特女贞苷在制备治疗绝经后骨质疏松药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物应用技术领域，尤其涉及特女贞苷在制备治疗绝经后骨质疏松药物中的应用。

背景技术

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是指绝经后女性因雌激素水平下降等原因，导致骨的微观结构破坏、骨量减少、骨强度降低，临床上以驼背、全身骨痛及易于骨折为主要表现的原发性骨质疏松。在绝经期早期，单纯使用抗骨吸收药物能够达到骨保护的目的，但在绝经期晚期，需要同时使用促骨合成药物长期治疗才能部分缓解骨丢失。绝经后骨质疏松症的诊疗指南推荐的治疗方案主要包括运动疗法、物理治疗和药物治疗。药物疗法主要有抑制骨吸收的药物如：雌激素、降钙素、双腾酸盐类等；以及促进骨形成的药物如：氟化物、生长激素、维生素K等。因此，新药的研发迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供特女贞苷在制备治疗绝经后骨质疏松药物的应用，所述特女贞苷通过RANKL/RANK信号通路发挥作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了特女贞苷在制备提高成骨细胞矿化能力药物中的应用。

特女贞苷在制备提高骨细胞形成因子转录水平的试剂中的应用。

优选的，所述骨细胞形成因子包括ALP，Runx2、Osterix和OPG/RANKL。

本发明还提供了特女贞苷在制备抑制破骨细胞相关因子c-FOS、NFATc1、MMP9和CTSK表达试剂中的应用。

优选的，根据权利要求2～5中任意一项应用，其特征在于，所述特女贞苷的使用浓度为5～10μM。

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明通过试验证明特女贞苷能够促进相关成骨因子RUNX2、Osterix、ALP、OPG/RANKL的表达，并抑制抑制破骨细胞相关因子c-FOS、NFATc1、MMP9和CTSK表达，说明特女贞苷通过RANKL/RANK信号通路起到对绝经后骨质疏松症的防治作用，为制备绝经后骨质疏松的药物提供了新思路。

附图说明

图1为特女贞苷与RANK结合亲和力拟合图；

图2为特女贞苷与RANK对接结果图；

图3为实施例2的1中特女贞苷处理于21d后进行茜素红染色，在10μM浓度下，矿化结节增多，特女贞苷增强成骨细胞的矿化能力(A)并进行半定量结果(B)；*P＜0.05；

图4为实施例2的2中特女贞苷处理72h后Runx2、ALP、Osterix，OPG/RANKL mRNA表达水平；

图5为实施例2的3中干预72h后检测ALP，Osterix，Runx2，OPG/RANKL蛋白表达水平；(A)为72h后Western Blot检测Runx2、ALP、Osterix、OPG/RANKL蛋白表达水平的变化；(B-E)为半定量分析结果，与control组比较，*p＜0.05，**p＜0.01，***P＜0.001。

图6为实施例3的1中RANKL 50ng/mL诱导后，特女贞苷干预72h后c-FOS、NFATc1、MMP9、CTSKmRNA表达水平的变化；与OVX组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；

图7为实施例3的2中，RANKL 50ng/mL诱导后，特女贞苷干预72h后TRAF6、c-fos、NFATc1、PI3K/AKT的蛋白表达水平(A、E)以及半定量分析(B-D、F-G)，与control组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；

图8为实施例4的1中，干预12周后，SHAM、OVX、OVX-EV、OVX-specnue-low、OVX-specnue-high组骨组织Masson染色观察大鼠胫骨干骺端骨组织学结构；

图9为实施例4的2中，microCT扫描下，不同组别大鼠胫骨干骺端骨组织的微观结构；

图10为实施例4的2中，不同组别大鼠胫骨干骺端骨组织的微观参数；

图11为实施例4的3中，不同组别大鼠血清内骨吸收指标及炎症指标的变化；a:与OVX组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；b:与SHAM组相比，###P＜0.001；

图12为实施例4的4中，不同组别大鼠股骨Runx2、OPG/RANKL、Osterix转录水平的变化，a:与OVX组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；b:与SHAM组相比，###P＜0.001；

