一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法

技术领域

本发明涉及一种药物细胞毒性筛选的方法，具体涉及一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法。

背景技术

穿刺活检具有准确、快速、微创、方便病理诊断等优势，能够在手术前明确肿瘤性质，为明确诊断疾病和指导后续治疗提供了重要依据。目前癌症穿刺活检的方式分为两种，针吸细胞学检查(细针穿刺活检)和空芯针穿刺活检(粗针穿刺活检)。

细针穿刺活检是使用直径为0.6-0.8毫米的细针，依靠细针自身的吸取作用吸取肿瘤标本，由于穿刺针的直径很细，因此活检以细胞诊断为主。细针穿刺活检具有穿刺创伤小、并发症少、操作便捷的优点，可以进行癌症的初诊或筛查。但是细针穿刺获取样本量太少，仅够癌症的初诊和筛查，难以继续进行细胞学病理诊断，进而难以获取病变结构信息，严重影响疾病的诊断准确度。

粗针穿刺活检所使用的穿刺针直径通常大于2毫米，能够取出2厘米长的病变组织。粗针穿刺活检结果能够明确病变性质，指导术前化疗、内分泌治疗和靶向治疗，因此粗针穿刺活检的诊断准确率要高于细针穿刺活检，临床上应用粗针穿刺活检的次数也相对较多。然而粗针穿刺活检也存在一定的弊端，由于粗针穿刺的创口较大，容易引起术后血肿以及感染的并发症。

发明内容

本发明的目的是解决现有细针穿刺获取样本量太少，仅够癌症的初诊和筛查，难以继续进行细胞学病理诊断，进而难以获取病变结构信息，严重影响疾病的诊断准确度；而粗针穿刺虽然样本量大，可以做多种细胞学病理诊断，但是其创口太大，容易引起一系列术后感染并发症的技术问题，而提供一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

1)制备得到纳米试管药物筛选板；所述纳米试管药物筛选板包括多个互相分离的纳米试管阵列，纳米试管阵列内包括多个纳米试管单元，每个纳米试管单元包括多个纳米试管；

2)对纳米试管药物筛选板进行预处理，使纳米试管管内洁净干燥；

3)根据待测细胞的种类选取可能有效果的药物，并将选取的药物配比成一系列浓度梯度的药物溶液；

4)将药物溶液灌注至纳米试管中，不同药物种类，不同药物浓度的溶液分别灌注至不同的纳米试管阵列中；

5)进行一次细针穿刺获取待测细胞，将待测细胞放置在纳米试管阵列的表面，进行细胞培养；

6)用染料进行细胞的死活双染；进行细胞死活的荧光观测；将灌注了不同药物种类，不同药物浓度的纳米试管阵列区域的荧光图像进行记录，分析不同区域的细胞死活状态，从而判断待测细胞对于不同种类药物以及对应不同浓度的耐受情况，进而评估筛选出最适合治疗待测细胞的药物种类以及对应的浓度。

进一步地，步骤1)中，所述纳米试管药物筛选板包括透明基体；所述透明基体的上表面设置有隔离结构，隔离结构将透明基体上表面划分成多个互相分离的试管区域；所述试管区域内设置有所述纳米试管阵列，纳米试管阵列包括多个不同的纳米试管单元；所述纳米试管单元由多个沿高度方向开设在透明基体上且开口朝上的盲孔组成，每个盲孔形成一个所述纳米试管，所述纳米试管用于注入所需的药物，纳米试管单元内纳米试管的密度根据药物浓度进行设置；所述纳米试管的最大开口宽度为20nm～单个目标细胞的最大铺展宽度；纳米试管的深度大于等于纳米试管的最大开口宽度，且小于等于200μm；相邻纳米试管之间的间距大于纳米试管的最大开口宽度且小于单个目标细胞的最大铺展宽度。

进一步地，步骤1)中，所述纳米试管药物筛选板的制备方法包括以下步骤：

1.1)通过调整微纳加工系统中的位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在透明基体表面加工出试管区域，并在试管区域之间形成隔离结构；

