一种用于荧光淬灭的淬灭装置以及差异荧光淬灭方法、应用

技术领域

本发明涉及荧光标记生物样本处理技术领域，具体涉及一种用于荧光淬灭的淬灭装置以及差异荧光淬灭方法、应用。

背景技术

现阶段荧光染色技术已经在生物医药领域得到了广泛的使用，其中，荧光标记技术(包括免疫荧光标记以及荧光染料标记技术等)是生物医学研究领域使用最广泛染色技术之一，有多种方法和工具可用于实现荧光标记，荧光标记技术主要由探针和检测两部分组成，探针包括荧光染料、荧光蛋白、免疫荧光，检测设备包括荧光显微镜等。由于荧光标记技术可以实现对生物分子和细胞的荧光标记，所以在生物医学研究中具有广泛的应用，如细胞成像、蛋白质相互作用研究、基因表达分析、组织和器官成像、药物筛选和治疗监测等领域。该标记技术具有高度敏感性，多色标记能力及高分辨力，其能够优秀地可视化蛋白质、糖类和小的生物和非生物分子等亚细胞显微结构。

然而，大多数的被检测生物样本都具有固有荧光背景，其会减低特异标记荧光信号的信噪比以及对标记信号的检测能力，极大的干扰研究者对特异标记信号的鉴别及检测能力。生物样本固有荧光来源广泛，其可来自组织内天然成分，包括黄酮类化合物、卟啉、叶绿素(在植物中)、胶原蛋白、弹性蛋白、红细胞和脂褐素等。这些成分通常会在可见光谱的绿色和黄色部分具有较强的自发荧光。另外，除了组织固有的自发背景荧光外，免疫染色过程也可能会引入外来的背景荧光，如组织固定中使用醛类化合物(甲醛，福尔马林以及戊二醛等)。这些固定剂通过与蛋白质之间共价结合作用，将细胞组织结构固定为形态稳定的不溶性网状物。在这固定过程中，醛会与胺结合形成席夫碱，导致自发荧光(戊二醛>多聚甲醛>甲醛)(PMID：6404984)。这种因交联剂固定产生的自发荧光具有广泛发射光谱，在蓝色，绿色和红色光谱范围内均可检测到荧光信号。最后，在某些实验操作中，被检测的生物样本可能在预先处理过程中被标记上了特异的荧光信号(如特异染料染色以及荧光蛋白等)。而在最终检测中，实验人员希望去掉这些实验中引入的荧光标记，进而加大特异荧光观测的通量。所有的这些组织样本自有的背景荧光，以及通过实验操作引入的荧光分子，都会干扰最终的希望检测的特异荧光标记，或者降低最终特异荧光标记的能力或通量。所以，高效的淬灭生物样本固有的荧光，是提升样本特异标记荧光信号信噪比，以及增加特异荧光标记数量/通量的一项关键性应用技术。

荧光淬灭是指荧光物质的荧光强度降低的任何过程。许多过程都会导致淬灭现象，例如激发态反应、能量转移、配合物的形成和碰撞淬灭。荧光淬灭是一种减少荧光发射的过程。荧光淬灭可以由各种机制引起，包括静态淬灭、动态淬灭以及光漂白等。目前主流的去除生物样本固有荧光的方法是使用自发荧光淬灭试剂，其包括苏丹黑(Sudan BlackB)，硼氢化物衍生物，以及商用自发荧光淬灭试剂，包括TrueBlack(Biotium)以及TrueVIEW(VectorLabs)等。自发荧光淬灭试剂的使用方法简单，其可直接滴加到染色生物样本表面，加入的自发荧光淬灭试剂中的离子可通过碰撞方式，捕获自发荧光光源分子发出的电子，阻止该电子从激发态回归基态进而辐射背景荧光。然而，所有使用自发荧光淬灭试剂去除生物样本固有背景荧光的方案都有几个重要的缺点：

第一，生物样本往往含有多种自发荧光分子，且不同的生物样本含有的自发荧光分子种类及数量往往差异很大，因此使用荧光淬灭试剂的效果可能具有很大差异，其很难实现对生物样本固有荧光背景的完全去除。如各类生物样本(石蜡切片、爬片、冰冻组织)，因为组织本身的组份、醛类试剂的固定及高温处理等原因，会导致样品组织及组织内组份(例如黄素、卟啉、植物叶绿素、胶原蛋白、弹性蛋白、红细胞、脂褐素等都会产生较强的自发荧光)等产生显著的自发荧光，进而极大干扰特异荧光标记。

