一种与鸡屠体性状相关的PDK4基因分子标记及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与鸡屠体性状相关的PDK4基因分子标记及应用。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸的插入、缺失、颠换和转换等而引起的基因组DNA序列的多态性。SNP是动物可遗传变异中最常见的一种，在动物基因组中广泛存在，具有稳定遗传，易于检测等特性。在动物生产实践中，SNP可用于分子标记辅助选择(Molecular Mark-assist Selection，MAS)从而突破传统育种的瓶颈来提高选种的准确性和目标性状的选育效果。

丙酮酸脱氢激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)是线粒体酶，能够编辑组氨酸激酶的结构域和抑制丙酮酸脱氢酶复合物活性，从而抑制丙酮酸脱氢酶复合物催化丙酮酸氧化脱羧，使乙酰辅酶A无法形成。PDK4在各种代谢中发挥重要作用，现有研究揭示了PDK4基因在骨骼肌中表达水平较高，也表明人在运动后骨骼肌中PDK4 mRNA表达量显著增加。有实验小组通过m6A测序和研究PDK4基因的功能，发现PDK4参与ATP的形成和参与m6A调节的糖酵解。骨骼肌中PDK4 mRNA表达的变化与胰岛素敏感性的改善有关，全身葡萄糖摄取与骨骼肌中PDK4 mRNA表达之间存在显著的负相关。因此PDK4抑制剂具有改善胰岛素抑制，降低血糖，有望用于治疗糖尿病。目前已经有研究表明PDK4在糖脂代谢中发挥重要作用。

并未有相关研究报道，禽类PDK4基因上有无与鸡屠体性状显著相关的SNP位点。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种与鸡屠体性状相关的PDK4基因分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，发现PDK4基因外显子区的SNP位点，并将其与鸡的屠体性状关联分析，为MAS提供新的SNP分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了一种与鸡屠体性状相关的分子标记，所述分子标记位于鸡PDK4基因上，所述PDK4基因的登录号为GeneID：420570，所述分子标记包括SNP1～SNP6，其中，SNP1为如SEQ ID NO.1所示序列存在NC_052533.1:g847G>A；SNP2为如SEQ IDNO.1所示序列存在NC_052533.1:g1045C>T；SNP3为如SEQ ID NO.1所示序列存在NC_052533.1:g1078G>C；SNP4为如SEQ ID NO.1所示序列存在NC_052533.1:g1155G>A；SNP5为如SEQ ID NO.1所示序列存在NC_052533.1:g1235A>T；SNP6为如SEQ ID NO.1所示序列存在NC_052533.1:g1243C>T。

优选的，所述SNP1存在基因型AA、AG和GG；所述SNP2存在基因型TT、TC和CC；所述SNP3存在基因型CC、GC和GG；所述SNP4存在基因型AA、AG和GG；所述SNP5存在基因型AA、AT和TT；所述SNP6存在基因型CC、CT和TT。

本发明还提供了一种根据所述的分子标记鉴别鸡屠体性状的方法，包括以下步骤：

(1)以待测鸡基因组DNA为模板，利用引物扩增包括所述分子标记的基因片段，获取扩增产物；

(2)对所述扩增产物测序，检测相应的核苷酸多态性位点的基因型，根据检测的基因型判断待测鸡的屠体性状；

其中，在SNP1中，GG基因型个体表现为宰前活重、屠体重、脚重和头重最高，GA基因个体表现为胸肌重、全净膛重和半净膛重最高；在SNP2中，TT基因型个体表现为腹脂率最低；在SNP3中，CC基因型个体表现为腿比率最高；在SNP4中，AA基因型个体表现为宰前活重、屠体重、屠宰率、全净膛重、半净膛重、胸肌重、脚重和头重最高，且腹脂率最低，GA基因型个体表现为全净膛率最高；在SNP5中，TT基因型个体表现为胸肌重最高；在SNP6中，TT基因型个体表现为胸肌率最高。

优选的，在步骤(1)中，所述引物包括如SEQ ID NO.2所示序列的上游引物和如SEQID NO.3所示序列的下游引物。

优选的，在步骤(1)中，所述扩增的扩增反应体系为：模板DNA 2μL、2×Es TaqMasterMix 20μL、上游引物1.6μL、下游引物1.6μL、ddH

优选的，在步骤(1)中，所述扩增的扩增反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61.1℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃最终延伸2min；12℃保存。

