一种检测兽药奥芬达唑的试纸条及方法

技术领域

本发明涉及一种检测兽药奥芬达唑的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测兽药奥芬达唑的胶体金试纸条，其特别适用于液体乳中奥芬达唑残留的检测。

背景技术

奥芬达唑(Oxfendazole，OFZ)是一种高效、广谱、低毒的苯并咪唑氨基甲酸酯类抗蠕虫药物，又称砜苯咪唑或磺苯咪唑，为芬苯达唑硫原子上的氧化物，其化学名称为5-苯-2-苯并咪唑-氨基甲酸甲酯。于70年代初由美国新泰克斯公司最先研制成功，《英国兽药典》(1985年版)已收载。目前已被广泛用于家畜、家禽驱虫。研究表明，连续或过量的用药会造成奥芬达唑在动物体内的残留，并会随着食物链进行蓄积和传递，对人类健康构成威胁。随着人们对食品安全的日益重视，动物源性食品中药物残留的限量要求也日益严格。我国国家标准GB 31650中规定了牛/羊奶中奥芬达唑的最大残留限量为100μg/kg。

目前已报道的检测奥芬达唑的方法主要是气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱质谱法和液相色谱质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适于液体乳中奥芬达唑残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够检测液体乳中兽药奥芬达唑残留的胶体金试纸条，并且提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。

本发明所提供的检测奥芬达唑的试纸条，包括试纸和微孔试剂；所述试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫，其依次连接，所述反应膜上具有包被有奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述微孔试剂上冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物，其具有微孔塞。

所述奥芬达唑单克隆抗体是以奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

所述奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物由奥芬达唑半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述奥芬达唑半抗原是以奥芬达唑EP杂质C为起始原料，经与对羧基苯甲醛进行缩合反应，再经硼氢化钠还原得到，其分子结构式为：

所述底板为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫为聚酯纤维或玻璃纤维材质；所述吸水垫为吸水滤纸；所述反应膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被有奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1)以奥芬达唑EP杂质C为起始原料，经与对羧基苯甲醛进行缩合反应，再经硼氢化钠还原，制备奥芬达唑半抗原；

2)将奥芬达唑半抗原与载体蛋白偶联，制备奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌奥芬达唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5)分别将奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(T)和质控线(C)上；

6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

7)将制备的奥芬达唑单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物；

8)将奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

9)将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、pH为7.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；

10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫，最后切成3.95mm宽的小条；

11)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试纸条，2～8℃条件下保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测液体乳中奥芬达唑残留的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试纸条进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明的奥芬达唑快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中，样品中的奥芬达唑先与其充分反应，形成药物-抗体-胶体金标记物；再插入试纸条，样本中的药物在流动过程中与反应膜检测线上的奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有奥芬达唑残留。

检测时，样品经处理后滴入微孔试剂内，充分反应后再将试纸条插入微孔中，当奥芬达唑在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)上各出现一条红色条带，且T线显色比C线显色深或与C线显色一致；如果奥芬达唑在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与奥芬达唑全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比C线显色浅。如图4所示。

阴性：当质控线(C)显示出红色条带，检测线(T)同时也显示出红色条带，且(T)线颜色接近或深于(C)线时，判为阴性。

阳性：当质控线(C)显示出红色条带，而检测线(T)不显色或(T)线颜色浅于(C)线时，判为阳性。

无效：当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的奥芬达唑单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试纸条检测奥芬达唑的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为奥芬达唑半抗原合成图。

图2为试纸剖面结构示意图。

图3为微孔试剂图。

图4为试纸条检测结果判定图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1检测奥芬达唑的试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被有奥芬达唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸；

4)将1)和3)制备好的冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、奥芬达唑半抗原的合成(合成路线见附图1)