1.2)通过调整位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在试管区域内进行纳米试管的单脉冲加工，直至完成所有纳米试管的加工；

单脉冲加工过程中，位移台的速度大于纳米试管单元内单个纳米试管之间的间隔与飞秒激光输出频率的乘积；

1.3)将透明基体放置于刻蚀溶液中进行浸泡，至透明基体上的脱落部分完全剥离结束刻蚀，将透明基体清洗晾干，完成制造。

进一步地，步骤2)包括以下步骤：

2.1)将纳米试管药物筛选板浸泡于去离子水中进行超声清洗，直至纳米试管内没有残留的刻蚀液；

2.2)将纳米试管药物筛选板放入100℃烘干箱内烘干2小时，确保纳米试管内没有残留的去离子水。

进一步地，步骤4)具体为：

4.1)利用非接触式微量移液系统将药物溶液灌注至纳米试管中，不同药物种类，不同药物浓度的溶液分别灌注至不同的纳米试管阵列中；

4.2)将灌注后的纳米试管药物筛选板放在无菌通风的环境中静止8小时，待药物溶液彻底灌注至纳米试管的内部；

4.3)再利用细胞刮将纳米试管表面残留的药物残渣刮去。

进一步地，步骤5)具体为：

5.1)进行一次细针穿刺获取待测细胞，将获得的待测细胞制备成细胞悬液，放入细胞计数板中进行细胞计数，根据计数结果将细胞悬液进行一定比例的浓缩或稀释，配置成所需浓度的细胞悬液；

5.2)将灌注了药物的纳米试管药物筛选板放置在加好细胞培养液的共聚焦小皿中，将细胞悬液滴在纳米试管阵列的表面，盖上共聚焦小皿的盖子并摇晃，使细胞均匀的分布在共聚焦小皿内部；

5.3)进行细胞培养，培养时长为24-25h；

步骤6)具体为：

6.1)用染料进行细胞的死活双染；

6.2)清洗共聚焦小皿使染料无残留，并加入液体保持细胞的活力；

6.3)将共聚焦小皿放入荧光共聚焦显微镜中，进行细胞死活的荧光观测；

6.4)将灌注了不同药物种类，不同药物浓度的纳米试管阵列区域的荧光图像进行记录，分析不同区域的细胞死活状态，从而判断待测细胞对于不同种类药物以及对应不同浓度的耐受情况，进而评估筛选出最适合治疗待测细胞的药物种类以及对应的浓度。

进一步地，步骤5.2)中，将共聚焦小皿进行十字摇晃；

步骤5.3)中，培养时长为24h。

进一步地，6.1)具体为：用Assay buffer溶液浸泡清洗细胞，再分别用所需单位量的染料Calcein-AM染色30min、染料PI染色10min，进行细胞的死活双染；

6.2)具体为：染色完成后的共聚焦小皿用Assay buffer液体清洗一遍，保证没有染料残留，并加入新的Assay buffer液体保持细胞共聚焦观察时候的活力。

本发明的有益效果：

1.本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法，针对目前穿刺活检固有的缺点，采用纳米试管药物筛选板来实现小样本量的高通量细胞学病理诊断。纳米试管药物筛选板具有阵列化可控，区域化可控的特点，可以在一片透明基底上制备彼此分离的阵列化单元，每个单元都可以独立的灌注不同种类，不同浓度的待测药物，从而可以在一次少量细胞的培养过程中同时观察待测细胞在不同药物种类，不同药物浓度的存活状态。由此实现在样本量很少的情况下进行高通量的细胞学病理诊断，可以极大程度地节省癌症治疗中人力物力以及时间的耗费。同时所需样本量少，仅需一次细针穿刺的样本量就可以同时实现组织学和细胞学病理诊断，方便在纳米试管药物筛选板上实现多种药物的药效测试，这既给患者减少了多次穿刺的痛苦和心理负担，又降低了药物筛选过程中人力物力财力的损耗，最关键的是它为患者争取了宝贵的治疗时间。

