一种贵金属-过渡金属复合催化剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，具体涉及一种贵金属-过渡金属复合催化剂及其制备方法和应用。

背景技术

原发性和转移性恶性黑色素瘤可通过显示低免疫原性、分泌免疫抑制细胞因子和导致耐受途径死亡来维持免疫功能失调的微环境。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,TAMs)以免疫抑制(M2)为主，这是驱动免疫抑制肿瘤微环境的关键因素之一。免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death,ICD)是一种针对死亡或濒死肿瘤细胞抗原引起免疫反应的特定细胞死亡方式。各种治疗方式，如化疗、放疗和光动力疗法(PDT)等均已被用于诱导ICD，其能触发损伤相关分子(DAMPs)的释放。这些释放或暴露的信号可以介导树突状细胞(DCs)的成熟和迁移，随后启动抗肿瘤适应性免疫反应。据报道，内质网应激(ER)和活性氧(ROS)的产生对于激活调控ICD的细胞内信号通路至关重要。

化学动力治疗(CDT)是利用肿瘤微环境(TME)的酸性和过氧化氢(H

近年来，许多类型的ROS催化纳米剂被发现对CDT过程具有高效的催化活性，如贵金属纳米材料、金属氧化物和金属有机框架材料，它们可以通过现有的自然途径催化氧气和H

发明内容

本发明的目的在于提供一种贵金属-过渡金属复合催化剂及其制备方法和应用。

本发明提供了一种复合催化剂，它是以铂盐和过渡金属氧化物为原料制备得到的复合材料，所述铂盐和过渡金属氧化物的质量比为(10-15)：100。

进一步地，所述铂盐为四价铂盐；和/或，所述过渡金属氧化物为钨的氧化物；和/或，所述铂盐和过渡金属氧化物的质量比为(12-13)：100。

进一步地，所述四价铂盐为四氯化铂；和/或，所述钨的氧化物为W

进一步地，所述W

进一步地，所述海参样W

本发明还提供了一种制备上述复合催化剂的方法，所述方法包括以下步骤：将过渡金属氧化物和铂盐分散于乙醇溶液，在室温下反应10-14h，离心，取沉淀洗涤，干燥，得到复合催化剂。

本发明还提供了上述复合催化剂在制备生成活性氧的拟酶催化剂中的用途。

进一步地，所述拟酶催化剂是治疗原发或转移性肿瘤的药物。

进一步地，所述肿瘤为黑色素瘤。

本发明还提供了一种治疗原发或转移性肿瘤的联合用药物，它含有相同或不同规格单位制剂的用于同时或者分别给药的上述复合催化剂和免疫检查点阻断药物，以及药学上可接受的载体。

进一步地，所述免疫检查点阻断药物为抗PD-L1抗体。

W

本发明以3D海参样W

WOx-Pt表现出优异的POD酶和OXD酶模拟活性，具有超强的ROS生成能力。

体外实验表明，WOx-Pt处理能够诱导内质网应激和ER相关的细胞凋亡。

体内实验表明，WOx-Pt可通过诱导ICD、促进T细胞浸润和DC成熟、刺激炎症因子释放等途径显著增强肿瘤的免疫原性，激活免疫反应，与免疫检查点阻断药物协同抑制原发和转移性肿瘤。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1.WOx-Pt的合成路线示意图。

图2.WOx-Pt的SEM图像(a)和TEM图像(b,c)；WOx-Pt的HAADF-STEM图像(d,e)；e中区域对应的强度剖面(f)；原子结构示意图叠加在HAADF-STEM图像上的图片(g)。HAADF-STEM图像和WOx-Pt的相关元素映射图像(h，i)。比例尺，500纳米。

图3.WOx和WOx-Pt的XRD谱图

图4.WOx-Pt的XPS表征结果：测量光谱(a)；Pt 4f(b)、w4f(c)和o1s(d)的高分辨率区域；对应于d的W价态分布比例(e)。

图5.WOx和WOx-Pt的EPR光谱图。

图6.(a)在H

图7.WOx-Pt体外诱导的特异性内质网应激测试结果。(a-c)用不同浓度的PBS、WOx和WOx-pt处理B16/F10细胞12小时后，Western blot分析caspase-3和CHOP(C/ebp同源蛋白-10)蛋白的表达，所有数据均以均数±标准差表示，采用双侧Student's t检验计算两组间的统计学差异；(d)WOx-Pt诱导B16/F10细胞内质网应力的TEM图像(左:比例尺＝2μm，右:比例尺＝500nm)，红色箭头表示扩大的ER室。

图8.(a)B16/f10荷瘤小鼠系统抗肿瘤免疫应答机制实验设计示意图；(b)整个治疗过程后各组肿瘤的照片；(c)PBS、WOx-Pt、抗PD-L1和WOx-Pt+抗PD-L1处理B16/F10荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线；(d，g)F4/80

