一种可调节宿主免疫应答和抑制虫体生长的si-let-7-5p序列及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体为一种可调节宿主免疫应答和抑制虫体生长的si-let-7-5p序列及其应用。

背景技术

多房棘球蚴病(Echinococcosis multilocularis)是由多房棘球绦虫的中绦期—多房棘球蚴感染人或动物引起的一种危害严重的寄生虫病，又称为泡球蚴病(AlveolarEchinococcosis，AE)，世界卫生组织将其列为20种被忽视的热带病之一。多房棘球蚴的生活史通常包括作为终末宿主的犬科动物(主要是狐狸和狗)和作为中间宿主的小型哺乳动物(啮齿动物)。人通过摄入终末宿主排出的虫卵而感染。AE患者中，98％的感染主要发生在肝脏，确诊后未经治疗或治疗不良的患者10～15年内的死亡率高达94％，故又名“虫癌”。因此，AE被认为是最致命的慢性寄生虫病之一，严重威胁人类健康和生命安全。

巨噬细胞是先天性免疫系统中的一种具有高度可塑性和多功能的细胞，在宿主防御、炎症、免疫调节和组织修复等方面发挥重要作用。在不同微环境刺激下可极化为两种不同的表型:M1型(促炎表型)和M2型(抗炎表型)。M1型巨噬细胞分泌iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子，对清除细菌、病毒和真菌等感染至关重要。M2型巨噬细胞高表达Arg1、Ym1和CD206，分泌IL-10等抗炎细胞因子，对血管生成和伤口愈合有促进作用。研究报道，小鼠多房棘球蚴感染早期，巨噬细胞以M1表型诱导Th1免疫应答，分泌促炎细胞因子，参与虫体杀伤和清除；在感染后期则以M2表型诱导Th2型免疫应答，分泌抗炎细胞因子，参与虫体的持续感染过程。表明多房棘球蚴的感染过程存在巨噬细胞型别转换。

microRNA(miRNA)是一类小的调节性非编码RNA，主要通过下调mRNA水平或转录抑制，从而负调控蛋白编码基因的表达。研究表明，包括棘球蚴在内的多种寄生虫都能编码miRNA，其中一些miRNA与寄生虫感染密切相关。在扁形动物中，let-7高度保守且具有复杂的进化模式，可能参与寄生虫的发育和感染。微小隐孢子虫感染诱导胆管细胞let-7i下调，从而导致其靶基因TLR4的上调表达。进一步研究发现，实验性敲低let-7i显著逆转了微小隐孢子虫诱导的TLR4表达，使荷虫量显著降低，表明let-7i在抗寄生虫感染的免疫应答中发挥重要作用。最新研究报道，豆状囊尾蚴let-7-5p可通过调节靶基因C/EBPδ的表达，诱导巨噬细胞向M2表型极化，从而导致宿主免疫抑制，这可能有利于虫体在宿主体内的长期寄生。let-7-5p是寄生蠕虫高表达的miRNA之一，且在绦虫蚴中序列完全一致。多房棘球蚴外泌体和感染小鼠血清中都存在虫源let-7-5p，推测多房棘球蚴let-7-5p在调节宿主免疫应答中发挥重要作用，敲低或抑制let-7-5p可能对多房棘球蚴诱导的巨噬细胞极化和虫体生长发育产生影响。因此，设计并合成可抑制let-7-5p表达的DNA序列，通过适当的方式导入小鼠体内后，就可以敲低或抑制let-7-5p的表达，进而可以调节小鼠腹腔巨噬细胞极化和原头蚴生长发育，从而为研制多房棘球蚴病新型治疗药物奠定基础。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种可调节宿主免疫应答和抑制虫体生长的si-let-7-5p序列，同时本发明还提供了通过重组腺相关病毒将si-let-7-5p定向运输到小鼠肝脏，从而调节小鼠的免疫应答和抑制棘球蚴的生长。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种可调节宿主免疫应答和抑制虫体生长的si-let-7-5p序列，其特征在于：针对多房棘球蚴let-7-5p序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述；设计针对let-7-5p的海绵(sponge)序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述，并将4条海绵序列通过接头序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，串联成为si-let-7-5p，构建pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p重组表达载体。

pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p体外抑制细胞let-7-5p的表达。

AAV8-si-let-7-5p可抑制小鼠腹腔巨噬细胞的极化。

AAV8-si-let-7-5p可抑制多房棘球蚴的生长。

本发明的有益效果为：

1、设计合成的si-let-7-5p可有效抑制细胞let-7-5p的表达；

2、重组腺相关病毒(AAV8-si-let-7-5p)可将si-let-7-5p定向运输到宿主肝脏，并能抑制let-7-5p的表达，上调C/EBPδ的表达；

3.si-let-7-5p不仅能调节巨噬细胞的极化，而且可以抑制多房棘球蚴的生长发育。因此，AAV8-si-let-7-5p可用于多房棘球蚴病的治疗。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p重组质粒的构建图；

