一种无酶电化学传感器的组胺检测方法

技术领域

本发明涉及组胺检测领域，尤其涉及一种无酶电化学传感器的组胺检测方法。

背景技术

腌制的水产品较为常见，例如臭鳜鱼，然而，一些水产品在腌制过程中部分蛋白质被分解为游离组氨酸，再经过组氨酸脱羧基反应生成的无色无味、不挥发的一种生物胺—组胺，组胺是一种具有毒性的生物胺，食用组胺含量较高的发酵食品会使人出现急性中毒症状或引起慢性病变，因此组胺中毒是发酵食品存在的主要安全问题。

目前现有的组胺检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法等，但分光光度法检测灵敏度低；高效液相色谱法所需实验仪器、耗材昂贵，步骤繁琐；薄层色谱法对点样量、薄层板要求高，易造成图谱质量问题，而最近二十年出现的电化学传感法，是一种目标物质与具有分子识别能力的生物活性物质或无极修饰材料发生作用产生感应信号，通过信号转换器产生电信号的方法，该方法的优点在于简单、精确、仪器成本低及易微型化，能够实现快速分析，目前，这种方法用于组胺的检测相对较少，主要因为其检测电压高、传感度低，这些缺陷成为电化学检测食品中组胺含量的潜在阻碍，而且现在主要以贵金属为电化学传感器的检测材料，贵金属材料容易发生泄露中毒且成本较大。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术存在的以下问题：采用电化学传感法检测组胺所需的检测电压高、传感度低，这些缺陷成为电化学检测食品中组胺含量的潜在阻碍，而且现在主要以贵金属为电化学传感器的检测材料，贵金属材料容易发生泄露中毒且成本较大。

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种无酶电化学传感器的组胺检测方法，包括一维CuO纳米线构成的催化电极，施加0.55V电压的催化电极置于pH13的检测液内，通过电流变化反应检测液的组胺浓度。

优选的，所述检测液在通电时保持搅拌混合。

优选的，所述一维CuO纳米线构成的催化电极制备方法如下：

Cu-foam放入40mL的NaOH与(NH

优选的，所述NaOH与(NH

优选的，所述热N

优选的，所述Cu-foam在放入所述NaOH与(NH

将Cu-foam用丙酮(分析纯)40mL纯度为99.5％、盐酸(分析纯)80mL、2mol/L进行超声清洗10min，150w，清除表面杂质。

与相关技术相比较，本发明提供的无酶电化学传感器的组胺检测方法具有如下有益效果：

本发明采用液相氧化法和热处理焙烧法在Cu-foam表面生成了一维CuO纳米线阵列，并将该阵列作为检测发酵鳜鱼中组胺含量的电催化电极，在最优条件下，一维CuO纳米线阵列展现出超敏的传感度，并将它用作发酵鳜鱼中组胺含量的检测工作，得到了准确有效的结果，说明该无酶电化学组胺传感器检测发酵水产品中组胺的含量具有高度优越性，材料成本低、操作便捷。

附图说明

图1为本发明Cu-foam、Cu(OH)

图2为本发明Cu-foam、Cu(OH)

图3为本发明Cu-foam、Cu(OH)

图4为本发明Cu-foam、CuO/Cu-foam在有无组胺溶液时的CV曲线图；

图5为本发明CuO/Cu-foam在不同扫速下的CV曲线图和不同扫速的平方根-电流图；

图6为本发明Cu-foam、CuO/Cu-foam在不同的组胺浓度下I-t响应曲线图和电流-组胺浓度响应线性关系图。

图中标号：1、封装层；2、柔性电路板；3、灯珠；4、保持架；5、定位块；51、定位槽；6、适配槽；7、固力条；71、固力槽；8、内上弯折槽；81、内下弯折槽；9、外上弯折槽；91、外下弯折槽。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

一种无酶电化学传感器的组胺检测方法，以腌制的臭鳜鱼为例：

臭鳜鱼样本的制作：选取新鲜臭鳜鱼，去除鱼鳞、鱼鳃、内脏，用清水清洗干净，加入鱼肉质量3％的食盐、0.6％的花椒、0.5％的辣椒粉，以鱼肉质量的两倍进行石压，以10℃发酵8天，即得到发酵完全的臭鳜鱼样本。

样品的提取：称量ABCD四种臭鳜鱼样品质量为3.0373g、2.9895g、2.9888g、3.0384g分别定容到15mL，用过滤膜进行提取，每种样品水提30min。

样品的测试：在最佳电压0.55V和最佳pH值(pH＝13)的条件下，CuO修饰电极于磁力搅拌下每种样品连注入3针200μL提取液，从而得出每种样品的组胺浓度、浓度标准差、鱼肉中的组胺含量。

