一种用于DMD基因检测的数字PCR检测试剂

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种用于DMD基因检测的数字PCR检测试剂。

背景技术

假肥大性肌营养不良(DMD)，也称杜氏肌营养不良症(OMIM 310200)，是最常见的一类进行性肌营养不良症，为X-连锁隐性遗传。本病主要是男孩发病，大多数女性不患病，可能为致病基因的携带者，少数患病女性可能与X染色体失活有关。现有的DMD检测方法主要包括血清学检测和基因检测。基因检测相比血清学检测可以有效评估遗传发病风险，但也存在成本高、周期长等不利因素，制约了对风险人群筛查的应用可能。

中国专利CN110527720A公开了一种用于检测DMD基因外显子拷贝数变异的扩增系统及其试剂盒，其仅PCR检测DMD基因的8个外显子，这种基于筛选部分外显子区域进行检测的qPCR方法，则存在比较高的假阴性检测结果概率，考虑到漏检可能导致严重的临床后果，仍需要其他方法对阴性结果进行二次判别，实际应用价值有限，无法发挥方法学低成本的优势。

而基于超多重数字PCR的检测方法对DMD基因的79个外显子全部进行检测，则可以尽量避免漏检，同时兼顾基于PCR技术的成本和周期优势，具有显著的临床应用前景。虽然目前已有针对DMD基因的79个外显子全部进行检测的PCR技术，(如中国专利CN112410410A、CN108220418A、CN109554443A、CN113652474A)，但是基于MLPA技术的检测方法无法进行定量，需要对DNA浓度有精确控制才能得到可靠的结果。基于超多重数字PCR的检测方法可以实现绝对定量，只需对样品内目标片段与内参片段的拷贝数进行比较即可得到具体的基因变异丰度。

基于MLPA技术的检测方法对样品量也有一定要求，无法用于产前孕妇外周血中胎儿游离DNA的检测。基于超多重数字PCR的检测方法具有超高灵敏度，可以实现同一检测方法覆盖孕前准父母DMD基因缺陷携带筛查、产前婴儿DMD基因缺陷无创检测、新生儿DMD基因缺陷检测等多个阶段的不同检测需求。

基于NGS技术的检测方法成本高周期长，常常需要数十个工作日才能给出检测结果，花费普遍在数千元的水平。基于超多重数字PCR的检测方法一般在1天内即可完成全部检测过程并给出检测结果，花费较低，大规模应用后更可能花费更低。

超多重数字PCR技术结合了超多重PCR技术可以对多个基因区域同时检测的能力和数字PCR的精准定量能力,应用于DMD基因缺陷携带检测兼具了准确性高和成本低的优势。数字PCR的原理是将反应体系分割为尽可能多的微小反应单元，以液滴形式或芯片微孔形式均可。每个反应单元中均含有进行PCR所需的酶、引物探针及其他成分，模板则随机分布在这些反应单元中，大部分反应单元仅包含一段模板序列。通过扩增后反应单元给出的荧光信号即可区分不同模板序列在样品中的存在情况。最终可以将所有反应单元的荧光信号情况以二维散点图的形式呈现。由于二维平面理论上可容纳并区分很多种类的反应单元信号，因此有潜力用于多重检测(如图1和图2所示)。

上述现有的PCR体系仅能对突变进行定性检测，并不进行突变的定量检测，更为重要的是，这些现有技术并没有考虑PCR检测技术本身的特异性，精密度和灵敏度，而较高的特异性，精密度和灵敏度则是超多重数字PCR检测必不可少的条件，较低特异性，精密度和灵敏度的PCR技术无法精确地测定突变的种类和数量，因此如何提高超多重数字PCR检测方法的特异性，精密度和灵敏度是一项亟待解决的问题，同时解决这一问题对于发挥超多重数字PCR检测方法的定量检测优势也至关重要。

发明内容

本申请旨在基于以上的调研分析，针对DMD基因的全部79个外显子设计引物对及探针，利用合理设计的引物混合物提高超多重数字PCR技术的特异性，精密度和灵敏度。

本发明提供如下技术方案：

一种用于DMD基因检测的数字PCR检测试剂，包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:158所示的外显子引物序列。

