年11月6日获美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的一种激酶(JAK)抑制剂，主要用于对甲氨蝶呤治疗反应不足或不耐受的中度至重度活动性类风湿性关节炎(RA)的治疗，是类风湿性关节炎的一类新药(first-in-class drug)。2017年3月10日获中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市。目前枸橼酸托法替布片的检测方法主要是高效液相色谱法，该方法检测时间长，且需要标准品。核磁共振波谱定量技术因其具有检测快速，准确，无需对照品，能同时实现定性和定量等优点，自被中国药典2010年首次引入后，逐步被应用于新药研发、农药、天然产物、药品质量控制、食品检测和对照品等领域。

目前各国药典均未收载枸橼酸托法替布及其制剂的质量标准，且相关文献报道较少，因此枸橼酸托法替布片的含量测定方法有待进行研究。本研究通过核磁共振氢谱法，优化核磁测试参数，内标物和氘代试剂，开发出枸橼酸托法替布片的含量测定方法，对其进行方法学验证，并用高效液相色谱法(HPLC)验证测定结果。该实验首次采用定量核磁共振氢谱法(qHNMR)检测橼酸托法替布片中的托法替布的含量，同时实现定性和定量分析，为橼酸托法替布片的质量控制提供一种快速、简单、准确的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过核磁共振氢谱测定枸橼酸托法替布片中有效含量的方法。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种通过核磁共振氢谱测定枸橼酸托法替布片中有效含量的方法，包括以下步骤：

(1)测定枸橼酸托法替布和内标物3,5-二甲基吡唑在溶剂氘代二甲亚砜中的定量峰，枸橼酸托法替布定量峰为δ7.13的质子峰，内标物3,5-二甲基吡唑的定量峰为δ5.73的质子峰；(2)设置核磁共振波谱仪的参数，脉冲序列zg30；温度298K，谱宽(SWH)20ppm，采集时间(AQ)4.09s；脉冲宽度(P1)14.63μs；空扫次数(DS)2次；弛豫延迟时间(D1)26s；扫描次数(NS)16次，将枸橼酸托法替布和内标物3,5-二甲基吡唑溶于氘代二甲亚砜中得到测试样品溶液，上机测试，得到混合物的氢谱后，手动调整相位和基线并积分；

(3)托法替布质量含量计算公式：

该公式中，A

进一步地，测试样品溶液的具体配制过程如下：取枸橼酸托法替布片，置于玛瑙研钵中进行研磨成粉末状，并转移至样品瓶中备用，准确称取粉末状待测样品和的3,5-二甲基吡唑于离心管中，加入DMSO-d6进行超声溶解后，离心，0.45μm微孔滤膜过滤于核磁管中，即得，枸橼酸托法替布片和3,5-二甲基吡唑的质量比为40:1。

优选地，超声功率为250W，枸橼酸托法替布在DMSO-d6中的浓度为200mg/mL。

进一步地，所述核磁共振波谱仪为Bruker Avance III 400MHz核磁共振谱仪。

该方法专一性强，在0.793～7.925mg/mL范围内,呈现良好的线性关系(r

附图说明

图1为枸橼酸托法替布氘代DMSO溶液的

图2为3,5-二甲基吡唑氘代DMSO溶液的

图3为枸橼酸托法替布片和3,5-二甲基吡唑混合物的

图4为本申请方法得到的枸橼酸托法替布的线性方程图；

图5为枸橼酸托法替布片的HPLC谱图。

具体实施方式

仪器与试剂

Bruker AvanceⅢ400MHz核磁共振谱仪(瑞士布鲁克公司)，十万分之一电子分析天平(美国梅特勒-托利多公司)，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Pipet-Lite PL+移液枪(美国梅特勒-托利多集团)，离心机5430R(德国埃普多夫公司)，Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)。

枸橼酸托法替布片(齐鲁制药有限公司，批号H20193295)，枸橼酸托法替布标准品(武汉臻纯生物科技有限公司，含量≥99％)，3,5-二甲基吡唑(Aladdin，含量≥99％)，顺丁烯二酸(Aladdin，含量≥99％)，对苯二甲酸二甲酯(Aladdin，含量≥99％)，氘代二甲亚砜(DMSO-d

实施例1

一种通过核磁共振氢谱测定枸橼酸托法替布片中有效含量的方法，包括以下步骤：

(1)测试条件

qHNMR：脉冲序列zg30；温度298K，谱宽(SWH)20ppm，采集时间(AQ)4.09s；90度脉冲宽度(P1)14.63μs；空扫次数(DS)2次；弛豫延迟时间(D1)26s；扫描次数(NS)16次，手动调整相位和基线平滑并积分。

HPLC：色谱柱Potensil C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A(0.02v％三氟乙酸+水)，B(0.02v％三氟乙酸+乙腈)，流速：1.2mL/min，梯度洗脱：0.0～2.0min，流动相B10％；2.0～10.0min，流动相B10％～95％；10.0～12.0min，流相B 95％；12.0～13.0min；流动相B95％～10％；13.0～20.0min，流动相B10％。柱温：40℃，检测波长：286nm，进样量：5μL，外标法定量。