回收率的测定：在最佳电压0.55V和最佳pH值(pH＝13)的条件下，CuO修饰电极于磁力搅拌下在含有10μM标准样品浓度下回收率的测定。

一维CuO纳米线阵列制备

Cu-foam(泡沫铜)用丙酮(分析纯)40mL纯度为99.5％、盐酸(分析纯)80mL 2mol/L进行超声清洗10min，150w，清除表面杂质，在清洗完成后将其放入40mL的NaOH(5mol/L)与(NH

利用XRD、SEM和EXD对一维CuO纳米线阵列进行晶体学物性表征、形貌表征和元素组成表征。

X-射线衍射(XRD:D8 ADVANCE，Bruke)表征条件：采用Cu靶材，电压40kV，电流40mA，步长0.02度，衍射角范围10-80度；

冷场场发射扫描电子显微镜(FE-SEM:Gemini SEM500，Zeiss)表征条件：加速电压1kV，工作距离8.3mm，放大倍数1000倍；

X-射线散射能谱(EDX:OCTANE PLUS AMETEK)表征条件：加速电压20kV，工作距离5.0mm，放大倍数1000倍。

电极材料性能测试

采用三电极系统，以为Cu-foam基CuO工作电极，以饱和Ag/AgCl为参比电极，以Pt片为对电极。

(1)有无组胺催化活性研究

用CV法分别研究Cu-foam、CuO电极在组胺浓度为0和200μM时电流变化对比。电解液为30mL 0.1M NaOH溶液，扫速20mV/s。

在-0.2～0.7V电压范围内，分别研究Cu-foam、CuO两种电极材料在分别在有无组胺溶液的条件下的CV曲线，其中组胺溶液所用浓度为200mM和电解质溶液为30mL的0.1MNaOH溶液，设置扫速为20mV/s。

在-0.2～0.7V电压范围内，分别研究泡沫Cu-foam、CuO两种电极材料在含有30μL200mM组胺溶液的30mL 0.1M NaOH电解质溶液中测其CV曲线，设置扫速分别为0.005mV/s、0.01mV/s、0.02mV/s、0.03mV/s、0.05mV/s、0.08mV/s以及0.1mV/s。

(2)I-t曲线的测定(计时电流法)

最优实验条件下，用计时电流法测定CuO修饰电极在组胺溶液中的电流-时间(I-t)响应曲线，其中组胺浓度分别为0.5μM、1μM、10μM、50μM、100μM、200μM、500μM，电解液为30mL 0.1MNaOH溶液。

在最佳电压0.55V和最佳pH值(pH＝13)的条件下，测定Cu-foam、CuO修饰电极于磁力搅拌下在含有组胺溶液的0.1M NaOH电解质溶液中的I-t曲线，其中所用组胺浓度分别为0.5μM、1μM、10μM、50μM、100μM、200μM、500μM，从而得出该电化学传感器的灵敏度、线性范围、响应时间和检出限。

(3)样品测试和回收率的测定

在最优条件下，向电解液中分别加入200μL提取液(发酵的臭鳜鱼样本)，再用10μM标准液测定回收率。

材料结构和形貌表征

由以棕红色Cu为基底(图1a)，引入氧化剂(NH4)S

XRD分析

由XRD图谱(图2)可知，Cu-foam存在明显的三个衍射峰，分别对应为(111)、(200)和(220)晶面。然后经过液相氧化后，Cu-foam表面生成为Cu(OH)

SEM分析

由(图3)可看到Cu-foam、Cu(OH)

电极对组胺有无催化活性的判断

图4分别为Cu-foam、CuO/Cu-foam在0.1M NaOH溶液、扫速为20mV/s、有无组胺溶液情况下的CV曲线，从图4(a)、(b)可知，与不存在组胺条件相比，当组胺浓度为200μM，氧化电流值发生了明显的增加，这说明了Cu-foam、CuO/Cu-foam对组胺都起到了电催化氧化作用。进一步观察图4(a)、(b)可知，在加入同浓度的组胺溶液后，CuO/Cu-foam的电流值比Cu-foam的电流值要大得多，说明CuO/Cu-foam相比于Cu-foam电极材料对于组胺的催化氧化能力更强，更适合做电化学氧化组胺的催化电极。

组胺电化学氧化过程控制研究

图5为CuO/Cu-foam在含有30μL 200μM组胺溶液的30mL的0.1MNaOH溶液中不同扫速下的CV曲线。从图5(a)中可以明显看出当扫描速度升高时其电流值也会增加，其氧化峰和还原峰的电极电位会分别向着正电位和负电位移动，说明组胺在该电极上的催化氧化过程基本上是一个准可逆过程。为了进一步研究该催化氧化过程是由吸附过程控制还是由扩散过程控制，即确定扫速与氧化电流指数关系的指数值。通过图5中的(b)可以看出其氧化电流值和扫描速度的平方根之间呈良好的线性关系(R