图13为实施例4的5中，不同组别大鼠NFATc1、c-FOS、TRAF6转录水平的变化；a:与OVX组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；b:与SHAM组相比，##P＜0.05，###P＜0.001；

图14为实施例4的6中，不同组别大鼠股骨破骨相关蛋白的变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1特女贞苷亲和动力学分析

精密称取特女贞苷对照品适量，用DMSO配制成母液浓度10mM，取5μL对照品母液，加入95μLPBS1×和900μL含5％DMSO的PBS溶液的混匀，配置成溶液浓度为50μM的含5％DMSO的PBS溶液。根据表1，进行溶剂校正溶液的配制，分别配制含4.5％DMSO和5.8％DMSO的PBS溶液。

表1溶剂校正溶液的配制

特女贞苷的SPR亲和力KD分析

依次配制浓度为12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.5625μM、0.7813μM、0.3906μM、0.1953μM、0.0977μM、0.0488μM、0μM的含5％DMSO的PBS的供试品溶液。使用Biacore T200(美国General Electric Company)进行亲和力分析；亲和力分析参数设置：Flow path：2-1，Chiptype：CM5，ontact time：180s。Flow rate：30μL/min，Dissociation time：300s，温度：25℃。特女贞苷与RANK结合亲和力拟合图如图1所示。从图1可以看出，通过计算机拟合得到特女贞苷与RANK蛋白的解离平衡常数KD值为3.04μM。

实施例1特女贞苷与RANK的分子对接印证

特女贞苷与RANK进行分子对接印证，使用软件PyMoL2.3.4确定了它们的结合模式，特女贞苷3D小分子配体与蛋白受体RANK的相互作用图如图2所示，其中，黄色虚线表示氢键的形成，特女贞苷与HIS-394、ARG-392、GLU-607、GLN-396、ARG-402氨基酸残基形成稳定的氢键作用，化合物与受体的亲和力为-6.6kacl/mol，也即，特女贞苷与RANK有较好的结合能力。

实施例2特女贞苷对成骨细胞形增殖和分化的影响

1.茜素红染色观察特女贞苷对成骨细胞矿化能力的影响

原代成骨细胞培养：

选择出生72h SD乳鼠，提取颅骨成骨细胞。快速脱颈处死后，用75％乙醇消毒后，移入生物安全柜内，剪断颈部，分离头盖骨，浸泡在PBS里面，剪刀镊子在酒精灯上灼烧，冷却后将头盖骨表面的组织清除干净；转置新的培养皿中，将头盖骨尽量剪碎，弃去PBS加入6mL胰酶，37℃培养箱消化10min后，移液枪吹打，弃去胰酶，加入6mL0.2％Ⅰ型胶原酶，再次放入培养箱消化30min，中间每隔10min吹打混匀一次，60min后，将胶原酶液收集到离心管中，12000rpm离心3min。离心后能看到沉淀。弃去上清，用α-MEM(已加10％FBS+1％青链霉素)重悬，放入培养箱培养12h，培养后可看到细胞贴壁为梭形，锥形和多边形。培养箱内培养12h，换液，PBS清洗后继续培养，每天观察状态。细胞汇合率达90％以上，可以进行细胞传代；传至第三代备用。

选取原代颅骨源性成骨细胞，特女贞苷5μM和10μM干预成骨细胞，处理21d后进行茜素红染色，染色结果如图3中A所示。由图可知，在10μM浓度下，细胞的矿化结节增多，说明特女贞苷增强成骨细胞的矿化能力。对特女贞苷0μM、5μM、10μM成骨细胞进行21d的培养，培养期间3d换液一次，共七次，培养结束后进行茜素红染色并进行半定量分析，结果如图3中B所示，说明特女贞苷增强成骨细胞的矿化能力。

2.特女贞苷促进成骨细胞形成相关因子mRNA的表达

为了进一步验证在茜素红染色观察到的促进成骨作用，在分子水平进行相关基因的检测。特女贞苷5μM和10μM处理颅骨源性成骨细胞，72h后，qPCR分别检测RUNX2、Osterix、ALP、OPG/RANKLmRNA表达水平的变化，检测结果如图4所示，ALP，Runx2、OsterixmRNA和OPG/RANKL的比值升高，且在10μM更为显著，说明特女贞苷能调控成骨形成相关因子的转录水平。

