基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法
文献发布时间:2024-04-18 19:58:26
技术领域
本发明涉及肺炎球菌多糖疫苗技术领域,尤其涉及一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法。
背景技术
肺炎球菌( Streptococcus pneumoniae,SP) 是肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎和菌血症的主要病原菌,目前已发现90多种血清型,荚膜多糖是肺炎球菌的主要毒力因子,是血清学分型的依据,同时也是重要的保护性抗原。荚膜多糖本身不具有毒力,其发挥毒力的主要方式是阻止抗体介导的调理吞噬作用,以及对补体 C3b 的降解。
肺炎链球菌荚膜多糖(Capsule polysaccharides,CPS)是主要的毒力因子之一覆盖细菌整个表面,其作用机制是掩盖细胞表面并阻断针对细胞表面抗原的补体沉积,从而使细菌能够逃避吞噬作用并在宿主鼻咽处定殖。CPS上补体沉积及其与补体抑制蛋白(如H因子)结合的不同,导致了不同血清型侵袭性上的差异,这种差异体现在Spn疾病发病机制的各个方面,包括对抗菌剂的敏感性和耐药性,血清型的比例也会随着时间的流逝和疫苗的使用而变化。同时CPS还具有免疫原性,可诱导产生抗肺炎链球菌感染的抗体,这也是目前研制肺炎球链菌疫苗的免疫学基础。
目前,市售的肺炎疫苗有两种:肺炎链球菌多糖疫苗(pneumococcalpolysaccharide vaccines,PPV)和肺炎链球菌结合疫苗(pneumococcal conjugatevaccine,PCV)。荚膜多糖属于非胸腺依赖性抗原(thymus independent antigen,TI-Ag)中的TI-2 Ag,用这种抗原进行免疫时只能通过交联B细胞受体(B-cell receptor,BCR)刺激成熟B细胞产生应答,而无法活化T细胞,也不能形成免疫记忆。因此,PPV在婴幼儿、老年人和免疫缺陷患者等人群中的免疫反应低下。这种缺陷可以通过将多糖抗原与蛋白载体缀合来克服,已经证明这种糖缀合物可有效诱导胸腺依赖性免疫。目前,应用最广泛的结合疫苗沛儿13就是由13种血清型的CPS与无毒的白喉毒素突变体(CRM197)偶联制成。目前国内外常见的肺炎结合疫苗为单载体结合疫苗,既一种多糖与一种载体蛋白结合。由于肺炎结合疫苗价次较多(常见为13价和23价),单载体蛋白会竞争辅助型T细胞而对多糖免疫应答产生抑制作用。而多载体蛋白的是采用两种载体蛋白与肺炎球菌荚膜多糖结合,区别于单载体肺炎球菌多糖结合疫苗,可以避免同一种载体蛋白竞争辅助型T细胞而对多糖免疫应答产生抑制作用。因此,开发是必要的;
为此,我们设计一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法,用于对上述技术问题提供另一种技术方案。
发明内容
基于此,有必要针对上述技术问题,提供一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法,用于解决上述背景技术中提出的技术问题。
为了解决上述的技术问题,本发明采用了如下技术方案:
一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法,步骤如下:
S1:将代表性多糖1、2、3型肺炎球菌多糖采用超声解聚后,得到合适的1、2、3型肺炎多糖溶液;
S2:先将肺炎球菌多糖用高碘酸钠氧化,将多糖上羟基氧化为醛基;
S3:将氧化后的多糖与linker(N-(Amino-PEG5)-N-bis(PEG4-acid)活化生成席夫碱,然后加入氰基硼氢化纳还原,生成多糖衍生物;
S4:向多糖与linker衍生物中加入第一种蛋白CMR197(或则TT),然后加入DMT形成酰胺基,生产多糖蛋白结合物;
S5:向生成的多糖蛋白衍生物中加入氢氧化钠,脱掉linker上的酯基;
S6:向脱掉酯基的多糖蛋白结合物中加入第二种蛋白TT,然后加入DMT形成酰胺基,生产第二种多糖蛋白结合物。
作为本发明提供的所述的一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法的一种优选实施方式,所述S2步骤中,在1、2、3型肺炎精糖解聚溶液中加入醋酸调节pH为4.4;然后加入高碘酸纳氧化剂,高碘酸纳终浓度为20~30mol/L。
作为本发明提供的所述的一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法的一种优选实施方式,所述S2步骤中,在25℃下反应24小时,将肺炎多糖上羟基氧化为醛基;将样品超滤,除去未反应的小分子杂质。
作为本发明提供的所述的一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法的一种优选实施方式,所述S3步骤中,向S2步骤中的多糖溶液中调节pH为6.0,然后加入linker(N-(Amino-PEG5)-N-bis(PEG4-acid)活化,在25℃下反应2小时;然后加入氰基硼氢化纳还原剂,使氰基硼氢化纳终浓度为30~50mol/L。
作为本发明提供的所述的一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法的一种优选实施方式,所述S3步骤中,在25℃下反应48小时然后将样品超滤,除去未反应的小分子杂质。