2.本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法，用于检查的时间周期短，在一次检查中就可以多种药物，多种浓度同时测试，一次测试拿到多次测试的结果，极大的缩短时间周期。

3.本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法，所用的纳米试管药物筛选板是基于飞秒激光微纳加工和湿法刻蚀手段获得的，超高的制备效率可以有效地降低测试的物料成本，时间成本。

附图说明

图1为本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法实施例采用的纳米试管药物筛选板的结构示意图；

图2为本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法实施例采用的纳米试管药物筛选板中纳米试管阵列的结构示意图；

图3为本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法实施例中纳米试管阵列的侧面剖视图；

图4为本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法实施例中纳米试管阵列上表面的形貌图；

图5为本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法实施例中纳米试管开口大小可调的示意图，其中，E为500nm的小开口示意图，F为3000nm的大开口示意图；

图6为本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法实施例中纳米试管之间间距大小可调的展示图，其中，G的间距为2μm，H的间距为9μm；

图7为本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法实施例中细胞死活情况的荧光图像，其中(a)为活细胞荧光图像窗口，(b)为死细胞荧光图像窗口，(c)为荧光显微镜白场图像窗口，(d)为前三个象限图像的叠加显示。

附图标记：

1-透明基体，2-隔离结构，3-纳米试管阵列，4-纳米试管。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明进行详细的说明。

本发明一种小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的方法，包括以下步骤：

1)制备得到纳米试管药物筛选板；

如图1所示，本发明纳米试管药物筛选板包括透明基体1，透明基体1的上表面设置有隔离结构2，隔离结构2将透明基体1上表面划分成多个互相分离的试管区域，防止试管区域之间的药物互相串流，确保药物测试结果的准确可靠性。透明基体1可以是玻璃或熔融石英，本实施例采用熔融石英微片，熔融石英微片的长和宽随实际需要而改变，为了保持样品的可靠性，其厚度一般不小于200μm，其边长D1一般不小于1mm。试管区域内设置有纳米试管阵列3，纳米试管阵列3内设置多个纳米试管单元。如图2至图4所示，纳米试管单元由多个沿高度方向开设在熔融石英微片上且开口朝上的盲孔组成，每个盲孔形成一个纳米试管4，纳米试管4用于注入所需的药物，纳米试管单元内纳米试管4的密度根据药物浓度进行设置，本发明实施例中每个纳米试管阵列3设置了五个纳米单元，五个纳米单元的密度从上到下逐渐减小，局部展示图如图2所示，即通过控制单元面积内相邻纳米试管4的间隔和纳米试管4的数量进行密度控制。纳米试管4的最大开口宽度为20nm～单个目标细胞的最大铺展宽度，如图5所示为本发明纳米试管4开口大小可调的示意图。本实施例中纳米试管4的最大开口宽度为500nm，远小于细胞直径(5-200μm)。纳米试管4的开口宽度D5是根据湿法刻蚀的时间来控制的，刻蚀的时间越长纳米试管4的开口宽度越大。纳米试管4的深度D6大于等于纳米试管4的最大开口宽度，且小于等于200μm，其深度是通过激光加工的位移台高度来控制的，位移台位置越高加工的纳米试管4的深度越深。如图6所示，相邻纳米试管4之间的间距D4可调，一般取决于单个纳米试管4的最大开口宽度，大于纳米试管4的最大开口宽度且小于单个目标细胞的最大铺展宽度。纳米试管阵列3内纳米试管4的密度(即数量)根据所需药物的浓度梯度进行设置，一般而言一块1mm*1mm的正方形区域即可测试一种药物在100倍浓度之间变化的杀伤效果。本发明可通过调节纳米试管4的长径比来实现载药量的变化，通过调节纳米试管阵列区域内纳米试管4的密度(即数量多少)来实现纳米试管阵列区域内药物浓度的梯度变化。