优选的，所述屠体性状包括：宰前活重、屠体重、屠宰率、全净膛重、全净膛率、半净膛重、半净膛率、胸肌重、胸肌率、腿比率、头重、脚重和腹脂率。

本发明还提供了所述的分子标记在鸡育种中的应用。

优选的，应用于鸡屠体性状的选育中。

优选的，应用于麻黄鸡屠体性状的选育中。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

本发明通过分析PDK4基因，发现该基因有多个与鸡屠体性状显著相关的SNP位点，为MAS提供新的SNP分子标记。实验结果表明，分子标记NC_052533.1:g847G>A位点与鸡的宰前活重、屠体重、脚重、头重、胸肌重、全净膛重和半净膛重存在显著相关，其中GG野生纯合基因型个体的宰前活重、屠体重、脚重和头重显著高于AA突变纯合基因型个体，GA杂合基因型个体的胸肌重、全净膛重和半净膛重显著高于AA突变纯合基因型个体；

分子标记NC_052533.1:g1045C>T位点与鸡的腹脂率存在显著相关，其中，TT突变纯合基因型个体的腹脂率显著低于CT杂合基因型个体和CC野生纯合基因型个体；

分子标记NC_052533.1:g1078G>C位点与鸡的腿比率存在显著相关，其中，CC突变纯合基因型个体腿比率显著高于GG野生纯合基因型个体；

分子标记NC_052533.1:g1155G>A位点与鸡的宰前活重、屠体重、屠宰率、全净膛重、全净膛率、半净膛重、半净膛率、胸肌重、脚重、头重和腹脂率存在显著相关，其中AA突变纯合基因型个体的宰前活重、屠体重、屠宰率、全净膛重、半净膛重、胸肌重、脚重、头重显著高于GG野生纯合基因型个体，GA杂合基因型个体的全净膛率显著高于GG野生纯合基因型个体，GG野生纯合基因型个体的腹脂率显著高于GA杂合基因型个体和AA突变纯合基因型个体；

分子标记NC_052533.1:g1235A>T位点与鸡的胸肌重存在显著相关，其中，TT突变纯合基因型个体的胸肌重显著高于AT杂合基因型个体；

分子标记NC_052533.1:g1243C>T位点与鸡的胸肌率存在显著相关，其中，TT突变纯合基因型个体的胸肌率显著高于CT杂合基因型个体。可见，本发明提供的分子标记可以准确的鉴定鸡屠体性状，从而为鸡的选育提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为PDK4引物配对位置及产物长度示意图；

图2为PDK4基因SNP位点基因型分型图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1材料与方法

1.1动物样品

试验动物为510只80日龄麻黄鸡，通过采集皮下静脉血液2mL，-80℃保存，用作提取DNA的血液样本。同时记录选择群体的皮下脂肪厚、肌间脂肪宽、全净膛重、半净膛重、腹脂重、腿重、胸肌重、胸肌率、腿比率、腹脂率、半净膛率、全净膛率、瘦肉率和屠宰率屠体性状。

1.2主要试剂

血液样本DNA提取试剂盒(品牌：OMEGA；货号：D3392；广州飞扬生物工程有限公司)、2×Es Taq MasterMix(Dye)(品牌：康为；货号：CW0690M；康为世纪生物科技股份有限公司)、DNA marker(品牌：诺维赞；货号：MD101；江苏诺维赞生物科技股份有限公司)、高纯度低电渗琼脂糖(品牌：擎科；货号：TSJ001；北京擎科生物科技有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1引物设计

根据NCBI公布的红色原鸡(Gallus)PDK4基因的序列(GeneID:420570)，使用NCBI的Primer-BLAST工具设计引物，由广州擎科生物科技有限公司提供引物合成服务。引物序列相关信息如表1所示，引物在PDK4基因上的配对位置如图1所示。

表1 PCR扩增引物序列

1.3.2血液样本DNA提取

参照血液样本DNA提取试剂盒操作手册提取血液样本DNA。

1.3.3 PDK4基因序列的PCR扩增

以上述510个个体血样基因组DNA作为模板，遵循以下反应体系进行：模板DNA 2μL、2×Es Taq MasterMix(Dye)20μL、上游引物1.6μL、下游引物1.6μL、ddH

反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，61.1℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃最终延伸2min；12℃保存。PCR产物交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行纯化和测序。

1.3.4 SNP确定与基因分型

利用通过DNAstar软件的SeqMan工具对PCR产物的Sanger测序结果进行序列峰图的分析以确定潜在SNP位点，并通过该工具比对每个样本的测序数据，进行基因分型。

