人抗AAV2衣壳多克隆抗体表位
文献发布时间：2023-06-19 09:49:27
本专利申请要求2018年5月4日提交的美国临时专利申请62/667360号的优先权，并且该文献据此全文以引用方式并入。
本发明得到了美国政府支持，由美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)颁发了授权书NS088399。美国政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
病毒中和抗体(NtAb)表位作图可有助于用于预防和/或治疗感染性疾病的新疫苗和药物的开发。另外，病毒NtAb表位作图可有助于基因递送载体的开发。对病毒NtAb表位的鉴定与了解可协助病毒载体组分的可避开宿主免疫应答的基因工程，因为宿主免疫应答可能成为有效体内基因治疗的障碍。
腺相关病毒(AAV)是有望用于基因疗法的体内基因递送载体。然而，在将AAV用作体内基因递送载体方面仍有各种问题有待解决，包括需要针对有益临床结果的高载体剂量、有效限制针对病毒蛋白的宿主免疫应答、混杂的病毒嗜性、以及预先存在的抗AAV中和抗体在人体内的盛行率。
已从人类和非人类灵长类组织中分离出多种天然存在的血清型和亚型(Gao G等人，J Virol(《病毒学杂志》)，第78期，第6381-6388页，2004年和Gao G等人，Proc NatlAcad Sci USA(《美国科学院院报》)，第99期，第11854-11859页，2002年)。在新近鉴定出的AAV分离株中，AAV血清型8型(AAV8)和AAV血清型9型(AAV9)受到关注，因为衍生自这两种血清型的重组AAV载体可转导多种器官，包括肝脏、心脏、骨骼肌以及在经由外周全身施用后具有很高疗效的中枢神经系统(Foust KD等人，Nat Biotechnol(《自然·生物技术》)，第27期，第59-65页，2009年；Gao等人，2004年，同上文；Ghosh A等人，Mol Ther(《分子治疗》)，第15期，第750-755页，2007年；Inagaki K等人，Mol Ther(《分子治疗》)，第14期，第45-53页，2006年；Nakai H等人，J Virol(《病毒学杂志》)，第79期，第214-224页，2005年；Pacak CA等人，Circ Res(《循环研究》)，第99期，e3-e9，2006年；Wang Z等人，Nat Biotechnol(《自然·生物技术》)，第23期，第321-328页，2005年；以及Zhu T等人，Circulation(《循环》)，第112期，第2650-2659页，2005年)。
已经假定AAV8和AAV9载体的稳健转导性归因于这些细胞类型的强嗜性、载体的有效细胞摄取量和/或病毒体外壳在细胞中的快速脱壳(Thomas CE等人，J Virol(《病毒学杂志》)，第78期，第3110-3122页，2004年)。此外，性能更好的衣壳工程化AAV载体的出现大大拓宽了AAV载体作为载体工具包的效用(Asokan A等人，Mol Ther(《分子治疗》)，第20期，第699-708页，2012年)。AAV载体介导基因疗法的概念验证已在人类疾病的许多临床前动物模型中得到证实。已针对包括下列的遗传疾病展开或完成I/II期临床研究：B型血友病(MannoCS等人，Nat Med(《自然·医学》)，第12期，第342-347页，2006年和Nathwani AC等人，NEngl J Med(《新英格兰医学杂志》)，第365期，第2357-2365页，2011年)；肌营养不良(Mendell JR等人，N Engl J Med(《新英格兰医学杂志》)，第363期，第1429-1437页，2011年)；心力衰竭(Jessup M等人，Circulation(《循环》)，第124期，第304-313页，2011年)；致盲性视网膜病(Maguire AM等人，Lancet(《柳叶刀》)，第374期，第1597-1605页，2009年)；α1抗胰蛋白酶缺乏症(Flotte TR等人，Hum Gene Ther(《人类基因治疗》)，第22期，第1239-1247页，2011年)；以及脊肌萎缩症(Mendell JR等人，N Engl J Med(《新英格兰医学杂志》)，377期，第1713-1722页，2017年)等等。