(2)溶液制备

核磁测试溶液制备：取枸橼酸托法替布片30片，置于玛瑙研钵中进行研磨成粉末状，并转移至样品瓶中备用。准确称取200mg粉末状待测样品和5mg的3,5-二甲基吡唑于离心管中，加入1.0mL的DMSO-d

高效液相色谱法溶液制备：称取5mg枸橼酸托法替布标准品于25mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，得标准品溶液。再称取三份30mg粉末状待测样品分别于10mL容量瓶中，体积比为50％的甲醇水溶液溶解定容，在超声超声功率250W下超声10min，0.45μm微孔滤膜过滤，得待测溶液。

(3)计算公式

托法替布质量含量计算公式：

该公式中，A

结果与讨论

1.弛豫延迟时间(D1)的选择

弛豫延迟时间(D1)是核磁定量实验中影响质子信号峰面积的准确性的重要参数，也是该实验的关键因素。D1应大于等于5倍T

2.氘代试剂和定量峰的选择

根据枸橼酸托法替布的溶解性，选择DMSO-d

DMSO-d

3.内标物及内标峰的选择

定量核磁中内标物选择的标准是不与待检测物发生反应，且在氘代试剂中溶解性较好，内标峰与样品峰不应存在干扰且分离度良好。取常用内标顺丁烯二酸(马来酸)、对苯二甲酸二甲酯、3,5-二甲基吡唑进行测定。结果表明，3,5-二甲基吡唑δ5.73处的质子峰与枸橼酸托法替布的信号峰不重叠且无干扰，故选择为3,5-二甲基吡唑为内标物，δ5.73为内标峰。

4.方法学验证

(1)线性关系考察

使用电子天平精密称取内标3,5-二甲基吡唑51.49mg并加入10mLDMSO-d6溶解得浓度为5.149mg/mL的内标液。精密称枸橼酸托法替布标准品51.20mg(托法替布的含量是31.70mg)至容量瓶中并加入4.0mL上述内标溶液得托法替布的浓度为7.925mg/mL的供试品溶液，内标液稀释配制得托法替布浓度分别为7.925、6.3468、4.7601、3.1734、1.5867、0.79335mg/mL的一系例溶液。进行核磁测定与相位校正和积分，(见表1)，以样品和内标物浓度之比为横坐标(x)，以定量峰和内标面积之比为纵坐标(y)进行线性回归，得到枸橼酸托法替布的线性回归方程为y＝0.303x-0.010(R

C

表1线性结果

(2)重复性试验

按“实施例1步骤(2)”项下配制供试品溶液方法平行配制6份样品于磁管中，按照“实施例1步骤(1)”中的核磁共振条件进行测定，采集氢谱。分别对枸橼酸托法替布片中的托法替布的含量进行计算，并计算RSD值得1.70％，结果详见表2，由表2的结果可知，该方法重复性良好。

表2重复性结果

(3)精密度试验

取重复性试验项中的6号溶液，按照“实施例1步骤(1)”中的核磁共振条件连续测试6次，相位矫正，基线平滑并手动积分，以标准品定量峰面积与内标物定量峰面积的比值(A

表3精密度结果

(4)稳定性试验

取重复性试验项下6号溶液置于室温下，按照“实施例1步骤(1)”下的核磁共振条件，分别在时间为0、6、18、24、36、48h采集氢谱，以标准品定量峰面积与内标物定量峰面积的比值(A

表4稳定性结果

(5)HPLC与qHNMR测定结果

qHNMR测定：按照实施例1步骤(2)方法，精密称取3份粉末状的枸橼酸托法替布片，按照“实施例1步骤(1)”下的测试条件，分别采用核磁共振氢谱法(qHNMR)。

高效液相色谱法(HPLC)测定：采用外标法托法替布的质量含量，按照“实施例1步骤(2)”制备高效液相检测溶液，标准品溶液按照“实施例1步骤(1)”下HPLC检测方法，进样量分别为1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL，进行HPLC检测，以托法替布的浓度为横坐标x，HPLC峰面积为纵坐标y，得标准曲线方程y＝262.4x+4.766(r

对同一个枸橼酸托法替布片样品分别通过HPLC和核磁共振氢谱法进行定量检测，并计算枸橼酸托法替布片含量的定量结果，结果详见表5，由测定结果可知，HPLC法测定结果(质量百分含量)平均为2.24％，qHNMR测定结果平均为2.25％，两种方法测定结果较为一致。

表5 HPLC和qHNMR法测定枸橼酸托法替布片含量的定量结果

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5.结论

本文采用了核磁共振氢谱技术测定枸橼酸托法替布片中托法替布的含量，并对该方法进行了方法学验证。该分析方法重复性以及稳定性好、专属性高、操作便捷、耗时较短，且无须标准品，同时实现定性和定量分析。检测结果与HPLC法检测基本一致。定量核磁氢谱法为枸橼酸托法替布片的质量控制提供了一种准确快速的新方法。

最后应当说明的是：上述实施例仅用于说明本发明具体实施的技术方案而非对其进行限制，所属技术领域的普通技术人员应该理解，在不违背本发明宗旨的前提下，未改变其性能或用途对本发明的实施方式进行的任何等同替代或明显变型，均应涵盖在本发明请求保护的范围之内。