纳米试管药物筛选板的不同区域一般是由隔离结构2(沟壑结构或者隆起结构)来实现区分的，通常会使用激光加工直写实现沟壑结构或热压印实现隆起结构。沟壑结构或者隆起结构的主要作用是为了避免不同种药物之间的液相互溶。本发明纳米试管药物筛选板的隔离结构设计为矮墙，矮墙沿周向设置在每个试管区域外围，矮墙的上表面高于试管区域的上表面，防止不同药物或不同浓度的药物的串流。矮墙的宽度D2一般大于100μm，高度大于100μm，宽度越长，高度越高，则阻隔液相互溶的效果越好。隔离结构2还可以设计成沟壑结构，沟壑结构沿周向设置在每个试管区域外围。沟壑结构的宽度D2一般大于等于50μm，深度大于80μm，宽度越长，深度越深，则阻隔液相互溶的效果越好。

纳米试管4在熔融石英微片的空间位置可以随意变换，可以与熔融石英微片有一定角度的倾斜，可以在熔融石英微片上成线性阵列排布，也可以成一定图案化规则排列，也可以在熔融石英微片上成一定图案化规则倾斜排列，多元化排布方式有利于不同药物的区分以及不同微生物的区分，同时也可以满足不同用户的审美需求。纳米试管4的开口形状具有可调性，纳米试管4的开口形状根据目标细胞的铺展形状确定，例如圆形、三角形或方形。纳米试管阵列3内多个纳米试管4的排布形状为指定的任意形状，包括线性阵列和图案化形状。多个纳米试管阵列3可集成在一个熔融石英微片上或分布在多个熔融石英微片上。

使用过程中，熔融石英微片上不同纳米试管阵列3内的药物其种类可以相同也可以不同，浓度可以相同也可以不相同。将所需浓度的药物预先加载在纳米试管4里，细胞生长在熔融石英微片表面后与细胞作用，不同的药物及浓度使细胞的存活状态发生差异，从而达到研究药物对细胞杀伤效果的目的。在临床上，一次穿刺获取的细胞组织就足够在一块熔融石英微片上实现多种药物的药效测试，这既给患者减少了多次穿刺的痛苦和心理负担，又降低了药物筛选过程中人力物力财力的损耗。最关键的是它可以在一个很小的结构上实现高通量的药物筛选，为患者争取了宝贵的治疗时间。

上述纳米试管药物筛选板的制备方法包括以下步骤：

1.1)通过调整微纳加工系统中的位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在熔融石英微片1表面直写出连通的沟壑结构，沟壑结构所围成的区域即为试管区域。位移台的移动速度为20μm/s～20000μm/s；飞秒激光的输出频率为10Hz～200kHz。飞秒激光光源的单脉冲能量范围为0.1μJ～20μJ，一般选择1μJ。

微纳加工系统是先利用锥透镜将飞秒激光输出的高斯飞秒脉冲整形成为类贝塞尔飞秒脉冲(长焦深、小焦点的针状光场)，再通过透镜组组成的4F系统将类贝塞尔飞秒脉冲引入100倍显微镜组成，利用位移台来实现样品较类贝塞尔飞秒脉冲的移动。

1.2)通过调整位移台的移动速度和飞秒激光的输出频率使飞秒激光在熔融石英微片表面进行纳米试管4的单脉冲加工，直至完成所有纳米试管4的加工。单脉冲加工过程中，所选用的速度和频率应遵循“位移台的速度大于单个纳米试管4之间的间隔与飞秒激光输出频率的乘积”这一标准。单脉冲加工出来的纳米试管阵列即为待刻蚀的纳米试管阵列。单脉冲持续时间范围为250fs～20ps，一般选择250fs。

1.3)刻蚀溶液选择摩尔浓度为10mol/L的KOH刻蚀溶液，在60℃下，将熔融石英微片放置于KOH溶液中进行浸泡，至熔融石英微片上的脱落部分完全剥离结束刻蚀，将熔融石英微片清洗晾干，完成制造。其他实施例中，刻蚀溶液也可以采用其他的酸性或碱性刻蚀溶液。