第二，自发荧光淬灭试剂在观测样本内一直存在，虽然其可压制样本固有背景荧光，但同时也会降低特异标记荧光的亮度。

第三，自发荧光淬灭试剂本身有可能在不同的荧光通道引入新的背景荧光。

因此，如何找到一种更为适宜的方式，能够用于去除荧光标记的生物样本存在的固有背景荧光或外来荧光干扰，解决现有的上述方式存在的缺陷，已成为业内诸多一线研究人员亟待解决的问题之一。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种用于荧光淬灭的淬灭装置以及差异荧光淬灭方法、应用。本发明提供背景荧光淬灭装置对样本固有荧光分子的淬灭具有不可逆性，而且完全不会影响后期标记的特异荧光分子的亮度，反而由于背景荧光的完全去除，会进一步增强特异荧光标记的信噪比及特异性。

本发明提供了一种用于荧光淬灭的淬灭装置，包括：

光源；

设置在光源发射的光线下方的滤光片；

设置在滤光片下方的透明盛物装置；

设置在透明盛物装置下方的光反射装置。

优选的，所述光源具体为平面板状光源；

所述光源包括可以发射多种波长和功率可调的光源；

所述光源的波长范围为200～1600nm。

优选的，所述光源包括可见光全光谱LED灯或超宽光谱光源LED灯；

所述光反射装置包括镜面光反射装置；

所述透明盛物装置包括透明托盘；

所述透明盛物装置用于放置淬灭剂和/或待光淬灭的生物样本。

优选的，所述荧光淬灭包括背景荧光淬灭、自发荧光、外界物质引入荧光和人工荧光染料荧光中的一种或多种；

所述淬灭装置还包括控制模块；

所述控制模块用于控制光源，调整功率控制光强和/或设置光照时长。

优选的，所述淬灭装置具体为可以调控温度和湿度的淬灭装置；

所述淬灭装置中还包括压缩机、半导体、散热片和风扇中的一种或多种；

所述荧光淬灭包括差异荧光淬灭法。

本发明提供了一种差异荧光淬灭方法，包括以下步骤：

1)基于要淬灭的生物样本的荧光激发光波长，调整淬灭光源的波长和强度，将采用液体保护的生物样本置于盛物装置上，在光源的照射和滤光装置的作用下，对生物样本进行光淬灭后，得到消除荧光后的生物样本。

优选的，所述液体保护的液体包括水和/或PBS缓冲液；

所述生物样本具体为经过前处理的生物组织；

所述前处理包括细胞爬片、冰冻切片、包埋、切片、烤片、脱蜡至水和抗原修复中的一步或多步；

所述光源的波长在200～1600nm内可调。

优选的，所述光源光照的强度在10～2000Klx内可调；

所述步骤1)中，还包括将采用液体保护的生物样本和淬灭剂置于盛物装置上；

所述淬灭剂包括提供自由基的淬灭剂；

所述自由基包括·OH和/或·HO

优选的，所述淬灭剂中还包括HO

所述淬灭剂包括H

所述光淬灭的时间为1～300min；

所述光淬灭的温度为1～70℃；

所述光淬灭的湿度为5％～95％；

所述消除荧光后的生物样本包括用于进行荧光标记的生物样本。

本发明还提供了上述技术方案任意一项所述的淬灭装置或上述技术方案任意一项所述的差异荧光淬灭方法在制备用于荧光标记的生物样本中的应用。

本发明提供了一种用于荧光淬灭的淬灭装置，包括光源；设置在光源发射的光线下方的滤光片；设置在滤光片下方的透明盛物装置；设置在透明盛物装置下方的光反射装置。与现有技术相比，本发明研究认为，化学自发荧光淬灭试剂会存在淬灭效果不一致，适用范围窄；影响用户标记目标的荧光染料；在特定荧光光谱中引起背景；无法淬灭人造染料；无法精准差异淬灭以及使用麻烦，成本高等问题。虽然也有一些研究采用光漂白这个方向进行研究，消除组织自发荧光，但需要1～3天的时间。因此，虽然研究人员在光漂白这个方向进行了多种尝试，但是目前相较于荧光淬灭试剂，光漂白并不是目前的主流方法，对于常规生物样本固有荧光的去除方面，光漂白缺点明显，增高光强度或者让样本离光源更近，会使样本温度过高，破坏生物样本物理结构，而且常规的光漂白设备及方案却需要数小时到数天的时间，存在着效率低、光漂白效果不一致、损伤样本以及光源波长不受控制无法实现精准差异淬灭等等问题。