取奥芬达唑EP杂质C 2.57g，加甲醇200mL溶解，室温搅拌下加对羧基苯甲醛1.8g，加吡啶2mL，60℃加热反应4h，停止反应，冷却到室温，加硼氢化钠0.76g，室温搅拌2h，停止反应，旋蒸除去甲醇和吡啶，加水200mL，加1mol/L盐酸调节pH值到6，有大量不溶固体析出，室温静置2h，抽滤，固体加无水乙醇100mL充分打浆，抽滤，除去乙醇，重复一次，得到白色固体化合物1.76g，即为奥芬达唑半抗原，收率45％。

2、免疫原的制备

取奥芬达唑半抗原14.6mg，加2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解澄清，加N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)6.44mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)10.75mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)500mg，加0.1mol/LpH9.5的CB缓冲液4mL溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，用0.02mol/L PBS缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到奥芬达唑半抗原-BSA偶联物，即为免疫原。

3、包被原的制备

取奥芬达唑半抗原17.39mg，加3mL DMF溶解澄清，加NHS 10mg、EDC 12.78mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白(OVA)100mg，加0.1mol/LpH9.5的CB缓冲液9mL溶解，得到B液；将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，用0.02mol/L PBS缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到奥芬达唑半抗原-OVA偶联物，即为包被原。

4、奥芬达唑单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的pH为7.4。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5mL 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。

(2)奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入5～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述奥芬达唑单克隆抗体，继续搅拌混匀30min；静置10min后加入10％BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含BSA的质量分数为0.1％～0.5％、蔗糖的质量分数为2％～4％、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

7、微孔试剂的制备

向微孔试剂微孔板中加入100μL奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到冻干有奥芬达唑单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。

8、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、pH为7.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用。

9、反应膜的制备

将奥芬达唑半抗原-OVA偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸缓冲液将奥芬达唑半抗原-OVA偶联物稀释到1mg/mL，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用。

10、试纸条的组装

根据附图2所示试纸剖面结构，将样品吸收垫(1)、反应膜(2)、吸水垫(3)依次按顺序粘贴在PVC底板(6)上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(4)和质控线(5)，检测线(T线)和质控线(C线)均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线位于靠近样品吸收垫的末端的一侧；质控线位于远离样品吸收垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3.95mm宽的小条。

根据附图3所示微孔试剂图，微孔试剂7上具有微孔塞8。

将上述试纸与微孔试剂组装成试纸条，在2～8℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例2液体乳中奥芬达唑的检测

1、样本前处理

样本恢复至室温后直接检测，待检样本必须为均匀液体，不能有结块、发酸或沉淀。

2、用试纸条检测

用微量移液器吸取200μL待测样本液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；35℃孵育5min后，将试纸条插入微孔中；液体流动开始计时，反应5min，判定结果。

3、分析检测结果

阴性(－)：T线显色比C线显色深或与C线显色一致，表示样品中奥芬达唑浓度低于检测限，如图4a、4b。

阳性(+)：T线显色比C线显色浅或T线不显色，表示样品中奥芬达唑浓度等于或高于检测限，如图4c、4d.

无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图4e、4f。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本，在其中分别添加奥芬达唑至终浓度为5μg/L、10μg/L、20μg/L，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本时，当其中无奥芬达唑和其添加浓度为5μg/L时，试纸条上显示出T线显色比C线显色深或与C线显色一致，呈阴性；当其中奥芬达唑添加浓度为10μg/L、20μg/L时，试纸条上显示出T线显色比C线显色浅或T线不显色，呈阳性，表明本试纸条对液体乳中奥芬达唑的检测限为10μg/L。

2、假阳性率、假阴性率试验

取空白生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本及添加奥芬达唑至终浓度为10μg/L的阳性生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本各20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测空白生乳、巴氏杀菌乳、UHT灭菌乳样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测奥芬达唑的试纸条可以对液体乳中奥芬达唑残留进行快速检测。

3、特异性试验

用本试纸条检测500μg/kg丙硫咪唑亚砜、甲苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、丙氧基咪唑等其他苯并咪唑类药物时，试纸条上显示出T线显色比C线显色浅或T线不显色，呈阳性，交叉反应率仅为2％，说明本试纸条对这些类似药物交叉反应较小，特异性良好。