虽然AAV载体已广泛用于临床前动物研究并且已在临床安全性研究中进行了测试，但目前AAV载体介导型基因递送系统对于更广泛的临床应用而言通常仍是次优的。AAV病毒衣壳蛋白的序列限定了特定AAV载体的许多特征。例如，衣壳蛋白影响特征，诸如衣壳结构和组装、与AAV非结构蛋白诸如Rep和AAP蛋白的相互作用、与宿主体液和细胞外基质的相互作用、血液中病毒的清除率、血管通透性、抗原性、对NtAb的反应性、组织/器官/细胞类型嗜性、细胞附着与内化效率、细胞内运输途径和病毒体脱壳速率。此外，给定AAV衣壳氨基酸序列与AAV载体特性之间的关系是不可预测的。
预先存在的抗AAV衣壳的NtAbs在人体中的高盛行率显著阻碍了AAV载体介导型基因疗法的成功。人们一直在关注开发可避开NtAb的“隐形”AAV载体；然而，此类AAV载体的形成通常依赖于关于NtAb表位的更全面信息，该信息目前仍然有限，因为尚无对动物和人血清中的多克隆抗AAV衣壳抗体进行简单有效地表位作图的方法。
DNA条形码AAV2R585E六肽(HP)扫描衣壳突变体库已经产生，其中AAV2衍生的HP被其它血清型衍生的那些替换。这些库已经静脉注射到小鼠携带的抗AAV1或AAV9衣壳抗体中，这导致鉴定出作为小鼠血清中抗AAV NtAb的表位的AAV1衣壳中的452-QSGSAQ-457(SEQID NO:1)和AAV9衣壳中的453-GSGQN-457(SEQ ID NO:2)(Adachi K等人，Nat Commun(《自然·通讯》)，第5期，第3075页，2014年)。这些表位对应于衣壳上三重对称轴突起的最高峰。此外，通过相同的体内方法，此区域也可用作小鼠抗AAV7 NtAb的表位。被称为“AAV条形码序列(AAV Barcode-Seq)”基于测序的高通量方法可实现对数百种不同AAV菌株的表型的表征，并且可应用于抗AAV NtAb表位作图。
附图说明
结合附图，根据以下说明和所附权利要求，本文公开的实施方案将变得更完全显而易见。这些附图仅示出典型的实施例，其将通过使用附图以另外的特殊性和细节进行描述，在所述附图中：
图1A示出了经DNA条形编码的AAV基因组的图谱，该AAV基因组包含AAV2 pA下游的一对12个核苷酸长的DNA条形码(lt-VBC和rt-VBC)。每个病毒条形码(VBC)可单独进行PCR扩增。这类经DNA条形编码的AAV载体基因组曾用于本发明人的早期研究中，例如，发表于以下期刊中的研究：Adachi K等人，Nat Commun(《自然·通讯》)，第5期，第3075页，2014年。
图1B示出了经DNA条形编码的双链(ds)AAV-U6-VBCLib载体基因组的图谱。该dsAAV-U6-VBCLib载体基因组包含0.6kb的人U6小核(sn)RNA启动子驱动的非功能性无编码RNA表达盒，该RNA表达盒包含一对12个核苷酸长的DNA条形码(lt-VBC和rt-VBC)(EarleyLF等人，J Virol(《病毒学杂志》)，第91期，2017年)。载体基因组也包含源自细菌lacZ基因开放读码框架(ORF)的填充片段DNA。该dsAAV-U6-VBCLib载体质粒被设计成用于将DNA条形码表达成AAV载体转导细胞中的RNA条形码(Adachi K等人，Mol Ther(《分子治疗》)，第22期，2014年)。我们最近的AAV条形码序列研究中的许多研究(包括下文提出的研究)已使用dsAAV-U6-VBCLib AAV载体基因组。
图1C是AAV9衣壳的双丙氨酸(AA)扫描诱变的表示。
图1D是AAV2R585E衣壳以两个氨基酸间隔进行的六肽(HP)扫描诱变的表示。
图1E是AAV条形码序列分析过程的表示。从每个样本获得的PCR产物按样本特定条形码进行索引编码，样本特定条形码附接到PCR引物。这实现了多路复用ILLUMINA测序。表型差异(PD)值提供关于每种血清型或突变体的表型(受体结合、转导、嗜性、血液清除率、对NtAb的反应性、血液-脑脊液屏障(BCSFB)渗透性等)谱的信息。
图2示出了AAV9六肽(HP)扫描突变体和AAV9十二肽(DP)扫描突变体，其中AAV9衍生的HP或DP被AAV2衍生的那些替换。
图3示出了AAV5十二肽(DP)扫描突变体，其中AAV5衍生的DP被AAV2衍生的那些替换。
图4示出了IP序列的过程。
图5示出了使用AAV9-HP库对人血清样本中存在的多克隆抗AAV2抗体的构象表位进行作图的结果。比较由四个不同截止值生成的数据。此分析清楚地揭示了常见的人抗AAV2衣壳多克隆抗体构象表位。