基于此，本发明创造性的设计了一种具有特定结构的用于差异荧光淬灭的淬灭装置，本发明提供的荧光淬灭装置对样本固有荧光分子的淬灭具有不可逆性，其通过对荧光激发基团共价键的破坏，将使样本固有荧光分子失去荧光激发功能，因此在后期染色过程的任何洗涤处理都不会导致其淬灭效果减弱。背景荧光淬灭体系完全不会影响后期标记的特异荧光分子的亮度，反而由于背景荧光的完全去除，会进一步增强特异荧光标记的信噪比及特异性，具有更好的信噪比(消除背景荧光且不会影响目标荧光亮度)。而且能够重复利用样本进行荧光标记，消除人工荧光染料，如在很多场景中，例如某个样本很珍贵或设备限制只能使用某一种荧光染料，但希望多次染色观察尽可能多的标志物，需要对已经染色的人造荧光染料进行消除。而已有淬灭方案，对人造染料效果不好甚至完全无效，该发明可以普适的淬灭各种类型荧光源。同时该装置适用范围广，兼容性强，使用方便，经济性高可以适用各种类型样本、各种波长荧光源。无需每种荧光单独购买试剂，兼容各种场景，极大节约精力、时间、金钱。更主要的是能够实现精准荧光淬灭，在生物实验过程中存在很多场景，只想淬灭掉某一部分荧光，保留剩余部分荧光，以便实验进行。例如：多重染色，不同轮次间需要可能需要保留DAPI的荧光，而本发明则可以通过可控光源+滤光片的方案解决这个问题。

本发明提供的淬灭装置和淬灭方法，极大的提升了淬灭效率，通过特定的淬灭剂，仅需10分钟即可完成淬灭，而其他光漂白方案一般要6小时以上甚至更久。而且最小化样本损伤，通过智能控制光照策略、环境(温度、湿度等)，最小化对样本的伤害。

附图说明

图1为本发明提供的差异荧光淬灭技术原理示意简图；

图2为本发明提供的差异荧光淬灭装置的技术架构示意图；

图3为本发明提供的差异荧光淬灭装置的实物正面照片和背面照片；

图4为本发明提供的差异荧光淬灭装置的控制模块照片；

图5为本发明提供的差异荧光淬灭装置的灯板实物照片；

图6为本发明提供的差异荧光淬灭装置的滤光片实物照片；

图7为本发明提供的差异荧光淬灭装置的样本托盘实物照片；

图8为本发明提供的差异荧光淬灭装置的镜面反射装置的实物照片；

图9为本发明提供的差异荧光淬灭装置的样本托盘与镜面的安装实物照片；

图10为本发明提供的差异荧光淬灭装置的环境控制装置的实物照片；

图11为本发明实施例1中小鼠石蜡切片背景光淬灭效果对比图；

图12为本发明实施例1中小鼠石蜡切片背景光淬灭后，背景荧光强度对比图；

图13为本发明实施例2中NSCLC石蜡切片背景荧光淬灭后，实施多色荧光染色图；

图14为本发明实施例2中OC石蜡切片背景荧光淬灭后，实施多色荧光染色图；

图15为本发明实施例3中小鼠肾石蜡切片实施差异荧光淬灭的对比图；

图16为本发明实施例4中人扁桃体石蜡切片荧光淬灭效果对比图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。

本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用分析纯或荧光标记领域的纯度标准。

本发明所有原料，其牌号和简称均属于本领域常规牌号和简称，每个牌号和简称在其相关用途的领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据牌号、简称以及相应的用途，能够从市售中购买得到或常规方法制备得到。