3.特女贞苷促进成骨细胞形成相关因子的蛋白表达

特女贞苷5μM和10μM处理颅骨源性成骨细胞，72h后，收集细胞提取蛋白，在蛋白水平上对成骨相关的蛋白进行Western Blot检测，结果如图5所示，从图5中可以看出，特女贞苷5μM和10μM浓度均能升高Runx2、Osterix、OPG/RANK比值。结果与分子水平检测到的基因变化一致。

实施例3特女贞苷抑制RANKL诱导RAW264.7细胞的分化

1.特女贞苷对RANKL诱导的RAW264.7细胞分化的相关基因表达的影响

在本实施例中，RAW264.7细胞购买自武汉生物公司，货号：CL-0190。

取小鼠单核巨噬细胞RAW264.7于DMEM培养基中培养，在培养基中添加RANKL，使RANKL的终浓度为50ng/mL诱导形成破骨细胞，诱导后72h收集各组细胞进行qPCR检测mRNA转录情况，结果发现在50ng/mL RANKL诱导下，破骨细胞相关转录因子c-FOS、NFATc1 mRNA水平增高，同时MMP9和CTSK的也升高，预示破骨分化相关的基因被激活。

实验分组三组，分别为对照组、5μM组和10μM组。对照组为RANKL诱导的破骨细胞，不做处理，5μM组和10μM组别用5μM、10μM特女贞苷处理诱导成功的破骨细胞，处理72h后，收集细胞，进行RT-qPCR检测，结果如图6所示。从图6中可以看出，5μM特女贞苷干预后，c-FOS、NFATc1、MMP9和CTSK的mRNA略微有所降低，转录水平开始受到限制，当特女贞苷浓度达到10μM时，差异具有显著性。

2.特女贞苷对RANKL诱导的RAW264.7细胞分化的相关蛋白表达的影响

取小鼠单核巨噬细胞RAW264.7于DMEM培养基中培养，在培养基中添加RANKL，使RANKL的终浓度为50ng/mL诱导形成破骨细胞。实验分组三组，分别为对照组、5μM组和10μM组。对照组为RANKL诱导的破骨细胞，不做处理，5μM组和10μM组别用5μM、10μM特女贞苷处理诱导成功的破骨细胞，诱导后72h后收集各组细胞进行靶点蛋白水平检测，结果如图7所示。从图7可以看出，RANKL/RANK信号通路下游的TRAF6蛋白在RANKL诱导对照组表达最高，下游的靶点蛋白c-FOS、NFATc1也随之表达。当以5μM特女贞苷干预后，蛋白表达量逐渐降低，10μM特女贞苷干预后，与RANKL组相比，差异更为显著，以上结果与转录水平相一致。从图7中可以看出，PI3K和AKT的磷酸化水平有所降低，说明特女贞苷能影响RANKL/RANK下游PI3K/AKT信号通路活化，抑制破骨细胞的分化。

实施例4特女贞苷对去卵巢大鼠骨稳态的药效学评价

1.特女贞苷治疗有效缓解骨质疏松大鼠骨流失，并改善了紊乱的骨微结构

取90只三月龄SPF级SD雌性大鼠，适应喂养7天，随机分为5组，分别为假手术(SHAM)组、去卵巢(OVX)组、雌激素替代(OVX-EV)组、低剂量(OVX-specnuelow)组、高剂量(OVX-specnuehigh)组，每组18只。

