一种封闭环境中繁育太子参脱毒种参的方法

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种封闭环境中繁育太子参脱毒种参的方法。

背景技术

太子参栽培生产长期以块根进行无性繁殖，种参受病毒侵染积累，致使其病毒病普遍发生，种质退化严重，2015～2017年太子参种苗带病毒率高达100％。受到病毒侵染的太子参块根变小、块根数变少、产量和品质下降，太子参减产20％～70％，严重影响了太子参的效益和品质，因此出现了许多培育脱毒太子参种参的方法。

然而，现有太子参脱毒种参往往在田间繁育，在繁育过程中太子参容易再次交叉感染病毒，存在着种参携带致病菌、繁育系数低、质量参差不齐，人工管理成本较高等诸多问题。

发明内容

为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种封闭环境中繁育太子参脱毒种参的方法，以解决现有太子参脱毒种参田间繁育过程太子参容易再次交叉感染病毒，种参携带致病菌、繁育系数低、质量参差不齐，人工管理成本较高的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种封闭环境中繁育太子参脱毒种参的方法，包括以下步骤：

(1)栽培基质的制备

1.1将泥炭土、椰糠、珍珠岩和稻谷壳混合，得到物料A1；

1.2将含钙的营养液a、含有氮、磷、钾和镁的营养液b和含有微量元素的营养液c混合，得到营养液B；

1.3将步骤1.2制备的营养液B添加至步骤1.1制备的物料A1中，得到物料A2；

1.4将益生菌原液、无菌水和红糖混合，密封发酵，得到益生菌菌液C；

1.5将步骤1.4制备的益生菌菌液C稀释后喷洒至步骤1.3制备的物料A2中，厌氧发酵，得到栽培基质；

(2)太子参的栽培

将步骤(1)制备的栽培基质装填至密封透明塑料袋底部，并将脱毒太子参原原种种植于所述栽培基质中，光照条件下培养。

进一步地，步骤1.1中，所述泥炭土、椰糠、珍珠岩和稻谷壳的体积比为(5～7)：(9～11)：(3～5)：(3～5)。

进一步地，步骤1.2中，所述营养液a为四水硝酸钙，所述营养液b为硝酸钾、磷酸二氢铵和七水硫酸镁，所述营养液c为七水硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、一水硫酸锰、一水硫酸锌、五水硫酸铜和七钼酸铵；所述营养液a、营养液b和营养液c的体积比为1：1：1。

更进一步地，营养液a中，所述四水硝酸钙的用量为1650mg/L；营养液b中，所述硝酸钾的用量为1900mg/L，所述磷酸二氢铵的用量为170mg/L，所述七水硫酸镁的用量为493mg/L；营养液c中，所述七水硫酸亚铁的用量为43mg/L，所述乙二胺四乙酸二钠的用量为37mg/L，所述硼酸的用量为6.2mg/L，所述一水硫酸锰的用量为16.9mg/L，所述一水硫酸锌的用量为8.6mg/L，所述五水硫酸铜的用量为0.08mg/L，所述七钼酸铵的用量为0.25mg/L。

进一步地，步骤1.3中，所述营养液B与所述物料A1的体积比为1:5。

进一步地，步骤1.4中，所述益生菌原液包括芽孢杆菌、光合细菌、革兰氏阳性放线菌、乳酸菌和酵母菌。

更进一步地，所述芽孢杆菌占益生菌原液总体积的5％，光合细菌占益生菌原液总体积的4％，革兰氏阳性放线菌占益生菌原液总体积的3％，乳酸菌占益生菌原液总体积的5％，酵母菌占益生菌原液总体积的5％。

更进一步地，所述益生菌原液中益生菌总含量为20～40亿/g。

进一步地，步骤1.4中，所述益生菌原液、无菌水和红糖的质量体积比为1kg：9L：0.3L；所述密封发酵的温度30～35℃，时间为10～15d。

进一步地，步骤1.5中，所述物料A2在喷洒所述益生菌菌液C前还需进行高温灭菌处理；所述高温灭菌处理的温度为121～126℃，时间为40～50min。

进一步地，步骤1.5中，所述稀释为用无菌水进行稀释，稀释倍数为15-17倍；稀释后的益生菌菌液C与所述物料A2的体积比为1：(2.6～3.0)；所述厌氧发酵的温度为25～35℃，时间为25～30d。