本发明提供了一种用于荧光淬灭的淬灭装置，包括：

光源；

设置在光源发射的光线下方的滤光片；

设置在滤光片下方的透明盛物装置；

设置在透明盛物装置下方的光反射装置。

在本发明中，所述光源具体优选为平面板状光源。

在本发明中，所述光源优选包括可以发射多种波长和功率可调的光源。

在本发明中，所述光源的波长范围优选为200～1600nm，更优选为300～1000nm内可调，更优选为400～800nm内可调。

在本发明中，所述光源包括可见光全光谱LED灯或超宽光谱光源LED灯。具体的，可以为LED阵列。

在本发明中，所述光反射装置优选包括镜面光反射装置。

在本发明中，所述透明盛物装置优选包括透明托盘。

在本发明中，所述透明盛物装置优选用于放置淬灭剂和/或待光淬灭的生物样本，更优选放置淬灭剂或待光淬灭的生物样本。

在本发明中，所述荧光淬灭优选包括背景荧光淬灭、自发荧光、外界物质引入荧光和人工荧光染料荧光中的一种或多种，更优选为背景荧光淬灭、自发荧光、外界物质引入荧光和人工荧光染料荧光中的多种。具体的，所述外界物质引入荧光可以包括实验过程引入荧光，如化合物引入荧光，如甲醛等。

在本发明中，所述淬灭装置还优选包括控制模块。

在本发明中，所述控制模块优选用于控制光源，调整功率控制光强和/或设置光照时长，更优选用于控制光源，调整功率控制光强或设置光照时长。

在本发明中，所述淬灭装置具体优选为可以调控温度和湿度的淬灭装置。

在本发明中，所述淬灭装置中还优选包括压缩机、半导体、散热片和风扇中的一种或多种，更优选为压缩机、半导体、散热片或风扇。

在本发明中，所述荧光淬灭优选包括差异荧光淬灭法。

本发明提供了一种差异荧光淬灭方法，包括以下步骤：

1)基于要淬灭的生物样本的荧光激发光波长，调整淬灭光源的波长和强度，将采用液体保护的生物样本置于盛物装置上，在光源的照射和滤光装置的作用下，对生物样本进行光淬灭后，得到消除荧光后的生物样本。

在本发明中，所述液体保护的液体优选包括水和/或PBS缓冲液，更优选为水或PBS缓冲液。

在本发明中，所述生物样本具体优选为经过前处理的生物组织。

在本发明中，所述前处理优选包括细胞爬片、冰冻切片、包埋、切片、烤片、脱蜡至水和抗原修复中的一步或多步，更优选为细胞爬片、冰冻切片、包埋、切片、烤片、脱蜡至水和抗原修复中的多步。

在本发明中，所述光源的波长优选在200～1600nm内可调，更优选为300～1000nm内可调，更优选为400～800nm内可调。

在本发明中，所述光源光照的强度优选在10～2000Klx内可调，更优选在100～1500Klx内可调，更优选在500～1000Klx内可调。

在本发明中，所述步骤1)中，还优选包括将采用液体保护的生物样本和淬灭剂置于盛物装置上。

在本发明中，所述淬灭剂优选包括提供自由基的淬灭剂；

在本发明中，所述自由基优选包括·OH和/或·HO

在本发明中，所述淬灭剂中还优选包括HO

在本发明中，所述淬灭剂优选包括H

在本发明中，所述光淬灭的时间优选为1～300min，更优选为5～100min，更优选为10～60min。

在本发明中，所述光淬灭的温度优选为1～70℃，更优选为10～50℃，更优选为20～30℃。

在本发明中，所述光淬灭的湿度优选为5％～95％，更优选为25％～75％，更优选为45％～55％。

在本发明中，所述消除荧光后的生物样本优选包括用于进行荧光标记的生物样本。

生物样本内能产生强背景荧光的分子，都含有共轭双键(π键)的结构体系。而生物样本内荧光分子在受到激发光照射时，受激的荧光分子的电子从低能级向高能级跃迁(π→π*)，高能级状态下的电子不稳定，其在跃迁返回基态的过程中，以辐射长波段荧光的方式释放能量，进而产生背景荧光。激发的荧光分子不稳定，其处于高能量的电子激发态，倾向于回到低能量的基态。为了释放这种过剩的能量，荧光分子会经历不同的反应途径，如非辐射弛豫、能量转移或光化学反应。自由基是具有未成对电子的高度反应性分子或离子，其寻求稳定化，往往通过与其他分子进行电子转移或氧化反应来实现。本发明中的淬灭剂基于自由基与激发的荧光分子具有较高的反应性，自由基与激发的荧光分子发生反应时，可引发一系列的氧化反应、氢原子或电子的转移，导致荧光分子结构破坏，降解或失去荧光活性。所以，本发明使用特定光谱光激发目标荧光分子，同时向体系中加入自由基的方法，可实现对生物组织内荧光分子的可控淬灭。

