用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法。

背景技术

犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)属副黏病毒亚科茹布拉病毒属成员，是一种单链负义RNA病毒。CPIV是引起犬等动物呼吸道传染性疾病的主要病原之一，常引起犬的支气管炎和支气管肺炎。各种年龄、品种和性别的犬均易感，但主要感染幼犬，发病急，传播快。急性期病犬是主要传染源。病毒主要存在于呼吸系统，通过呼吸道而感染。本病感染性极高，只要接触到患犬或分泌物，就很容易感染，特别是呼吸到有病毒颗粒的空气都极可能感染、发病。本病常与支气管败雪波氏菌合并感染。有的犬感染CPIV后表现后驱麻痹和运动失调等神经症状。目前实验室诊断CPIV的方法有：病毒分离鉴定、免疫扩散、免疫荧光、PCR、ELISA、电镜镜检等。其中临床常用的检测方法为RT-PCR。PCR技术因敏感性高、特异性强、费用低等优点已成为一种经典的检测方法，广泛用于犬副流感病毒的检测。

目前针对用于犬副流感病毒的试剂盒大多存在操作复杂、特异性差、灵敏度低及检测结果准确性不高等缺陷。鉴于此，本发明建立了一种快速检测用于犬副流感病毒的检测方法，为临床检测提供了保障。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中对犬副流感病毒检测操作复杂、特异性差、灵敏度低及检测结果准确性不高的问题。

为此，本发明提供了一种用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物，包括：

正向引物，其序列为：5’-AGTTGCAGATGTGGTCCAGG-3’；

反向引物，其序列为：5’-CCCACAATCTGGCCTGTCAA-3’；

探针，其核酸序列为：5’-CATTGGCTCAATCCTCAATCTCTA-3’。

具体地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

具体地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LCRED460中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种。

本申请还提供了一种用于检测犬副流感病毒的试剂盒，包括PCR反应液；所述PCR反应液包括任意一项所述的用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物。

具体地，所述PCR反应液包括：1-5mM MgCl2，20-50mM Tris，100-500mg/L BSA，10-100uM dNTPs，0.1-1.0uM正向引物，0.1-1.0uM反向引物，0.1uM荧光探针组成。

具体地，所述试剂盒还包括酶混合液；所述酶混合液包括40U/μL的RNA酶、抑制剂、25U/μL的逆转录酶和5U/μL的Taq酶混合组成。

具体地，还包括阳性对照和阴性对照。

具体地，所述阳性对照为临床上收集犬副流感病毒强阳性样本；所述阴性对照为超纯水。

本申请还提供了一种用于检测犬副流感病毒的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本的DNA；

(2)以待测样本的DNA为模板，进行荧光定量PCR反应，所述PCR反应体系包括权利要求1-3任意一项所述的用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物；

(3)PCR反应结束后，根据Ct值判定检测结果。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的这种以用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物作为主要成分的试剂盒耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高，接近现有技术中检测犬副流感病毒的最高水平，灵敏度可达1.2×10-3ng/μL，能够对犬副流感病毒进行特异性检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他病毒之间无交叉反应，因此可用于临床犬副流感病毒的快速诊断和流行病学调查。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明实施例2中PCR反应结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。

本发明提供了一种用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物，包括：

正向引物，其序列为：5’-AGTTGCAGATGTGGTCCAGG-3’；

反向引物，其序列为：5’-CCCACAATCTGGCCTGTCAA-3’；

探针，其核酸序列为：5’-CATTGGCTCAATCCTCAATCTCTA-3’。具体地，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

具体地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LCRED460中的一种，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种。

本发明还提供了一种用于检测犬副流感病毒的试剂盒，包括PCR反应液、阳性对照和阴性对照。

具体地，所述PCR反应液包括：1-5mM MgCl2，20-50mM Tris，100-500mg/L BSA，10-100uM dNTPs，0.1-1.0uM正向引物，0.1-1.0uM反向引物，0.1uM荧光探针组成。

具体地，所述试剂盒还包括酶混合液；所述酶混合液包括40U/μL的RNA酶、抑制剂、25U/μL的逆转录酶和5U/μL的Taq酶混合组成。

具体地，还包括阳性对照和阴性对照。

具体地，所述阳性对照为临床上收集犬副流感病毒强阳性样本；所述阴性对照为超纯水。

本发明还提供了一种用于检测犬副流感病毒的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样本的DNA；

(2)以待测样本的DNA为模板，进行荧光定量PCR反应，所述PCR反应体系包括所述的用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物；

(3)PCR反应结束后，根据Ct值判定检测结果。

下面通过具体实施例对本发明的用于检测犬副流感病毒的引物探针组合物、试剂盒及方法的效果进行研究。

实施例1

本实施例提供检测犬副流感病毒的试剂盒包括：

用于检测犬副流感病毒的荧光定量PCR反应液、酶混合液、阳性对照品以及阴性对照品。

PCR反应液包括：2mM MgCl2，50mM Tris(PH8.3)，500mg/L BSA，100uM dNTPs，0.1uM正向引物，0.1uM反向引物，0.1uM荧光探针。

所述的正向引物核酸序列为：5’-AGTTGCAGATGTGGTCCAGG-3’；反向引物序列为：5’-CCCACAATCTGGCCTGTCAA -3’；特异性荧光探针的核酸序列为：5’-CATTGGCTCAATCCTCAATCTCTA-3’。其中所述特异性荧光探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、TexasRED或LC RED460中的一种，荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2或BHQ3中的一种。

所述的酶混合液由40U/μL的RNA酶抑制剂、25U/μL的逆转录酶和5U/μL的Taq酶混合组成。

所述的阳性对照品为临床收集的犬副流感病毒强阳性样本。

所述的阴性对照为超纯水。

实施例2

一种快速检测犬副流感病毒RT-PCR检测试剂盒使用方法，包括以下步骤：

1、试剂准备

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液(2.9ul/份)、酶混合液(0.1ul/份)，充分混匀成PCR-mix；瞬时离心后备用。

2、样本处理

取患犬体液样本200ul，使用苏州中科先进技术研究院有限公司的病毒DNA/RNA共提试剂盒(磁珠法)，按照其说明书操作，提取获得样本的核酸提取物。

3、加样

按一定顺序向反应液中分别加入2ul的阴性对照、阳性对照、样本核酸提取物、盖紧反应管转移至PCR扩增区。将各反应管按一定顺序放入Q3Plus荧光定量PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增：

检测荧光选择：FAM。

4、结果分析

阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。阳性对照Ct值应小于38，

阴性对照Ct无数值且内标CT值＜40；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的S型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。

1.检测样本Ct≤38.0者判为阳性。

2.检测样本的38.0＜Ct≤40的样本建议重做，重做结果Ct值<40者为阳性，否则为阴性。

请参阅图1为犬副流感病毒检测结果图。其中，①犬副流感病毒阳性检测结果。②犬副流感病毒阴性检测结果。

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。