进一步地，步骤(2)中，所述密封透明塑料袋规格为长×宽×高

＝20cm×15cm×25cm，所述栽培基质装填厚度为8～10cm；所述脱毒太子参原原种种植前在1～5℃的暗环境中培养30～40d。

进一步地，步骤(2)中，培养条件为温度20～25℃、光照强度3000～5000lx、光照时间10～12h/d，培养时间为180d。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明物料A1、营养液B、益生菌菌液C、密封透明塑料袋以及低温暗培养共同使用，具有很好的协同效果，使得太子参脱毒种参萌芽时间缩短，发芽率提高，单株种参质量和数量显著提高，而且种参在繁育过程中不容易感染病毒，不携带致病菌，不用防治病虫草害，管理省工省力，较为方便。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例3培养的柘参2号脱毒太子参生长旺盛期地上部分图；

图2为本发明实施例3培养的柘参2号脱毒太子参原原种图；

图3为本发明实施例3培养的柘参2号脱毒太子参成熟时期获得的柘参2号脱毒太子参图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。

另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

封闭环境中繁育柘参2号脱毒太子参种参

1、栽培基质的制备

1.1将10L泥炭土、18L椰糠、6L珍珠岩和6L稻谷壳混合，得到物料A1；

1.2将10L营养液a、10L营养液b和10L营养液c液混合，得到营养液B，其中营养液a、营养液b和营养液c的具体化合物种类、配制方法及用量(每升营养液B中所含各化合物的浓度)见表1；

表1营养液B的配制

1.3将8L步骤1.2制备的营养液B添加至40L步骤1.1制备的物料A1中，得到物料A2；

1.4将步骤1.3得到的物料A2置于高压灭菌锅内，于121℃灭菌处理40min；

1.5待步骤1.4灭菌处理后的物料A2冷却至室温后，将物料A2置于塑料布中包裹备用；

1.6将10L益生菌原液、90L无菌水和3kg红糖混合，于30℃密封发酵10d，得到益生菌菌液C，其中，益生菌原液的组成为芽孢杆菌、光合细菌、革兰氏阳性放线菌、乳酸菌和酵母菌(其中，芽孢杆菌占益生菌原液总体积的5％，光合细菌占益生菌原液总体积的4％，革兰氏阳性放线菌占益生菌原液总体积的3％，乳酸菌占益生菌原液总体积的5％，酵母菌占益生菌原液总体积的5％)，总活菌数为20亿/g；

1.7取0.75L步骤1.6制备的益生菌菌液C，并用17倍体积的无菌水进行稀释，之后将稀释后的益生菌菌液C喷洒至40L步骤1.3得到的物料A2上，边喷洒边搅拌，待搅拌均匀后置于塑料布中，于25℃厌氧发酵25d，得到栽培基质。

2、太子参的栽培

2.1将步骤1得到的栽培基质装入带有自封袋口的密封透明塑料袋底部，其中密封透明塑料袋规格为长：宽：高＝20cm×15cm×25cm，基质装填厚度为8cm；

2.2将柘参2号脱毒太子参原原种置于无菌培养瓶中，于1℃的暗环境中培养30d，之后用清水冲洗掉培养基(培养基为MS+琼脂5.5g/L+蔗糖50g/L，PH值5.8)，平铺沥干后置于臭氧中消毒20min；

2.3将步骤2.2暗环境中培养的柘参2号脱毒太子参原原种种植到步骤2.1装入密封透明塑料袋的栽培基质中，之后用无菌水增加栽培基质湿度，最后将密封透明塑料袋自封袋口合上；其中，每个密封透明塑料袋种植柘参2号脱毒太子参原原种4棵；栽培基质湿度为含水量65％；

2.4将步骤2.3种植柘参2号脱毒太子参原原种的密封透明塑料袋置于温度为20℃、光照强度为3000lx，光照时间为10小时/天的培养环境中培养180d。

实施例2

封闭环境中繁育柘参2号脱毒太子参种参

1、栽培基质的制备

1.1将12L泥炭土、20L椰糠、8L珍珠岩和8L稻谷壳混合，得到物料A1；

1.2将10L营养液a、10L营养液b和10L营养液c液混合，得到营养液B，其中营养液a、营养液b和营养液c的具体化合物种类、配制方法及用量(每升营养液B中所含各化合物的浓度)见表1；