图6示出了通过具有包含AAV9-HP和突变体AAV9-DP突变体两者的库的IP序列鉴定出的常见人抗AAV2衣壳多克隆抗体构象表位。
图7示出了通过具有AAV5-DP突变体库的IP序列鉴定出的常见人抗AAV2衣壳多克隆抗体构象表位。
图8示出了通过具有AAV9-HP突变体库的体内PK-Seq鉴定出的常见人抗AAV2衣壳多克隆中和抗体构象表位。
图9示出了通过具有AAV9-DP突变体库的体内PK-Seq鉴定出的常见人抗AAV2衣壳多克隆中和抗体构象表位。
图10示出了用于鉴定人抗AAV衣壳多克隆中和抗体逃逸突变体的方法。
图11示出了AAV2、AAV2Ep123mt1和AAV9载体在存在或不存在包含高滴度的人抗AAV衣壳多克隆中和抗体的Gammagard(静脉注射用人免疫球蛋白)的情况下转导CHO-K1细胞的能力。
图12示出了ELISA数据，表明将20μl血清样本或IVIG与1×10
图13示出了我们已经针对AAV2衣壳鉴定出的表位以及其它AAV血清型(AAV1、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13)的潜在表位。
图14是示例，示出了使用AAV5-DP突变体的IP序列可鉴定出更多的使用AAV9-HP突变体的IP序列无法鉴定出的包括抗AAV2抗体的氨基酸序列。
具体实施方式
应当容易理解，如本文一般性描述的实施方案是示例性的。以下对各种实施方案的更详细描述不旨在限制本公开的范围，而是仅仅表示各种实施方案。此外，在不脱离本公开的范围的情况下，本领域的技术人员可改变本文所公开的方法的步骤或动作的顺序。换句话讲，除非对于实施方案的正确运行需要特定顺序的步骤或动作，否则可以修改特定步骤或动作的顺序或用途。
本公开提供了鉴定突变型AAV衣壳蛋白的方法。在某些实施方案中，AAV衣壳蛋白相对于第一AAV菌株AAVx的野生型序列是“突变的”或“改变的”，其中突变体AAVx衣壳蛋白包括至少一个改变的衣壳表位，该方法包括以下步骤：(1)制备多个AAVx衣壳突变体，其中每个AAVx衣壳突变体包括一个或多个改变的氨基酸，并且其中每个AAVx衣壳突变体按病毒特定条形码进行索引编码；(2)使多个AAVx衣壳突变体与多个抗体反应，其中每个抗体结合到AAV衣壳蛋白上的一个或多个表位；(3)收集结合到一个或多个抗体的AAVx衣壳突变体；(4)鉴定结合到一个或多个抗体的AAVx衣壳突变体。突变型AAV衣壳可被构造成逃逸抗体结合或中和。
当指涉基因时，术语“野生型”以其普通含义使用，并且被定义为具有与动物物种、细胞或病毒菌株中的对应基因相同的蛋白编码核苷酸序列的基因。就多态性基因序列而言，“野生型”是指该动物物种、细胞或病毒菌株中最常见形式的基因的序列。术语“野生型”也可与其氨基酸序列与该蛋白的氨基酸序列的最常见形式相同的蛋白结合使用。当与特定菌株例如AAV菌株结合使用时，“野生型”是指该菌株中特定蛋白的最常见氨基酸序列。术语“突变体”或“突变的”也以其普通含义使用，并且被定义为不具有与该动物物种、细胞或病毒菌株中的对应野生型基因相相同的蛋白编码核苷酸序列的基因。突变可为以下中的一项或多项：(1)一个或多个核苷酸的变化，尤其是在此类变化改变由核苷酸序列编码的氨基酸序列的情况下；(2)一个或多个核苷酸的缺失，或(3)一个或多个核苷酸的插入。术语“改变的”可用于表示核苷酸或蛋白已用不同于野生型的核苷酸或蛋白质序列合成产生。术语“突变体”也可指对基因的复制体的数目或者对控制其表达的元件中的一个或多个元件的改变。
在某些实施方案中，一个或多个改变的氨基酸是随机的或被随机地测定。在其它实施方案中，一个或多个改变的氨基酸衍生自非AAVx的第二AAV菌株。
“AAVx”中的“x”可指任何AAV菌株(血清型、变体和衣壳工程化突变体)。在某些实施方案中，第一AAV菌株AAVx为AAV2。在此类实施方案中，多个抗体可包括抗AAV2衣壳抗体。在其它实施方案中，第一AAV菌株AAVx为AAV9。多个抗体可包括抗AAV9衣壳抗体。
在鉴定突变型AAV衣壳蛋白的方法的某些实施方案中，步骤(3)收集结合到一个或多个抗体的AAVx衣壳突变体包括免疫沉淀结合到一个或多个抗体的AAVx衣壳突变体。下文提供了示例。
本文所述方法的步骤(4)，对按病毒特定条形码进行索引编码并且结合了一个或多个抗体的AAVx衣壳突变体的鉴定可如本文所述进行或通过使用其它下一代DNA测序(NGS)或其它高通量测序方法进行。