参见图1，图1为本发明提供的差异荧光淬灭技术原理示意简图。

如图1所示，(左图)在生物组织内具有荧光激发能力的分子通常具有共轭结构。共轭结构是指分子中存在连续的π电子云，通过π-π堆积或共轭键的存在，形成共轭体系。这种共轭结构能够产生电子的共轭运动，使分子具有吸收和发射光的能力，从而表现出荧光性质。(中间图)生物组织内荧光分子在受到特定光谱的激发光激发后，电子从低能级向高能级跃迁(π→π*)，高能级状态下的电子不稳定，其在跃迁返回基态的过程中，以辐射长波段荧光的方式释放能量。激发状态的荧光分子不稳定，其与自由基具有较高的反应性。(右图)自由基与激发的荧光分子发生反应时，可引发一系列的氧化反应、氢原子或电子的转移，导致荧光分子结构破坏，降解或失去荧光活性。

本发明为更好的完整和细化整体技术方案，保证差异荧光淬灭的淬灭精准性，提供淬灭效果和淬灭效率，上述用于荧光淬灭的淬灭装置以及差异荧光淬灭方法具体可以包括以下内容：

本发明基于光漂白这种有效的荧光淬灭方向，设计了特定的淬灭装置和淬灭方法。本发明采用符合要求的光在合适的环境中照射特定状态的样本，使得液体保护下的样本处于激发态，

对于光源的波长，符合要淬灭染料激发光波长，从而具有淬灭效果。光源的强度，采用合理的光照强度才能提高效率、不损伤样本。特定的照射方式和时间，时间是影响其效果的关键因素。如果光淬灭时间过短，可能无法有效淬灭荧光；如果光淬灭时间过长，可能会导致样品损伤。所以需要根据样品的具体情况来调整光淬灭的时间。以及光照方式，为了保证淬灭效果的一致性和提高淬灭效率，要尽可能的用均匀的光从各个角度照射样品。本发明提供的装置还能够实现环境控制，控制温度，高强度的光照会产生大量的热量，需要配备冷却系统来保护样品免受热损伤(蛋白质降解、抗原反应性丧失)；控制湿度，过高的湿度会影响光照的效率和一致性，需要控制在合理值。

参见图2，图2为本发明提供的差异荧光淬灭装置的技术架构示意图。

参见图3，图3为本发明提供的差异荧光淬灭装置的实物正面照片和背面照片。

本发明提供的淬灭装置包括控制模块，通过控制LED灯板通电的灯珠来控制波长，通过控制功率来控制光强，设置倒计时来控制淬灭时间，通过控制风扇、压缩机、半导体制冷片工作与否来控制温度、湿度等环境参数。

参见图4，图4为本发明提供的差异荧光淬灭装置的控制模块照片。

本发明提供的淬灭装置包括光模块，LED光源，选用不同的LED的灯板，即可获得包含荧光淬灭常用波长的、可调功率光源，合理布局让光强分布均匀，放在不同位置的样本受到的光照一致。

参见图5，图5为本发明提供的差异荧光淬灭装置的灯板实物照片。

本发明提供的淬灭装置包括滤光片，LED灯板发出所需波长附近所需强度的光，但不够精准，通过滤光片把不需要波长的光过滤掉。LED灯板与滤光片组合即可获得所需波长的光。