图9.(a)肿瘤浸润CD4

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1：制备刺状WOx-Pt催化剂

合成路线示意图如图1所示。

1.刺状WOx的合成

采用溶剂热法合成刺状WOx。将127mg六羰基钨溶(W(CO)

2.刺状WOx-Pt催化剂的合成

将上述溶剂热法制得的100mg刺状WOx重新分散于30mL乙醇溶液中后加入12.7mg四氯化铂(PtCl

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1：刺状WOx-Pt催化剂的表征及结构测试

1、实验方法

(1)扫描电子显微镜(SEM)图像是使用Apreo S HiVoc(赛默飞世尔科学公司，FEI)采集的。

(2)透射电镜(TEM)、像差校正高角度环形暗场扫描TEM(AC HAADF-STEM)和能谱(EDS)作图采用美国FEI有限公司200kv的Talos F200xTEM显微镜，GMS-freeanalysis分析。

(3)X射线衍射(XRD)图采用DX-2700BH型多用途x射线衍射仪(昊源仪器)，在40kv电压下进行Cu辐射。样品在5°到80°的2θ范围内进行扫描。

(4)X射线光电子能谱(XPS)采用K-Alpha

(5)电子顺磁共振(EPR)光谱测量是通过Bruker EPR EMX Plus(美国Bruker北京科技有限公司)以9.8GHz的频率(微波功率：1mW)进行的。

2、实验结果

通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电镜(TEM)测量发现，WOx-Pt具有良好的海胆样结构，边缘纳米线略有收缩，颜色为灰褐色而不是W

本发明进一步通过X射线衍射(XRD)对WOx-Pt的晶体结构进行了研究，如图3所示。WOx-Pt显示出清晰的单斜W

在确认晶体结构后，本发明利用X射线光电子能谱(XPS)研究了WOx-Pt的化学组成和价电子态。XPS测量光谱(图4a)显示了WOx-Pt复合材料中C、O、W和Pt元素的存在。Pt 4fXPS谱显示了两对峰(图4b)，其中71.6eV和74.8eV处的主峰可归属于Pt

实验例2：刺状WOx-Pt催化剂的POD酶和OXD酶样活性测试

1、实验方法

(1)过氧化物酶(POD)活性用比色法测定。将催化剂5μL(4mg·mL

(2)氧化酶(OXD)活性测试方法与过氧化物酶活性测试方法相似，区别在于不存在H

(3)二氢乙锭(HE)法测定·O

(4)二苯胺(DPA)法测定

2、实验结果

本实验采用经典的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)比色法测试了WOx-Pt催化剂产生ROS的过氧化物酶样和氧化酶样活性。在H

此外，本发明将WOx-Pt的催化活性与最近报道的类似模拟物(包括金属氧化物、金属纳米颗粒、单原子酶模拟物和金属有机框架)进行了比较。结果显示，WOx-Pt表现出极高的V

为了阐明WOx-Pt生物催化剂的催化机理，本发明通过自由基猝灭实验和荧光检测探针实验确定了自由基产物的类型。·O

上述实验结果表明，本发明提供的WOx-Pt催化剂表现出优异的POD酶和OXD酶模拟活性，具有超强的ROS生成能力。

实验例3：刺状WOx-Pt催化剂体外诱导的特异性内质网应激

1、实验方法

(1)蛋白印迹分析：

用不同浓度的PBS、WOx和WOx-pt处理B16/F10细胞12小时后，Western blot分析caspase-3和CHOP(C/ebp同源蛋白-10)蛋白的表达。具体操作如下：将不同浓度的WOx(100μg/mL)和WOx-Pt(20,50,80或100μg/mL)处理后的B16/F10细胞提取总蛋白，然后通过6-12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Beyotime，China)上。用含有5％脱脂奶粉的TBST封闭后，将PVDF膜与一抗(β-actin，CHOP，cleaved-caspase-3，pro-caspase-3和CRT)在4℃共孵育过夜。然后，通过TBST洗涤印迹三次，与适当的辣根过氧化物酶缀合的二抗孵育60分钟。使用自动化学发光分析系统显现每组的特异性蛋白。最终通过Image J软件量化蛋白印迹的强度。

(2)生物电镜样本制备：

将B16/F10细胞接种到6cm细胞培养皿中，随后分别使用PBS或50μg/mL WOx-Pt处理。12小时后将细胞消化并离心，使用2.5％戊二醛重悬细胞，固定3小时，随后进行TEM电镜拍摄。