本公开还提供了下列项的产生过程：通过上述方法鉴定出的突变型AAV衣壳；包括此类突变型AAV衣壳的AAV载体；包含此类AAV载体以及可药用的佐剂、赋形剂、载子或稳定剂的药物组合物；对此类突变型AAV衣壳蛋白进行编码的核酸序列；以及包括此类核酸序列的基因构建体，诸如质粒和病毒基因组。本文所述的AAV载体可用于将基因引入哺乳动物细胞中，例如用于基因治疗。药物组合物可用于基因治疗、用作疫苗或用于其它治疗目的。
本公开还提供了基因递送载体产物，该基因递送载体产物包括治疗有效量的一种或多种本文所述的AAV衍生衣壳以及可药用的佐剂、赋形剂、载子或稳定剂。AAV衍生衣壳可衍生自AAV2。
本文提供的基因递送载体产物和疫苗可包括药学有效量的如本文所述的至少一种AAV衍生衣壳或新型AAV衣壳，并且利用本领域已知的合适的佐剂、赋形剂、载子和/或稳定剂将一种或多种基因引入靶细胞或组织中，或将其用于接种以通过刺激抗体的产生而产生对疾病的免疫应答。可用于本发明的赋形剂、载子和/或稳定剂是常规的，并且可包括缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和增溶剂。一般来讲，载子或赋形剂的性质将取决于所采用的具体施用模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射流体作为溶媒，可注射流体包括药学上和生理学上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒固体载子可包括例如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载子之外，待施用的药物组合物还可包含微量的无毒辅助性物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
疫苗中包括的佐剂可选自：矿物油基佐剂，优选弗氏完全佐剂或不完全佐剂；蒙旦不完全Seppic佐剂，优选ISA；水包油乳液佐剂，优选Ribi佐剂体系；含有胞壁酰二肽的syntax佐剂制剂；以及铝盐佐剂。
在一些实施方案中，佐剂是矿物油基佐剂，尤其是ISA206(法国巴黎的赛比克公司(SEPPIC,Paris,France))或ISA51(法国巴黎的赛比克公司)，或选自CpG、咪唑并喹啉、MPL、MDP、MALP、鞭毛蛋白、LPS、LTA、霍乱毒素、霍乱毒素衍生物、HSP60、HSP70、HSP90、皂草苷、QS21、ISCOM、CFA、SAF、MF59、金刚烷、氢氧化铝、磷酸铝和细胞因子。在一些实施方案中，根据本发明的组合物、疫苗和/或基因递送载体包括多于一种、优选两种佐剂的组合。
术语“治疗有效量”或“药学有效量”是指当施用给需要此类治疗的个体(例如哺乳动物，诸如人)时足以产生治疗效果的量，如下文所定义。治疗有效量或药学有效量将根据所治疗的个体和病症、个体的体重和年龄、病症的严重性、施用方式等而变化，这些可易于由本领域的普通技术人员确定。例如，如本文所述的AAV2衍生衣壳的“治疗有效量”或“药学有效量”是足以在个体(例如人)中生成免疫应答的量。在一些实施方案中，免疫应答足以提高AAV衣壳中和抗体针对个体内相关衣壳的抗性。
扫描肽的长度可为任何长度，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在某些实施方案中，扫描肽的长度介于六个和十二个氨基酸之间。在某些实施方案中，每个AAVx衣壳突变体包括至少五个、至少六个、至少十二个、或介于六个和十二个之间的改变的氨基酸。
本公开还提供了在表位的氨基酸序列中包括一次或多次突变的AAVx衍生衣壳，其中表位选自表位1、表位2、表位3、表位4、表位5、表位6、表位7、表位8、表位9或表位10中的至少一者。突变的表位氨基酸序列可以是随机的。另选地，突变的表位氨基酸序列可衍生自除AAVx之外的AAV菌株。在某些实施方案中，AAVx为AAV2。