1.3将16L步骤1.2制备的营养液B添加至48L步骤1.1制备的物料A1中，得到物料A2；

1.4将步骤1.3得到的物料A2置于高压灭菌锅内，于124℃灭菌处理45min；

1.5待步骤1.4灭菌处理后的物料A2冷却至室温后，将物料A2置于塑料布中包裹备用；

1.6将10L益生菌原液、90L无菌水和3kg红糖混合，于32℃密封发酵12d，得到益生菌菌液C，其中，益生菌原液的组成为芽孢杆菌、光合细菌、革兰氏阳性放线菌、乳酸菌和酵母菌(其中，芽孢杆菌占益生菌原液总体积的5％，光合细菌占益生菌原液总体积的4％，革兰氏阳性放线菌占益生菌原液总体积的3％，乳酸菌占益生菌原液总体积的5％，酵母菌占益生菌原液总体积的5％)，总活菌数为30亿/g；

1.7取1.1L步骤1.4制备的益生菌菌液C，并用16倍体积的无菌水进行稀释，之后将稀释后的益生菌菌液C喷洒至48L步骤1.3得到的物料A2上，边喷洒边搅拌，待搅拌均匀后置于塑料布中，于30℃厌氧发酵27d，得到栽培基质；

2、太子参的栽培

2.1将步骤1得到的栽培基质装入带有自封袋口的密封透明塑料袋底部，其中密封透明塑料袋规格为长：宽：高＝20cm×15cm×25cm，基质装填厚度为9cm；

2.2将柘参2号脱毒太子参原原种置于无菌培养瓶中，于3℃的暗环境中培养35d，之后用清水冲洗掉培养基(培养基为MS+琼脂5.5g/L+蔗糖50g/L，PH值5.8)，平铺沥干后置于臭氧中消毒20min；

2.3将步骤2.2暗环境中培养的柘参2号脱毒太子参原原种种植到步骤2.1装入密封透明塑料袋的栽培基质中，之后用无菌水增加栽培基质湿度，最后将密封透明塑料袋自封袋口合上；其中，每个密封透明塑料袋种植柘参2号脱毒太子参原种4棵，栽培基质湿度为含水量65％；

2.4将步骤2.3种植柘参2号脱毒太子参原原种的密封透明塑料袋置于温度为23℃、光照强度为4000lx，光照时间为11小时/天的培养环境中培养180d。

实施例3

封闭环境中繁育柘参2号脱毒太子参种参

1、栽培基质的制备

1.1将14L泥炭土、22L椰糠、10L珍珠岩和10L稻谷壳混合，得到物料A1；

1.2将10L营养液a、10L营养液b和10L营养液c液混合，得到营养液B，其中营养液a、营养液b和营养液c的具体化合物种类、配制方法及用量见表1；

1.3将56L步骤1.2制备的营养液B添加至56L步骤1.1制备的物料A1中，得到物料A2；

1.4将步骤1.3得到的物料A2置于高压灭菌锅内，于126℃灭菌处理50min；

1.5待步骤1.4灭菌处理后的物料A2冷却至室温后，将物料A2置于塑料布中包裹备用；

1.6将10L益生菌原液、90L无菌水和3kg红糖混合，于35℃密封发酵15d，得到益生菌菌液C，其中，益生菌原液的组成为芽孢杆菌、光合细菌、革兰氏阳性放线菌、乳酸菌和酵母菌(其中，芽孢杆菌占益生菌原液总体积的5％，光合细菌占益生菌原液总体积的4％，革兰氏阳性放线菌占益生菌原液总体积的3％，乳酸菌占益生菌原液总体积的5％，酵母菌占益生菌原液总体积的5％)，总活菌数为40亿/g；

1.7取1.4L步骤1.4制备的益生菌菌液C，并用15倍体积的无菌水进行稀释，之后将稀释后的益生菌菌液C喷洒至56L步骤1.3得到的物料A上，边喷洒边搅拌，待搅拌均匀后置于塑料布中，于35℃厌氧发酵30d，得到栽培基质；

2、太子参的栽培

2.1将步骤1得到的栽培基质装入带有自封袋口的密封透明塑料袋底部，其中密封透明塑料袋规格为长：宽：高＝20cm×15cm×25cm，基质装填厚度为10cm；

2.2将柘参2号脱毒太子参原原种置于无菌培养瓶中，于5℃的暗环境中培养40d，之后用清水冲洗掉培养基(培养基为MS+琼脂5.5g/L+蔗糖50g/L，PH值5.8)，平铺沥干后置于臭氧中消毒20min；