2)对纳米试管药物筛选板进行预处理，使纳米试管4管内洁净干燥；

2.1)将纳米试管药物筛选板浸泡于去离子水中进行超声清洗，直至纳米试管4内没有残留的刻蚀液。

2.2)将纳米试管药物筛选板放入100℃烘干箱内烘干2小时，确保纳米试管4内没有残留的去离子水。

3)根据待测细胞的种类选取可能有效果的药物，并将选取的药物配比成一系列浓度梯度的药物溶液。

4)灌注

4.1)利用非接触式微量移液系统将药物溶液灌注至纳米试管4中，不同药物种类，不同药物浓度的溶液分别灌注至不同的纳米试管阵列(3)中；

4.2)将灌注后的纳米试管药物筛选板放在无菌通风的环境中静止8小时，待药物溶液彻底灌注纳米试管4的内部；

4.3)再利用细胞刮将纳米试管4表面残留的药物残渣刮去，避免对检测结果造成影响，刮去残渣后待用。

5)细胞培养

5.1)进行一次细针穿刺获取待测细胞，将获得的待测细胞制备成细胞悬液，放入细胞计数板中进行细胞计数，根据计数结果将细胞悬液进行一定比例的浓缩或稀释，配置成所需浓度的细胞悬液。

5.2)将灌注了药物的纳米试管药物筛选板放置在加好细胞培养液的共聚焦小皿中，将细胞悬液滴在纳米试管阵列3的表面，盖上共聚焦小皿的盖子并进行“十字”摇晃，使细胞均匀的分布在共聚焦小皿内部。

5.3)进行细胞培养，培养时长为24h，其他实施例也可以是24-25h。

6)观察和筛选

6.1)用Assay buffer溶液浸泡清洗细胞，再分别用所需单位量的染料Calcein-AM染色30min、染料PI染色10min，进行细胞的死活双染；

6.2)染色完成后的共聚焦小皿用Assay buffer液体清洗一遍，保证没有染料残留，并加入新的Assay buffer液体保持细胞共聚焦观察时候的活力；

6.3)将共聚焦小皿放入荧光共聚焦显微镜中，进行细胞死活的荧光观测；

6.4)将灌注了不同药物种类，不同药物浓度的纳米试管阵列3区域的荧光图像进行记录，如图7所示，从图7(c)的白场图像可以看到单个纳米试管阵列3中由上到下包含了五个纳米试管4密度逐渐减少的纳米试管单元，图7(a)和图7(b)中五个纳米试管单元之间由上到下的结果分别代表了活细胞的数量逐渐变多和死细胞的数量逐渐减少，图7(d)则是将活细胞荧光图像窗口，死细胞荧光图像窗口和白场图像窗口叠加，方便进行更直观的整体观察。分析不同纳米试管单元内细胞的死活状态，即死细胞占总细胞数的比例，从而判断待测细胞对于不同种类药物及对应浓度的耐受情况，进而评估筛选出最适合治疗待测细胞的药物种类以及对应的浓度。

本发明方法可根据步骤6)中得到的结果，辅助医生对于病人病情的判断，达到了以少量细胞样本实现高通量药物细胞毒性筛选的目的，实现对术前化疗、内分泌治疗和靶向治疗的指导。

本方法是利用透明材料表面制备的纳米试管药物筛选板为容器，将可能对待测细胞有杀伤毒性的不同种类，不同浓度的药物灌注到纳米试管4中，将一次细针穿刺得到的少量待测细胞培养在一系列纳米试管阵列3上，预先灌注在纳米试管4里的药物会在细胞生长在纳米试管阵列3上之后与细胞作用，不同的药物及浓度使细胞的存活状态发生差异，从而达到以少量细胞实现高通量药物细胞毒性筛选的目的，进而实现对术前化疗、内分泌治疗和靶向治疗的指导。

本发明小样本量实现高通量药物细胞毒性筛选的核心是利用纳米试管阵列作为细胞培养的载体。因纳米试管阵列单个纳米试管面积小，整体排列可成阵列化分布的特点使其具备在很小一块区域获得高通量实验结果的能力。从而仅需很少的样本量就可以完成较以往技术几倍，几十倍的检测工作，进而缩短癌症诊断的物料成本和时间周期，为患者争取宝贵的治疗时间。