图2体外验证let-7-5p海绵载体的抑制效果图；

图3Western blot检测小鼠肝脏中GFP的表达图；其中：1为PBS组；2为AAV8-control组；3:为AAV8-si-let-7-5p组；M为蛋白marker；

图4qRT-PCR检测小鼠肝脏中let-7-5p和C/EBPδ表达图；

图5qRT-PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞中let-7-5p、C/EBPδ和M1/M2相关分子的表达图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

1.si-let-7-5p序列的设计与合成

针对多房棘球蚴let-7-5p序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述；设计针对let-7-5p的海绵(sponge)序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述，并将4条海绵序列通过接头序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，串联成为si-let-7-5p，构建pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p重组表达载体；如图1所示。

2.pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p抑制效果验证

let-7-5pmimics和pAV-CMV-GFP-si-let-7-5p质粒共转染293T细胞后，显著逆转了let-7-5pmimics诱导的let-7-5p过表达(P<0.001)。表明let-7-5p海绵质粒可特异性抑制let-7-5p的表达，其抑制效率达94.6％；如图2所示。

3.重组腺相关病毒(AAV8-si-let-7-5p)的包装、纯化和滴度测定

由山东维真生物科技公司完成。

4.AAV8-si-let-7-5p的接种与表达检测

将70只BALB/c小鼠分为3组：PBS组(20只)、AAV8-control组(20只)和AAV8-si-let-7-5p(30只)。PBS组小鼠每只尾静脉注射200μL无菌PBS；AAV8-control组和AAV8-si-let-7-5p组小鼠分别尾静脉注射200μL重组腺相关病毒(病毒滴度：2×1011vg/mL，稀释液为PBS)。在接种重组病毒两周后，随机选取PBS组、AAV8-control组和AAV8-si-let-7-5p组的小鼠各1只，提取肝组织总蛋白，进行Westernbloting分析，结果(图3)发现，AAV8-control和AAV8-si-let-7-5p组小鼠肝脏中均检测到GFP蛋白表达，而PBS组小鼠却未检测到。说明重组病毒AAV8-si-let-7-5p成功靶向小鼠肝脏。同时，每组随机选取1只小鼠，提取肝脏总RNA，qRT-PCR检测let-7-5p和C/EBPδ的相对表达水平。结果显示(图4)，AAV8-si-let-7-5p组小鼠肝脏中let-7-5p的表达水平显著降低(图4A，P<0.01)，而C/EBPδ的水平却显著升高(图4B，P<0.05)。表明重组AAV8不仅能在肝脏表达，而且抑制了let-7-5p的表达，从而导致C/EBPδ的表达升高。

5.AAV8-si-let-7-5p可抑制小鼠腹腔巨噬细胞的极化

用AAV8-si-let-7-5p尾静脉注射BALB/c小鼠，两周后每只小鼠腹腔接种1000个原头蚴。qRT-PCR结果显示(图5)，在感染后3个月，与PBS组和AAV8-control组相比，通过AAV8-si-let-7-5p敲低let-7-5p后，其靶基因C/EBPδ的表达上调(图5A，P<0.05)，从而促进M1型相关分子IL-1β和iNOS的表达(图5B，P<0.05)，抑制M2型相关分子Arg-1的表达(图5C，P<0.05)。同时，AAV8-si-let-7-5p组IL-6和IL-4的水平显著低于PBS组和AAV8-control组，而IL-10的水平显著高于PBS组和AAV8-control组(P<0.05)。提示通过AAV8-si-let-7-5p敲低小鼠体内的let-7-5p，可抑制腹腔巨噬细胞向M2表型极化。

6、AAV8-si-let-7-5p抑制了多房棘球蚴的生长

小鼠多房棘球蚴的统计结果显示，PBS组、AAV8-control组和AAV8-si-let-7-5p组的平均包囊重量和原头蚴数量分别为42mg和2347个、41mg和2341个、31mg和881个。与AAV8-control组相比，AAV8-si-let-7-5p组包囊重量和原头蚴数量均显著降低，减虫率达62.4％。以上结果表明，敲低多房棘球蚴let-7-5p可显著抑制虫体的生长发育。

表2多房棘球蚴包囊重量(mg)和原头蚴数量统计分析

上面结合附图对本申请的实施例进行了描述，但是本申请并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本申请的启示下，在不脱离本申请宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，均属于本申请的保护之内。