作为本发明提供的所述的一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法的一种优选实施方式,所述S4步骤中,向S3步骤中的多糖与linker结合物中加入PBS调节pH为6.0,然后加入CRM197蛋白,然后加入DMT结合剂,使DMT终浓度为30~50mol/L,在25℃下反应4小时,形成第一种多糖蛋白结合物。
作为本发明提供的所述的一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法的一种优选实施方式,所述S5步骤中,向S4步骤中的多糖蛋白结合物中加入1mol/L的氢氧化钠溶液,调节pH为9;在25℃下反应12小时,脱掉酯基;将样品超滤,除去未反应的小分子杂质。
作为本发明提供的所述的一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法的一种优选实施方式,所述S6步骤中,将S5步骤中的溶液加入加入PBS调节pH为6.0,然后加入第二种蛋白TT;加入DMT结合剂,DMT终浓度为30~50mol/L,在25℃下反应4小时,形成第二种多糖蛋白结合物;将样品超滤,除去未反应的小分子杂质。
可以毫无疑义的看出,通过本申请的上述的技术方案,必然可以解决本申请要解决的技术问题。
同时,通过以上技术方案,本发明至少具备以下有益效果:
本发明提供的一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法,通过对方法的改进,能够将将1、2、3型肺炎精糖原液制备形成第二种多糖蛋白结合物,从而能够形成多载体蛋白的肺炎结合疫苗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的示意图。
实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征和技术方案可以相互组合。
应注意到:相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项,因此,一旦某一项在一个附图中被定义,则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
参照图1,一种基于双载体蛋白反应路线的肺炎球菌多糖疫苗制备方法。
将采用1、2、3型肺炎球菌多糖为例(包括但不限于24价多糖),采用一种特殊的化学linker(N-(Amino-PEG5)-N-bis(PEG4-acid),将肺炎多糖与TT和CRM197两种蛋白进行结合。以探索肺炎多糖与双载体蛋白结合物的路线。因为CRM197不具有酶活性以及毒性,但具有DT的免疫原性,因此CRM197也常被用作一种载体蛋白交联其他半抗原一起作为疫苗
S1:将代表性多糖1、2、3型肺炎球菌多糖采用超声解聚后,得到理论分子量。
将1、2、3型肺炎精糖原液经过超声解聚后,得到合适的1、2、3型肺炎多糖溶液;
S2:先将肺炎球菌多糖用高碘酸钠氧化,将多糖上羟基氧化为醛基;
在1,2,3型肺炎精糖解聚溶液中加入醋酸调节pH为4.4,然后加入高碘酸纳氧化剂,使高碘酸纳终浓度为20~30mol/L。在25℃下反应24小时,将肺炎多糖上羟基氧化为醛基。然后将样品超滤,除去未反应的小分子等杂质。
S3:将氧化后的多糖与linker(N-(Amino-PEG5)-N-bis(PEG4-acid)活化生成席夫碱,然后加入氰基硼氢化纳还原,生成多糖衍生物。
向S2步骤中的多糖溶液中调节pH为6.0,然后加入linker(N-(Amino-PEG5)-N-bis(PEG4-acid)活化,在25℃下反应2小时;然后加入氰基硼氢化纳还原剂,使氰基硼氢化纳终浓度为30~50mol/L。在25℃下反应48小时然后将样品超滤,除去未反应的小分子等杂质;
S4:向多糖与linker衍生物中加入第一种蛋白CMR197(或则TT),然后加入DMT形成酰胺基,生产多糖蛋白结合物。
向S3步骤中的多糖与linker结合物中加入PBS调节pH为6.0,然后加入CRM197蛋白(或TT蛋白),然后加入DMT结合剂,使DMT终浓度为30~50mol/L,在25℃下反应4小时,形成第一种多糖蛋白结合物。然后将样品超滤,除去未反应的小分子等杂质。
S5:向生成的多糖蛋白衍生物中加入氢氧化钠,脱掉linker上的酯基。
向S4步骤中的多糖蛋白结合物中加入1mol/L的氢氧化钠溶液,调节pH为9;在25℃下反应12小时,脱掉酯基。然后将样品超滤,除去未反应的小分子等杂质。
S6:向脱掉酯基的多糖蛋白结合物中加入第二种蛋白TT(或则CRM197),然后加入DMT形成酰胺基,生产第二种多糖蛋白结合物。
将S5步骤中的溶液加入加入PBS调节pH为6.0,然后加入第二种蛋白TT(或则CRM197)然后加入DMT结合剂,使DMT终浓度为30~50mol/L,在25℃下反应4小时,形成第二种多糖蛋白结合物。然后将样品超滤,除去未反应的小分子等杂质。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节,也不限制该本发明仅为所述的具体实施方式。显然,根据本说明书的内容,可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例,是为了更好地解释本发明的原理和实际应用,从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
- 使用重组载体蛋白的肺炎球菌联合疫苗及其制备方法
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