假手术(SHAM)组仅去除卵巢周围脂肪；

去卵巢组(OVX)为摘除SD大鼠双侧卵巢，模拟绝经后妇女的病理性骨质疏松状态，术后连续3天给予青霉素8UI/只，常规抗感染；

雌激素替代(OVX-EV)组在摘除双侧卵巢后，以0.1mg/kg/d的剂量注射戊酸雌二醇；

特女贞苷低剂量(OVX-specnuelow)组在摘除双侧卵巢后，以1mg/kg/d的剂量灌胃特女贞苷，给药体积1mL/100g；

特女贞苷高剂量(OVX-specnuehigh)组在摘除双侧卵巢后，以2mg/kg/d的剂量灌胃特女贞苷，给药体积1mL/100g。

给药12周后，取大鼠胫骨干骺端骨组织进行Masson染色。

染色结果如图8所示。由图8可以看出，OVX组中骨小梁结构破坏明显，断裂不连续；给予特女贞苷治疗后，骨小梁数量显著增加，骨小梁面积增大。大鼠胫骨Masson染色骨小梁相对面积比统计结果如表2所示。

表2大鼠胫骨Masson染色骨小梁相对面积比统计结果(

注：a:与OVX组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；b:与SHAM组相比，

2.microCT检测特女贞苷干预绝经后骨质疏松症模型的大鼠骨微观结构的变化

通过microCT扫描胫骨干骺端骨组织学结构，三维重构图如图9所示，骨微结构参数如图10所示。三维重构图及骨微结构参数分析可知，特女贞苷能够明显提高骨质疏松症大鼠的骨量。这与升高骨小梁体积/总骨体积比值(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、下降的骨分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)有关。

3.特女贞苷干预绝经后骨质疏松症模型的大鼠血清指标的变化

检测五组大鼠血清中CTSK、β-CTX、TRAP5b含量，结果如图11所示。由图11可以看出，CTSK、β-CTX、TRAP5b含量在OVX组含量最高，SHAM组最低，说明去卵巢大鼠中破骨细胞数量多、活性高、骨吸收旺盛，经特女贞苷给药12周后，骨质疏松症大鼠体内升高的骨吸收指标明显降低(图11中A-C)；BALP是骨反映成骨细胞活性和数量的指标，去卵巢组大鼠中，骨吸收大于骨形成，成骨细胞功能下降，去卵巢组大鼠血清中BALP相对于SHAM组出现明显下降。由图11中D可以看出，在特女贞苷给药后，能显著升高去势大鼠BALP的含量；IL6、TNF-α在去卵巢大鼠组显著升高是雌激素水平急剧下降，对破骨细胞的抑制作用减弱所导致，特女贞苷给药后能降低血清中IL-6(图11中E)和TNF-α(图11中F)的含量。

4.特女贞苷治疗绝经后骨质疏松症模型大鼠股骨中Runx2、Osterix、OPG/RANKLmRNA的变化

取各组大鼠股骨组织，利用RT-qPCR进行检测，在基因水平上观察特女贞苷给药后成骨形成相关因子的表达，结果如图12所示，从图12中观察到与SHAM组相比，因OVX引起的OPG、Runx2的低转录水平的降低，能被特女贞苷所逆转，提高OPG/RANKL比值。

5.特女贞苷治疗绝经后骨质疏松症模型的大鼠股骨中NFATc1、c-FOS、TRAF6的mRNA表达量

取各组大鼠胫骨进行RT-qPCR检测，结果如图13所示，从图13可以看出，OVX大鼠破骨相关因子NFATc1、c-FOS、TRAF6的转录水平明显升高，说明骨吸收加快。给予特女贞苷治疗后NFATc1、c-FOS、TRAF6的转录水平显著下调，说明特女贞苷明显抑制破骨分化相关因子的表达。

6.特女贞苷治疗绝经后骨质疏松症模型的大鼠股骨破骨分化相关蛋白变化

取各组大鼠胫骨进行western Blot检测，检测结果如图14所示，从图14可以看出，在特女贞苷干预后，与破骨细胞分化相关的NFATc1、TRAF6、C-FOS蛋白表达均下调，说明特女贞苷明显抑制破骨分化相关因子的表达。

由以上实施例可知，本发明提供了特女贞苷在制备治疗绝经后骨质疏松药物中的应用。女贞苷能够促进相关成骨因子RUNX2、Osterix、ALP、OPG/RANKL的表达，并抑制抑制破骨细胞相关因子c-FOS、NFATc1、MMP9和CTSK表达，说明特女贞苷通过RANKL/RANK信号通路起到对绝经后骨质疏松症的防治作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。