计时电流法研究电极对组胺催化氧化行为

表1Cu-foam、CuO/Cu-foam传感器性能参数

如图6(a)、(b)所示，在最优条件下(0.55V-远低于碳材料和贵金属电极的实用电压，0.1M NaOH)，分别测定Cu-foam、CuO/Cu-foam电极在不同的组胺浓度下的I-t曲线。观察图6(a)可知，随着不同浓度的组胺标准液的连续加入，氧化电流值呈现阶跃增长，且快速达到平衡，Cu-foam的响应时间为2s，而CuO/Cu-foam的响应时间为10s。经线性拟合(图6(a)、(b))，Cu-foam电极的氧化电流与组胺浓度在0.5μM～1195μM呈良好的线性关系，其线性回归方程为I(mA)＝0.00010362C(μM)+0.01318(R

本实验采用CuO/Cu-foam基无酶传感器用于发酵臭鳜鱼中组胺含量的检测，通过观察表2中的数据可知，不同臭鳜鱼样品中组胺含量分别为16.0495mg/kg、15.1515mg/kg、15.5414mg/kg、14.2652mg/kg，且这些样品的加标回收率介于104.68％-106.79％之间。进一步研究发现，该数据结果与高效液相色谱法检测所得数据结果具有高度一致性，由此说明CuO/Cu-foam基无酶电化学传感法检测发酵鳜鱼中的组胺含量具有可靠性、有效性和准确性。

表2发酵的臭鳜鱼中组胺含量及其回收率

本发明采用液相氧化法和热处理焙烧法在Cu-foam表面生成了一维CuO纳米线阵列。并将该阵列作为检测发酵鳜鱼中组胺含量的电催化电极。经研究发现，在最优条件下，一维CuO纳米线阵列展现出超敏的传感度，其比值远高于Cu-foam，达到其传感度的31倍。并将它用作发酵鳜鱼中组胺含量的检测工作，这种应用得到了准确有效的结果。说明该无酶电化学组胺传感器检测发酵鳜鱼中组胺的含量具有高度优越性，并为发酵鱼类中组胺的检测提供潜的应用价值。

高效液相色谱法-组胺标准曲线的绘制

1)标准品的配置

在10mL的容量瓶中精确称取组胺标准品0.1g，用超纯水定容至刻度，制备成10mg/mL的组胺标准溶液，遮光，4℃贮存。将组胺标准液0.1mL于10ml容量瓶中，用超纯水进行稀释，按分级稀释方法，分别获得质量浓度0.5、1.0、5.0、10.0、20.0μg/mL的组胺标准溶液，现配现用。

2)标准品的衍生

将300μL的组胺标准品在2mL离心管中，加40μL 0.1mol/L的NaOH溶液，pH调节至9.5，然后添加600μL 10mg/mLDns-Cl溶液，搅拌均匀，放在40℃的恒温浴缸中，使其进行20min的反应。反应结束后，加100μL的氨水混合均匀，放置30min。用乙腈定容到1.5mL，搅拌均匀，4℃，10000r/min，用0.22μm的有机针状过滤器将上清液过滤。

样品组胺含量的测定

1)样品前处理

以电子天平称取5.0672g，5.0952g，5.1020g，5.0421gABCD臭鳜鱼样品，将其置于50mL的离心管中，加入15mL 5％的三氯醋酸，然后将鱼肉碾碎，于4℃，6000r/min离心15min，将上清溶液转移到25mL褐色容量瓶中。将10mL 5％三氯醋酸加入离心管，重复进行1次，将两次取得的上清液混合，置于容量瓶内，用5％三氯乙酸定容至刻度，用0.22μm的有机针状过滤器将上清液过滤。

2)样品衍生化

将300μL的试样在2mL离心管中，加40μL2 mol/L的NaOH溶液，pH调节至9.5，然后添加600μL 10mg/mL Dns-Cl溶液，搅拌均匀，放在40℃的恒温浴缸中，使其进行20min的反应。反应结束后，加100μL的氨水混合均匀，放置30min。用乙腈定容到1.5mL，搅拌均匀，4℃，10,000r/min，用0.22μm的有机针状过滤器将上清液过滤。

色谱条件

色谱柱：X-Bridge C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-水(70+30)；流速：1mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL；检测波长：254nm。

计算公式

式中:

X-臭鳜鱼中组胺的量，mg/Kg；C-样品溶液中组胺的质量浓度，mg/L；

V-样品定容后的体积，mL；f-稀释倍数；m-样品的质量，g。

表3高效液相色谱法检测所得数据

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