2.3将步骤2.2暗环境中培养的柘参2号脱毒太子参原原种种植到步骤2.1装入密封透明塑料袋的栽培基质中，之后用无菌水增加栽培基质湿度，最后将密封透明塑料袋自封袋口合上；其中，每个密封透明塑料袋种植柘参2号脱毒太子参原原种4粒，栽培基质湿度为含水量65％；

2.4将步骤2.3种植柘参2号脱毒太子参原原种的密封透明塑料袋置于温度为25℃、光照强度为5000lx，光照时间为12小时/天的培养环境中培养180d。

实施例3柘参2号脱毒太子参生长旺盛期地上部分如图1所示，由图1可以看出，实施例1的繁育方法无病害发生，无病虫害，无田间杂草；

实施例3柘参2号脱毒太子参原种参图如图2所示，繁育到成熟时期获得的柘参2号脱毒太子参如图3所示，可以发现，实施例3的繁育方法有利于种参生长扩繁，单株块根鲜重、单株块根数值最大，单株种参质量和数量显著提高，繁育过程中不容易感染病毒，不携带致病菌。

对比例1

同实施例3，区别在于，步骤1栽培基质的制备为(即基质未灭菌，未添加营养液B和益生菌菌液C，在密封环境中培养)：

1.1将14L泥炭土、22L椰糠、10L珍珠岩和10L稻谷壳混合，得到物料A1，即栽培基质。

对比例2

同对比例1，区别在于，步骤2太子参的栽培的中，省略步骤2.3中的将密封透明塑料袋自封袋口合上(即基质未灭菌，未添加营养液B和益生菌菌液C，在开放环境中培养)。

对比例3

同实施例3，区别在于，步骤1栽培基质的制备为：(即基质未灭菌，未添加营养液B，添加益生菌菌液C，在密封环境中培养)

1.1将14L泥炭土、22L椰糠、10L珍珠岩和10L稻谷壳混合，得到物料A1；

1.2将10L益生菌原液、90L无菌水和3kg红糖混合，于35℃密封发酵15d，得到益生菌菌液C，其中，益生菌原液的组成为芽孢杆菌、光合细菌、革兰氏阳性放线菌、乳酸菌和酵母菌(其中，芽孢杆菌占益生菌原液总体积的5％，光合细菌占益生菌原液总体积的4％，革兰氏阳性放线菌占益生菌原液总体积的3％，乳酸菌占益生菌原液总体积的5％，酵母菌占益生菌原液总体积的5％)，总活菌数为40亿/g；

1.3取1.4L步骤1.2制备的益生菌菌液C，并用15倍体积的无菌水进行稀释，之后将稀释后的益生菌菌液C喷洒至56L步骤1.3得到的物料A上，边喷洒边搅拌，待搅拌均匀后置于塑料布中，于35℃厌氧发酵30d，得到栽培基质。

对比例4

同对比例3，区别在于，步骤2太子参的栽培过程中，省略步骤2.3中的将密封透明塑料袋自封袋口合上(即基质未灭菌，未添加营养液B，添加益生菌菌液C，在开放环境中培养)。

对比例5

同实施例3，区别在于，步骤1栽培基质的制备为(即基质灭菌，添加营养液B，未添加益生菌菌液C，在密封环境中培养)：

1.1将14L泥炭土、22L椰糠、10L珍珠岩和10L稻谷壳混合，得到物料A1；

1.2将10L营养液a、10L营养液b和10L营养液c液混合，得到营养液B，其中营养液a、营养液b和营养液c的具体化合物种类、配制方法及用量见表3；

1.3将56L步骤1.2制备的营养液B添加至56L步骤1.1制备的物料A1中，得到物料A2；

1.4将步骤1.3得到的物料A2置于高压灭菌锅内，于126℃灭菌处理50min；

1.5待步骤1.4灭菌处理后的物料A2冷却至室温后，将物料A2置于塑料布中包裹备用，即栽培基质；

对比例6

同对比例5，区别在于，步骤2太子参的栽培过程中，省略步骤2.3中的将密封透明塑料袋自封袋口合上(即基质灭菌，添加营养液B，未添加益生菌菌液C，在开放环境中培养)。