参见图6，图6为本发明提供的差异荧光淬灭装置的滤光片实物照片。

本发明采用400～780nm滤光片，可以淬灭可见光覆盖的所有染料，而防止淬灭Dapi。

本发明采用525～555nm滤光片，可用于单独淬灭表1所列激发波长在540附近的染料。参见表1。

表1

本发明采用515～535nm滤光片，可用于单独淬灭表2所列激发波长在520附近的染料。参见表2。

表2

本发明提供的淬灭装置包括淬灭剂，本发明通过试剂向样本环境中添加自由基，本发明体系中加入自由基的方法可以有多种，使用光源照射过氧化氢溶液，通过光解反应产生氢氧自由基，通过过氧化物酶(如过氧化氢酶)与底物(如过氧化氢)进行氧化还原反应，产生氧自由基；通过电解或电化学反应在溶液中产生自由基；使用光敏剂(如溴化钙)和光源照射溶液，产生自由基等方法。这些方法在溶液中产生自由基都可以与本发明的光照射设备联合实现高效可控的荧光分子淬灭。

本发明提供的淬灭装置包括样本托盘和设置托盘底部的反射光线的镜面，该样品托盘造型特殊，主体透明，且底部有镜面的托盘，可以放置样品和淬灭剂，独特设计使用方便。且通过光的反射，光线多次照射样品极大提升淬灭效率，从背面的照射也极大提升正反面淬灭效果的一致性。

参见图7，图7为本发明提供的差异荧光淬灭装置的样本托盘实物照片。

参见图8，图8为本发明提供的差异荧光淬灭装置的镜面反射装置的实物照片。

参见图9，图9为本发明提供的差异荧光淬灭装置的样本托盘与镜面的安装实物照片。

本发明提供的淬灭装置包括环境控制装置。包括压缩机、半导体、风扇、散热片一起控制环境的温度、湿度。

参见图10，图10为本发明提供的差异荧光淬灭装置的环境控制装置的实物照片。

本发明提供的差异荧光淬灭装置，通过模块化的光源+滤光片，结合控制系统获取精准的入射光的波长和强度，且极大扩展适用范围，能精准有效淬灭各种来源的荧光；又进一步通过专用试剂+可控入射光添加自由基的方法，实现高效率的荧光淬灭(10～20分钟)；还通过多个模块的技术方案结合，包含：灯板(位置、大小、LED灯珠的数量、分布)；滤光片(位置、大小)；淬灭专用托盘(大小、位置、透明材质、底部镜面、载玻片摆放位置)。让样本淬灭区的各个位置光强一致，极大提高淬灭一致性，淬灭效率，同时减少淬灭时间也有利于保护样本。同时采用环境控制系统，通过控制温度和湿度，保护样本，提高效率。

本发明提供的差异荧光淬灭装置以及淬灭方法，具有精准：通过LED灯的型号、功率以及滤光片，精确的控制了用于淬灭的光。可以进行精准淬灭；普适：使用范围性极广，各种背景荧光和商业人工染料均可淬灭；无交叉影响：不影响染色环节的荧光标记和检测，提升信噪比；一致性强：不同批次样本、同批次不同样本、同一样本的不同部位，均能淬灭良好。高效：极大提高效率，10～20分钟；安全：控制环境温湿度，保护样本抗原和组织结构，可进行多次循环染色等等诸多优势。而且淬灭方法可控性强，条件温和，简单易行，更加适于实际应用和推广。

本发明提供了上述技术方案任意一项所述的淬灭装置或上述技术方案任意一项所述的差异荧光淬灭方法在制备用于荧光标记的生物样本中的应用。

本发明上述内容提供了一种用于荧光淬灭的淬灭装置以及差异荧光淬灭方法、应用。本发明设计的具有特定结构的用于差异荧光淬灭的淬灭装置，对样本固有荧光分子的淬灭具有不可逆性，其通过对荧光激发基团共价键的破坏，将使样本固有荧光分子失去荧光激发功能，因此在后期染色过程的任何洗涤处理都不会导致其淬灭效果减弱。背景荧光淬灭体系完全不会影响后期标记的特异荧光分子的亮度，反而由于背景荧光的完全去除，会进一步增强特异荧光标记的信噪比及特异性，具有更好的信噪比(消除背景荧光且不会影响目标荧光亮度)。而且能够重复利用样本进行荧光标记，消除人工荧光染料，如在很多场景中，例如某个样本很珍贵或设备限制只能使用某一种荧光染料，但希望多次染色观察尽可能多的标志物，需要对已经染色的人造荧光染料进行消除。而已有淬灭方案，对人造染料效果不好甚至完全无效，该发明可以普适的淬灭各种类型荧光源。同时该装置适用范围广，兼容性强，使用方便，经济性高可以适用各种类型样本、各种波长荧光源。无需每种荧光单独购买试剂，兼容各种场景，极大节约精力、时间、金钱。更主要的是能够实现精准荧光淬灭，在生物实验过程中存在很多场景，只想淬灭掉某一部分荧光，保留剩余部分荧光，以便实验进行。例如：多重染色，不同轮次间需要可能需要保留DAPI的荧光，而本发明则可以通过可控光源+滤光片的方案解决这个问题。