1.3.5基因型与屠体性状关联分析

SNP位点与基因型对应个体的屠体性状数据，采用SAS 9.4 GLM程序包进行关联分析。

2结果

2.1 PDK4基因外显子序列PCR扩增及SNP筛选

选取麻黄鸡510个个体的血样DNA为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物(如SEQIDNO.1所示)进行Sanger测序，将测序后的峰图进行比对分析，共检测到9个SNP位点，其中6个位点与鸡屠体性状关联，分别为：NC_052533.1:g847G>A、NC_052533.1:g1045C>T、NC_052533.1:g1078G>C、NC_052533.1:g1155G>A、NC_052533.1:g1235A>T、NC_052533.1:g1243C>T，如图2所示。

PCR产物(SEQ ID NO.1)：

注：序列中加粗带下划线位置为SNP位点，其中，SNP1位于SEQ ID NO.1所示序列的第47位，存在G＞A突变，SNP2位于SEQ ID NO.1所示序列的第1045位，存在C＞T突变，SNP3位于SEQ ID NO.1所示序列的第1078位，存在G＞C突变，SNP4位于SEQ ID NO.1所示序列的第1155位，存在G＞A突变，SNP5位于SEQ ID NO.1所示序列的第1235位，存在A＞T突变，SNP6位于SEQ ID NO.1所示序列的第1243位，存在C＞T突变。

2.2 PDK4基因外显子序列SNP位点与屠体性状的关联分析

对上述6个SNP位点与屠体性状(宰前活重、屠体重、屠宰率、全净膛重、全净膛率、半净膛重、半净膛率、胸肌重、胸肌率、腿比率、头重、脚重、腹脂率)进行关联分析。

表2 NC_052533.1:g847G>A位点与屠体性状关联

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如表2所示，结果显示，NC_052533.1:g847G>A位点与鸡的宰前活重、屠体重、脚重、头重、胸肌重、全净膛重、半净膛重存在显著相关(p<0.05)，其中，GG野生纯合基因型个体的宰前活重、屠体重、脚重、头重显著高于AA突变纯合基因型个体(p<0.05)，GA杂合基因型个体的胸肌重、全净膛、半净膛显著高于AA突变纯合基因型个体(p<0.05)。

表3 NC_052533.1:g1045C>T位点与屠体性状关联

如表3所示，NC_052533.1:g1045C>T位点与鸡的腹脂率存在显著相关(p<0.05)。其中TT突变纯合基因型个体的腹脂率显著低于CT杂合基因型个体和CC野生纯合基因型个体(p<0.05)。

表4 NC_052533.1:g1078G>C位点与屠体性状关联

如表4所示，NC_052533.1:g1078G>C位点与鸡的腿比率存在显著相关(p<0.05)。其中CC突变纯合基因型个体腿比率显著高于GG野生纯合基因型个体(p<0.05)。

表5 NC_052533.1:g1155G>A位点与屠体性状关联

注：a，b，c不同肩标小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

如表5所示，分子标记NC_052533.1:g1155G>A位点与鸡的宰前活重、屠体重、屠宰率、全净膛重、全净膛率、半净膛重、胸肌重、脚重、头重存在显著相关(p<0.05)，其中，AA突变纯合基因型个体的宰前活重、屠体重、屠宰率、全净膛重、半净膛重、胸肌重、脚重、头重显著高于GG野生纯合基因型个体(p<0.05)；GA杂合基因型个体的全净膛率显著高于GG野生纯合基因型个体(p<0.05)；GG野生纯合基因型个体的腹脂率显著高于GA杂合基因型个体和AA突变纯合基因型个体(p<0.05)。

表6 NC_052533.1:g1235A>T位点与屠体性状关联

注：a，b不同肩标小写字母表示差异显著(P＜0.05)。

如表6所示，分子标记NC_052533.1:g1235A>T位点与鸡的胸肌重存在显著相关(p<0.05)。其中TT突变纯合基因型个体的胸肌重显著高于AT杂合基因型个体(p<0.05)。

表7 NC_052533.1:g1243T>C位点与屠体性状关联

如表7所示，分子标记NC_052533.1:g1243C>T位点与鸡的胸肌率存在显著相关(p<0.05)。其中TT突变纯合基因型个体的胸肌率显著高于CT杂合基因型个体(p<0.05)。

除上述6个SNP位点外，扩增片段内其他位点与屠体性状关联性均未达到显著水平(p>0.05)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。