2、实验结果

CHOP是内质网应激后过表达的促凋亡蛋白。结果显示，PBS处理细胞对CHOP活化影响较小，而不同浓度的WOx-Pt可不同程度上调CHOP蛋白表达(图7a、b)。50μg/mL的WOx-Pt可显著上调CHOP蛋白表达，说明WOx-Pt处理后细胞存在严重的内质网应激和ER相关的细胞凋亡。另外，所有处理组均激活了线粒体凋亡蛋白Caspase-3，而50μg/mL的WOx-Pt诱导了最高水平的切割Caspase-3和最低水平的切割Caspase-3(作为切割Caspase-3的前体，pro-caspase-3需要经过切割成为切割Caspase-3才能具有生物活性)(图7a,c)。上述结果表明，内质网应激与线粒体之间存在串扰，内质网应激能够诱导线粒体相关细胞死亡。

同时，本实验通过对不同处理方式的细胞样品进行透射电镜观察发现，50μg/mLWOx-Pt处理显著扩大了B16/F10细胞的内质网腔室(箭头所示)，进一步表明了最明显的内质网应激状态(图7d)。

上述实验结果表明，WOx-Pt处理能够诱导内质网应激和ER相关的细胞凋亡。

实验例4：刺状WOx-Pt催化剂在免疫抗肿瘤中的应用

1、实验方法

(1)荷瘤小鼠(B16/F10细胞)免疫治疗效果验证：

将B16/F10细胞以1×10

Control组：荷瘤小鼠瘤内注射PBS，每2天注射一次，共注射3次；

anti-PD-L1组：荷瘤小鼠腹腔注射anti-PD-L1(100μg/只)，每2天注射一次，共注射3次；

WOx-Pt组：荷瘤小鼠瘤内注射WOx-Pt(10mg/kg)，每2天注射一次，共注射3次；

WOx-Pt+anti-PD-L1组：荷瘤小鼠瘤内注射WOx-Pt(10mg/kg)，在WOx-Pt处理的间隔同时给小鼠腹腔注射anti-PD-L1(100μg/只)，每2天注射一次，共注射3次。

每天监测肿瘤大小和体重。使用卡尺测量肿瘤大小，以长×宽

(2)肿瘤浸润淋巴细胞分析：

治疗结束后将每只小鼠的肿瘤取出并切成小块，然后研磨成组织匀浆。在裂解红细胞并离心后，用荧光标记的流式抗体标记所获得的单细胞。然后通过流式细胞术分析肿瘤内浸润淋巴细胞的情况。anti-CD3-PE，anti-CD4-APC/Cy7，anti-CD8-FITC，anti-F4/80-APC，anti-CD80-FITC，anti-CD206-PerCP/Cy5.5，anti-CD45-PE/Cy7 anti-CD62L-PerCP/Cy5.5，anti-CD44-APC等抗体均根据说明书稀释后使用。

2、实验结果

本实验评估了WOx-Pt与免疫检查点阻断药物(抗PD-L1抗体，又称anti-PD-L1)在全身抗肿瘤免疫治疗中的协同作用(图8a)。如图8b、c所示，WOx-Pt治疗在初始阶段成功抑制了原发肿瘤，这归因于充分的ICD诱导和抗肿瘤免疫的激活。但随着病程延长，单纯WOx-Pt处理无法达到理想的治疗效果(治疗结束后肿瘤体积为451.78mm

表1.图8c中各组治疗后的肿瘤组织平均体积数据

表2.图8e中各组治疗后第7天切除的肿瘤组织平均重量数据

接下来，本实验通过对白细胞的浸润分析，研究了WOx-Pt诱导全身抗肿瘤免疫的机制。众所周知，CD8

为了进一步验证使用WOx-Pt的优势，本实验评估了WOx-Pt将肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)从促瘤M2表型重新编程为抑瘤M1表型的作用。结果显示，WOx-Pt单独治疗后的M1巨噬细胞比例增加(对照组为17.2％，WOx-Pt组为31.5％)，M2巨噬细胞比例减少(对照组为52.1％，WOx-Pt组为45.6％)，与抗PD-L1单独治疗组相比无显著差异，这可能是由于产生ROS的作用。但是，与对照组相比，WOx-Pt+抗PD-L1组M1巨噬细胞的百分比显著增加(达67.7％)，M2巨噬细胞的百分比显著降低(降至6.81％)(图8d和图9b,9c)。这些结果归因于WOx-Pt产生ROS和诱导ICD的作用以及免疫检查点阻断的协同作用整合改善了免疫微环境，使TAMs向杀伤肿瘤的M1表型重新编程，从而增强抗肿瘤作用。

本领域公知的，细胞毒性T淋巴细胞可释放干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)促进免疫微环境。本实验接下来研究了B16/F10皮下肿瘤中TNF-α阳性的CD3

本实验还用流式细胞术检测了肿瘤引流淋巴结中树突状细胞成熟的诱导情况。成熟的树突状细胞(DCs)以CD11c

上述结果表明，基于优异的多酶模拟催化行为，WOx-Pt可通过诱导ICD、促进T细胞浸润和DC成熟、刺激炎症因子释放等途径显著增强肿瘤的免疫原性，激活免疫反应，与免疫检查点阻断药物协同抑制原发和转移性肿瘤。