本发明提供的淬灭装置和淬灭方法，极大的提升了淬灭效率，通过特定的淬灭剂，仅需10分钟即可完成淬灭，而其他光漂白方案一般要6小时以上甚至更久。而且最小化样本损伤，通过智能控制光照策略、环境(温度、湿度等)，最小化对样本的伤害。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种用于荧光淬灭的淬灭装置以及差异荧光淬灭方法、应用进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。

实施例1

1、烤片：将人或者小鼠各组织(心脏，肝，肾，脾脏，胰腺，肌肉以及小肠)的石蜡切片放于65℃烘箱内烘烤过夜。

2、脱蜡：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％酒精5min-75％酒精5min-蒸馏水洗。

以上为标准石蜡切片的前处理过程。

3、背景荧光淬灭：随后，将切片置于装有H

4、成像：在荧光显微镜下成像(激发波长492nm；发射波长514nm)。

结果如下所述：

参见图11，图11为本发明实施例1中小鼠石蜡切片背景光淬灭效果对比图。

如图11所示，(左侧竖列)经过前处理但未实施淬灭的切片(对照)，(中间竖列)置于PBS缓冲液内经过设备光照淬灭的切片(设备光照+PBS缓冲液)，(右侧竖列)置于上述自由基光淬灭试剂内经过设备光照淬灭的切片(设备光照+自由基光淬灭试剂)。对比可以发现，光淬灭设备结合自由基光淬灭试剂能有效的对各组织荧光背景实现背景光淬灭，且荧光淬灭整体效果非常好。

参见图12，图12为本发明实施例1中小鼠石蜡切片背景光淬灭后，背景荧光强度对比图。

如图12所示，针对上图各种小鼠组织的石蜡切片，使用ImageJ对六个随机区域进行绿色荧光信号强度分析，结果显示使用自由基淬灭剂+光淬灭设备处理的片子背景荧光强度要远远低于对照未处理组以及PBS+光淬灭设备处理组。两组间对比使用t-test检验。****：P＜0.0001；***：P＜0.001；**：P＜0.01；*：P＜0.05；ns：P＞0.05。

实施例2

1、前处理：对人非小细胞肺癌(NSCLC)以及卵巢癌(OC)的石蜡切片的前处理过程与实施例1相同(见实施例1前处理过程1-2)。

2、背景荧光淬灭：随后进行背景荧光淬灭过程，将切片置于装有H

3、染色：对两组切片实施平行多色染色。使用TSA多色染色方法，染色试剂盒(IRISKit，MH010001)，按照产品标准染色流程执行。非小细胞肺癌(NSCLC)样本使用抗体CD68(HUABIO，HA601115)+荧光染料Cyclic-480(IRISKit)，抗体Ki67(HUABIO，HA721115)+荧光染料Cyclic-550(IRISKit)。卵巢癌(OC)样本使用抗体CD8(Immunoway，ABT304)+荧光染料Cyclic-480(IRISKit)，抗体PDL1(HUABIO，HA721176)+荧光染料Cyclic-550(IRISKit)。

4、成像：在荧光显微镜下成像(绿色通道：激发波长492nm，发射波长514nm；红色通道：激发波长555nm；发射波长569nm)。结果见下所述：

参见图13，图13为本发明实施例2中NSCLC石蜡切片背景荧光淬灭后，实施多色荧光染色图。其中，左图为未经过背景荧光淬灭的切片，右图为经过荧光淬灭预处理的切片。

如图13所示，非小细胞肺癌(NSCLC)连续切片样本，双色TSA免疫荧光平行染色，两张切片拍照曝光时间一致。绿色(CD68)，红色(Ki67)。(左)未经过背景荧光淬灭的切片，具有显著的背景自发荧光；(右)经过荧光淬灭预处理的切片，背景干净，染色信号强度不受前期光淬灭影响，获得的图像信噪比高。