优选地，还包括SEQ ID NO:159～SEQ ID NO:237所示的外显子探针序列。

优选地，还包括SEQ ID NO:238～SEQ ID NO:277所示的内参引物序列及SEQ IDNO:278～SEQ ID NO:297所示的内参探针序列。

一种超多重数字PCR检测方法，包含如下步骤：

S1、配制PCR反应体系；所述PCR反应体系包含权利要求3中所述引物和探针序列混合物；

S2、在液滴生成芯片中加入混合好的PCR反应体系和微滴生成油，将液滴生成芯片放入样本制备仪进行微滴生成；

S3、微滴生成完毕后，将微滴转移至PCR板，并封膜；

S4、将PCR板在PCR仪上进行扩增；

S5、PCR扩增反应完成后，将PCR板置于阅读仪中进行微滴检测和结果分析；

优选地，所述PCR反应的体系为：

所述DMD引物混合液中99对引物等量添加，99条探针依据信号分布浓度呈梯度变化。

优选地，每条引物的添加终浓度是200nM；所述信号共分7阶，位于1阶的探针终浓度是20nM，2阶的探针终浓度是40nM，3阶的探针终浓度是60nM，4阶的探针终浓度是90nM，5阶的探针终浓度是120nM，6阶的探针终浓度是150nM，7阶的探针终浓度是190nM。

优选地，所述PCR反应液的成分包含50mM Tris-HCl、35mM KCl、3.5mM MgCl

优选地，所述样本为人基因组DNA。如提取自新生儿外周血的白细胞的基因组DNA。

优选地，所述PCR反应条件为：

本发明取得的有益效果：

本发明在引物和探针设计优化基础上对提高数字PCR的信号分辨能力进行了优化。本发明针对DMD的79个外显子，基于超多重PCR技术各设计1对引物探针对每个外显子分别进行拷贝数定量检测，同时对X染色体上不包含DMD基因的片段中挑选20个不同位点设计20对引物探针进行拷贝数定量检测作为内参。通过判断每个外显子拷贝数定量结果与X染色体20重定量结果的1/20是否一致，即可得到DMD基因每个外显子是否发生了缺失、重复等缺陷，及这种缺陷的丰度是100％纯合致病还是50％杂合携带。实现了DMD所有外显子的多重定量。

附图说明

图1为实施例1序列的1～38号DMD外显子区域及10个对照区域的信号验证结果。

图2为实施例1序列的39～79号DMD外显子区域及10个对照区域的信号验证结果。

图3位阴性临床样品的1～38号外显子的验证结果图。

图4为阴性临床样品的39～79号外显子的验证结果图。

图5为阳性临床样品的1～38号外显子的验证结果图。

图6为阳性临床样品的39～79号外显子的验证结果图。

其中，CY5、CY3、FAM、ROX均代表荧光标记种类，横纵坐标均为荧光强度数值。

具体实施方式

以下对本申请的具体实施方式进行详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例1：引物及探针序列的设计：

针对DMD的79个外显子各设计了1组引物和探针(即DMD exon 1-79)，同时在X染色体的非DMD区域平均分布地挑选了20个位点作为内参(Chromosome X1-X20)，如表1所示。

表1用于DMD基因检测的外显子引物序列、探针序列及内参序列

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实施例2：其余均与实施例1相同，不同之处在于外显子4的引物和探针序列替换为：

上游：GCTGGTCAGTGAACACTCTTTTG；

下游：ACCTTGTCCAGGGTACTACTTAC；

探针：CCTGAACAATGTCAACAAG。

实施例3：其余均与实施例1相同，不同之处在于外显子8的引物序列替换为：上游：GATACCACCTATCCAGATAAGAAGTC

下游：TGGCCTTGGCAACATTTCCACT

探针：ACATCACATCACTCTT

实施例4：其余均与实施例1相同，不同之处在于外显子17的引物序列替换为：上游：TGCCACTCCAAGCAGTCTTTAC

下游：GTGGTCACCGTAGTTACTGTTTC

探针：CATCACTAACACAGACAAC

实施例5：其余均与实施例1相同，不同之处在于外显子44的引物序列替换为：上游：TCAGTGGCTAACAGAAGCTGAAC

下游：GAGTCCAGATGTGCTGAAGATAAATAC

探针：CAGAAAGACACAAATTC

对比例1：采用中国专利CN112410410A中公开的DMD基因1～79外显子的引物对用于超多重数字PCR验证，每条探针均使用2种不同荧光素进行标记，用于单模板特异性验证。

实施例6：引物灵敏度测试:

引物混合物的灵敏度测试通过分别含有79种DMD外显子片段的质粒DNA作为模板进行验证。三种拷贝数加样量(3000拷贝、300拷贝、30拷贝)的情况下测试3批，每批每组进行了20次重复。当阳性结果大于95％时则判定为合格。