对比例7

同实施例3，区别在于，步骤2太子参的栽培中，省略步骤2.3中的将密封透明塑料袋自封袋口合上(即基质灭菌，添加营养液B和益生菌菌液C，在开放环境中培养)。

对比例8

同实施例3，区别在于，营养液B中营养液a、营养液b和营养液c的具体化合物种类及用量见表4。

对比例9

同实施例3，区别在于，营养液B中营养液a、营养液b和营养液c的具体化合物种类及用量见表2。

表2营养液B的配制

对比例10

同实施例3，区别在于，步骤2太子参的栽培中，省略2.2。

对比例11

同实施例3，区别在于，步骤2太子参的栽培中，步骤2.2为将柘参2号脱毒太子参原原种置于无菌培养瓶中，于5℃的暗环境中培养40d，之后用清水冲洗掉培养基(培养基为MS+琼脂5.5g/L+蔗糖50g/L，PH值5.8)。

对比例12

将柘参2号脱毒太子参原原种置于无菌培养瓶中，于25℃的自然环境(每天光照环境10h，暗环境14h)中培养40d，之后用清水冲洗掉培养基(培养基为MS+琼脂5.5g/L+蔗糖50g/L，PH值5.8)，平铺沥干后置于臭氧中消毒20min。

效果验证：

对实施例1～3以及对比例1～10繁育的太子参进行病虫害情况、种参带毒情况、人工管理成本做出评价，评价结果如表3所示；

评价依据为：

太子参病虫害情况：发病率(发病植株/健康植株)，发病率＝0％为无；0％<发病率≤1％为少；1％<发病率≤5％为较少；5％<发病率≤10％为一般；10％<发病率≤20％为较严重；20％<发病率为严重；

人工管理成本：日常需要进行人工管理为高；日常不需要进行人工管理为低。

种参带毒情况：太子参叶片有无花叶，没有发现花叶为无；有发现花叶为部分带毒；对实施例1～3以及对比例1～10繁育的太子参进行平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数、平均萌芽时间、种植80d后的发芽率进行测定，测定结果如表4所示；(上述测试均为对实施例1～3以及对比例1～10进行多次重复试验，对大量数据进行的统计，并求取平均值。)

表3效果验证

表4效果验证

由对比例1可知，基质未灭菌，未添加营养液B和益生菌液C，在密闭环境中培养，病害较严重，不利于太子参种参生长，平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数值较低,培养过程没发现再次感染病毒。

由对比例2可知，基质未灭菌，未添加营养液B和益生菌菌液C，在开放环境中培养，培养环境容易滋生细菌，病害较多不利于太子参种参生长扩繁。平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数值也最低，并且在培养过程中容易再次感染病毒。

由对比例3可知，基质未灭菌，未添加营养液B，添加益生菌菌液C，在密封环境中培养，由于益生菌的作用，病害较少，降低了相对病害发生严重程度，但未添加营养液，所以种参平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数值不高；由于在密封环境中培养，不易再次感染病毒。由对比例4可知，基质未灭菌，添加营养液B和益生菌菌液C，在开放环境中培养，由于益生菌的作用，降低了相对病害发生严重程度，但未添加营养液，所以种参平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数值不高，并且在培养过程中容易再次感染病毒。

由对比例5可知，基质灭菌，添加营养液B，未添加益生菌菌液C，在密封环境中培养，无病害发生，由于添加了营养液，种参平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数值较高；由于在密封环境中培养，不易再次感染病毒。

由对比例6可知，基质灭菌，添加营养液B，未添加益生菌菌液C，在开放环境中培养，病害发生严重，平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数值较低，在培养过程中容易再次感染病毒。

由对比例7可知，基质灭菌，添加营养液B和益生菌菌液C，在开放环境中培养。太子参病害发生严重程度降低了很多，平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数值也得到极大提升，但在培养过程中容易再次感染病毒。

由对比例8可知，营养液B中减少了大量元素四水硝酸钙、硝酸钾、七水硫酸镁的用量，因太子参生长期间营养供应不足，生长不良，平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数均降低。

由对比例9可知，营养液B中增加了大量元素四水硝酸钙、硝酸钾、七水硫酸镁的用量，并未使太子参平均块根鲜重、单株块根鲜重、单株块根数得到提升，是因为大量元素施用偏多，发生盐毒害，导致植株生长不良。

由对比例10～12可知，在太子参的栽培中过程中，暗环境、低温和臭氧的复合处理能够有效的缩短萌芽时间。用臭氧处理可以提高太子参原原种的发芽率其与臭氧极强的杀菌能力有关，臭氧能够抑制微生物的呼吸作用，避免了由于病菌侵染所造成某些种子霉烂而不能发芽或产生畸形芽情况的发生。另外还与一些生物酶活性的提高有关。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。