参见图14，图14为本发明实施例2中OC石蜡切片背景荧光淬灭后，实施多色荧光染色图。其中，左图为未经过背景荧光淬灭的切片，右图为经过荧光淬灭预处理的切片。

如图14所示，卵巢癌(OC)连续切片样本，双色TSA免疫荧光平行染色，两张切片拍照曝光时间一致。绿色(PDL1)，红色(CD8)。(左)未经过背景荧光淬灭的切片，具有显著的来自红色细胞的背景自发荧光；(右)经过荧光淬灭预处理的切片，背景干净，染色信号强度不受前期光淬灭影响，获得的图像信噪比高。

实施例3

1、前处理：对小鼠肾的石蜡切片的前处理过程与实施例1相同(见实施例1前处理过程1-2)。

2、背景荧光淬灭：随后进行背景荧光淬灭过程，将切片置于装有H

3、染色：使用TSA多色染色方法，染色试剂盒(IRISKit，MH010001)，按照产品标准染色流程执行。使用抗体CD31(HUABIO，M1511-8)+荧光染料Cyclic-480(IRISKit)，抗体ZO1(Proteintech，21773-1-AP)+荧光染料Cyclic-550(IRISKit)，抗体CK19(HUABIO，ET1601-6)+荧光染料Cyclic-630(IRISKit)，以及细胞核荧光染料DAPI(IRISKit)。

4、人工染料差异淬灭：随后我们将切片左侧用不透光的盖玻片封闭，右侧暴露，并将切片置于装有光淬灭试剂(4.5％H

5、成像：在荧光显微镜下成像(蓝色通道：激发波长364nm，发射波长454nm；绿色通道：激发波长492nm，发射波长514nm；红色通道：激发波长555nm；发射波长569nm；洋红色通道：激发波长651nm；发射波长670nm)。结果见下所述：

参见图15，图15为本发明实施例3中小鼠肾石蜡切片实施差异荧光淬灭的对比图。其中，左侧区域为未经历过第二次特异染色荧光淬灭过程，右侧区域经历了第二次特异染色荧光淬灭过程，ROI i/ROI ii为未淬灭区域局部放大，ROI iii为淬灭区域局部放大。

如图15中的小鼠肾石蜡切片的多色TSA免疫荧光染色结果所示，对小鼠肾石蜡切片的多色染色样片实施局部差异光淬灭(20min)，左侧区域(without fluorophorequenching)未经历过第二次特异染色荧光淬灭过程，右侧区域(Fluorophore quenched)经历了第二次特异染色荧光淬灭过程。ROI i/ROI ii：未淬灭区域局部放大，ROI iii：淬灭区域局部放大。结果显示经历了第二次特异染色荧光淬灭的区域，CD31，ZO1以及CK19染色荧光被完全淬灭，而DAPI染色被保留。

实施例4

1、前处理：对人扁桃体组织的石蜡切片的前处理过程与实施例1相同(见实施例1前处理过程1-2)。

2、染色：使用TSA多色染色方法，染色试剂盒(IRISKit，MH010001)，按照产品标准染色流程执行。抗体α-SMA+荧光染料Cyclic-480(IRISKit)，抗体α-SMA+荧光染料Cyclic-550(IRISKit)，以及细胞核荧光染料DAPI(IRISKit)。

3、荧光淬灭：随后，将切片分别置于装有PBS缓冲液(pH 7.4)的淬灭托盘、装有4.5％H

4、成像：在荧光显微镜下成像，蓝色通道：激发波长364nm，发射波长454nm；绿色通道：激发波长492nm，发射波长514nm；红色通道：激发波长555nm，发射波长569nm。结果如下所述：

参见图16，图16为本发明实施例4中人扁桃体石蜡切片荧光淬灭效果对比图。其中，(左侧竖列)为经过前处理和染色但未实施淬灭的切片(未处理对照组)，(右侧竖列)为置于上述自由基光淬灭试剂内经过设备光照淬灭的切片(使用光激发)。

如图16所示的对比可以发现，光淬灭设备结合自由基光淬灭试剂能高效的对各组织荧光背景实现背景光淬灭，且荧光淬灭整体效果非常好。

以上对本发明提供的一种用于荧光淬灭的淬灭装置以及差异荧光淬灭方法、应用进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有不是不同于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。