1.PCR反应体系配制

1.1.将PCR反应液(购买自PREGENE，货号PJ205051)、DMD引物混合液，于室温解冻，上下颠倒混匀后，用微量离心机短暂离心，使所有液体沉降于管底。样本为分别含有79种DMD外显子片段和20种内参片段的质粒DNA。

DMD引物混合液中99对引物等量添加，99条探针依据信号分布浓度呈梯度变化，具体为99对引物，共198条，每条引物的添加终浓度是200nM。探针共170条，信号共分7阶(如图1～6中横纵坐标的色斑数均为7)，从左往右，从下至上探针浓度递增，位于1阶的探针浓度是20nM，2阶是40nM，3阶是60nM，4阶是90nM，5阶是120nM，6阶是150nM，7阶是190nM。

本实施例中，按常规数字多重PCR方法添加探针，99条探针序列根据荧光标记不同扩展为170条探针，170条探针中，在X，Y两条轴上，每孔内的探针为同一序列，但探针上的标记不同，但各孔的探针序列互不相同，除X和Y轴的平面中间位置，每孔需要2条不同序列的探针。

1.2.按下表配制扩增反应体系，充分震荡混匀并短暂离心，使所有液体沉降于管底。

表2.PCR扩增反应体系配制表

所述PCR反应液的成分包含50mM Tris-HCl、35mM KCl、3.5mM MgCl

2.液滴生成

2.1在液滴生成芯片中加入混合好的反应体系、微滴生成油，将芯片放入样本制备仪进行微滴生成。(微滴生成原理参见Zhu,Zhi,et al."Single-molecule emulsion PCRin microfluidic droplets."Analytical and Bioanalytical Chemistry 403.8(2012):2127-2143.芯片使用方法参见制造商永诺生物提供的说明书)。

3.PCR扩增

3.1.微滴生成完毕后，将微滴转移至96孔PCR板，并封膜。

3.2.将PCR板在PCR仪上按以下条件进行扩增。

表3.PCR反应条件

4.结果读取与分析

4.1PCR扩增完后，将96孔PCR板置于阅读仪中进行微滴检测和DMD基因检测结果分析，本实施例中所用装置系统和检测方法均可参考专利CN114958583A，结果如下：

表4.为实施例1的灵敏度测试结果

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表5实施例2～5和对比例1的灵敏度分析结果(拷贝/反应)

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表4和表5结果对比表明替换了某个外显子的引物和探针后，整个引物混合物的灵敏度会下降，表4结果表明表1中的外显子引物序列、探针序列组合较现有引物取得了最佳灵敏度。对比例1中的引物组合用于DMD外显子检测也无法取得很好的灵敏度。

实施例7：引物特异性测试：

引物特异性测试通过在常染色体上随机选择的四种引物探针验证，PCR体系和方法同实施例6。在正常人gDNA样本中，常染色体上各个测试位点的拷贝数与DMD基因上各个测试位点的拷贝数一致。

表6.实施例1～5和对比例1的特异性分析测试结果

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表6结果表明单个外显子引物和探针的替换会导致引物混合物整体的特异性下降(如实施例2～5结果所示)，对比例1的现有引物直接用于超多重数字PCR时，也会产生特异性较低的问题。

表7常染色体上随机引物探针序列

实施例8：引物精密度测试：

引物混合物的精密度测试通过6天内分三批对分别含有79种DMD外显子片段的质粒DNA模板完成测试。质粒模板的投入量为每次反应300拷贝。PCR反应体系和方法同实施例6，测试结果如下：

表8.实施例1的引物混合物精密度测试结果

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由于实施例2-5均有非特异性扩增(如表6所示)，因此无法进行精密度测试，此处未列出精密度数据；

实施例9：将实施例1中的引物混合物实际用于白细胞样品的超多重数字PCR反应，检测全部79个外显子并给出检测结果。本实施例使用采集自新生儿外周血的白细胞样品提取基因组核酸并进行检测，结果如下：

表9阴性临床样品的各外显子定量结果

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表9结果显示内参比例符合预期，各外显子比例接近1，样本没有外显子缺失。表8结果表明本发明提供的引物探针混合物是可用于超多重数字PCR反应准确测定DMD突变。结果如下：

表10阳性临床样品的各外显子定量结果

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表10结果表明内参比例符合预期，48号外显子缺失，其余各外显子比例接近1，无缺失。以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。