一种靶向CLEC5A的小分子抑制剂及其应用

技术领域

本发明涉及小分子化合物技术领域，特别是涉及一种靶向CLEC5A的小分子抑制剂及其应用。

背景技术

髓系C型凝集素5A(C-type lectin domain containing 5A，CLEC5A)也称为髓系DAP12相关凝集素1(MDL-1)，是一种II型跨膜受体，主要在单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中表达。CLEC5A的短胞质结构域与含有ITAM的跨膜接头DAP-12相互作用，并导致DAP-12磷酸化，随后通过Syk激酶传递信号。CLEC5A不具有完整的Ca

到目前为止，CLEC5A已被证明能够识别多种病毒病原体，包括登革热病毒(Denguevirus，DV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)和流感病毒。CLEC5A与DV结合并激活信号级联，同时释放促炎性细胞因子有助于DV感染患者的病理生理变化。CLEC5A识别DV后，DAP-12被磷酸化，导致Syk活化；随后诱导促炎细胞因子IL-1β和IL-18，激活NLRP3炎症小体和caspase-1，最终触发细胞焦亡。此外，DV可以上调CLEC5A的表达，进而激活小鼠单核吞噬细胞中的核因子Nrf2，导致增强肿瘤坏死因子(TNF)-α的生成。抗体介导的CLEC5A阻滞剂减弱了由DV感染的巨噬细胞产生的促炎性细胞因子，这表明CLEC5A靶向可以改善组织损伤。CLEC5A与骨髓源性破骨细胞中的DAP-12和DAP-10结合后，在破骨细胞生成和骨重塑中也是必不可少的。破骨细胞是多核巨细胞，与巨噬细胞不同，参与骨重塑。破骨细胞的DV感染最近被证明可以上调溶骨活性。

在Clec5a

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种靶向CLEC5A的小分子抑制剂及其应用，本发明通过数据库分析发现能与CLEC5A结合的小分子化合物；然后，通过SPR等实验验证小分子化合物与CLEC5A的结合；最后，通过功能验证确认小分子化合物的效果。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种靶向CLEC5A的小分子抑制剂，所述小分子抑制剂的结构为如下结构中的任一种：

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备治疗乙肝药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备抑制乙肝病毒复制药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备诱导干扰素药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备降低乙肝病毒感染血清中HBsAg含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备降低乙肝病毒感染血清中HBV DNA含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备降低乙肝病毒感染肝脏内HBcAg含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备增加乙肝病毒感染血清中HBs Ab含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备增加乙肝病毒感染血清中Ifnɑ含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备增加乙肝病毒感染血清中Ifnβ含量药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供的小分子抑制剂对CLEC5A蛋白显示出优异的体外亲和力，对HBV复制的抑制和干扰素的诱导有很强的作用以及低细胞毒性，靶向CLEC5A的小分子抑制剂C4治疗持续降低血清HBsAg和HBV DNA以及肝内HBcAg的水平，同时增加血清HBsAb的阳性率和水平，以及血清Ifnα和Ifnβ的水平。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为筛选靶向CLEC5A的小分子化学抑制剂的流程；

图2为5个小分子化学的化学式及与与固定化CLEC5A蛋白的多种浓度的结合曲线；

图3为功能筛选靶向CLEC5A的小分子抑制剂；

图4为靶向CLEC5A的小分子抑制剂C2和C4的CC50和IC50值；

图5为靶向CLEC5A的小分子抑制剂C4小鼠体内功能确定；

图6为确定靶向CLEC5A的小分子抑制剂C4与CLEC5A的结合。

具体实施方式

本发明提供了一种靶向CLEC5A的小分子抑制剂，所述小分子抑制剂的结构为如下结构中的任一种：

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备治疗乙肝药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备抑制乙肝病毒复制药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备诱导干扰素药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备降低乙肝病毒感染血清中HBsAg含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备降低乙肝病毒感染血清中HBV DNA含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备降低乙肝病毒感染肝脏内HBcAg含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备增加乙肝病毒感染血清中HBs Ab含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备增加乙肝病毒感染血清中Ifnɑ含量药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的小分子抑制剂在制备增加乙肝病毒感染血清中Ifnβ含量药物中的应用。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

实验方法及结果：

(1)高通量筛选靶向CLEC5A的小分子抑制剂

首先，本发明使用计算机辅助高通量虚拟筛选来筛选靶向CLEC5A的小分子化学抑制剂，根据如图1所示的步骤，CLEC5A(PDB ID:2YHF)的晶体结构从RCSB蛋白质数据库获得(https://www.rcsb.org)。通过Discovery Studio 2020软件(BIOVIA，USA)中的LibDock程序，使用包含1539916种化合物的小分子文库(通过Lipinski的无规则过滤)，包括市售文库(例如ChemDiv和ChemBridge)和自建文库，对CLEC5A蛋白进行分子对接，确定了36582个候选化合物。然后，根据LibDockScore的值对前2000个小分子候选进行排序，并进行灵活的对接程序。然后，通过表面等离子体共振(SPR)分析筛选了根据CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值排名的柔性对接中的前200个化合物，以测试它们与CLEC5A蛋白的直接相互作用。最后，五种化合物(C1-C5，分别为0242-0318、0104-0071、0242-0435、1869-0197和1262-0251，分子结构见图2)对CLEC5A蛋白显示出优异的体外亲和力，Kd值<1μM，并进行了随后的功能测试(见图2)。

(2)功能筛选靶向CLEC5A的小分子抑制剂

为了在体外测试五种化合物的功能作用，用PMA将THP-1诱导为巨噬细胞

(3)靶向CLEC5A的小分子抑制剂C2和C4的CC

随后，本发明进一步确定靶向CLEC5A的小分子抑制剂C2和C4的CC

为了检测C2和C4的IC50，用PMA将THP-1诱导为巨噬细胞

(4)靶向CLEC5A的小分子抑制剂C4小鼠体内功能确定

接下来，将C4注射到感染HBV的C57BL/6J小鼠模型中，进一步在体内测试它们的作用。简而言之，C57BL/6J小鼠(18-20g)通过流体动力学注射10ug pAAV/HBV1.2感染HBV。一周后，测定血清HBVDNA、HBsAg和HBeAg水平，并选择30只HBV DNA高(5×10

(5)确定靶向CLEC5A的小分子抑制剂C4与CLEC5A的结合

最后，本发明又将C4小分子与CLEC5A的结合进行了独立实验验证。首先，为了检测小分子化合物C4是否与内源性人CLEC5A或小鼠CLEC5A结合，我们通过化学反应在C4小分子化合物上偶联了生物素，在

其次，结构对接分析预测也证实了人CLEC5A或鼠CLEC5A蛋白与生物素缀合的C4的直接结合(图6中B)。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。