在某些实施方案中，AAVx衍生衣壳在表位中的氨基酸序列中包括一次或多次突变，其中表位选自以下中的至少一者：表位1：439-DQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASD-469(SEQ ID NO:5)；表位2：650-NTPVPANPSTTFSAAKFASFITQ-672(SEQ ID NO:6)；表位3：700-YTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGT-728(SEQ ID NO:7)；表位4：243-STRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNH-271(SEQ ID NO:9)；表位5：320-VKEVTQNDGTTTIANNLT-337(SEQ ID NO:10)；表位6：498-SEYSWTGATKYHLNGRDSL-516(SEQ ID NO:11)；表位7：523-MASHKDDEEKF-533(SEQ ID NO:12)；表位8：534-FPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMIT-560(SEQID NO:13)；表位9：570-PVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVN-596(SEQ ID NO:8)；或表位10：409-FTFSYTFEDVPFHS-422(SEQ ID NO:52)。AAVx可为AAV2。如本文所提供的AAVx衍生衣壳可被构造成逃逸抗体结合或中和。
本公开还提供了包括此类AAVx衍生衣壳的AAV载体，以及包含治疗有效量的此类AAV载体以及可药用的佐剂、赋形剂、载子或稳定剂的药物组合物。该载体和药物组合物可用于基因治疗或用作疫苗。
本公开还提供了包括突变型表位1氨基酸序列的AAV菌株的AAV衣壳，其中该突变型表位1氨基酸序列包括GGTAATE(SEQ ID NO:14)、TQEARPG(SEQ ID NO:20)、TPTPQFS(SEQID NO:22)、TLEPLIT(SEQ ID NO:24)、PFETDLM(SEQ ID NO:26)、LQEAHLT(SEQ ID NO:28)、EEGGRPK(SEQ ID NO:29)、EGDGGCL(SEQ ID NO:31)、DGGAGSW(SEQ ID NO:32)、AEGGGGG(SEQID NO:34)、AGGGEMG(SEQ ID NO:36)、GEAAAPA(SEQ ID NO:37)、SVEGGAW(SEQ ID NO:38)或SLASTLE(SEQ ID NO:40)。在某些实施方案中，AAV菌株为AAV2。在某些其它实施方案中，AAV菌株选自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。AAV菌株也可为另一种天然存在的AAV变体或衣壳工程化突变体。
本公开还提供了包括突变型表位2氨基酸序列的AAV菌株的AAV衣壳，其中该突变型表位2氨基酸序列包括PARQL(SEQ ID NO:15)、PRPVQ(SEQ ID NO:19)、PSALM(SEQ ID NO:21)、ADSLL(SEQ ID NO:23)、PASVM(SEQ ID NO:25)、PRPLM(SEQ ID NO:27)、AQPVM(SEQ IDNO:30)、SEKQL(SEQ ID NO:33)、APAMC(SEQ ID NO:35)、DRRLL(SEQ ID NO:39)或TLPMK(SEQID NO:41)。在某些实施方案中，AAV菌株为AAV2。在某些其它实施方案中，AAV菌株选自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。AAV菌株也可为另一种天然存在的AAV变体或衣壳工程化突变体。
本公开还提供了包括突变型表位3氨基酸序列的AAV菌株的AAV衣壳，其中该突变型表位3氨基酸序列包括SVDGN(SEQ ID NO:16)。在某些实施方案中，AAV菌株为AAV2。在某些其它实施方案中，AAV菌株选自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。AAV菌株也可为另一种天然存在的AAV变体或衣壳工程化突变体。
在某些实施方案中，如上所述的AAV衣壳可被构造成逃逸抗体结合或中和。
本公开还提供了包括以下项的AAV载体：上述AAV衣壳中的任一种；包含治疗有效量的这些AAV载体中的一种或多种载体以及可药用的佐剂、赋形剂、载子或稳定剂的药物组合物；对此类AAV衣壳蛋白进行编码的核酸序列；以及包括此类核酸序列的基因构建体，诸如质粒和病毒基因组。本文所述的AAV载体可用于将基因引入哺乳动物细胞中，例如用于基因治疗。药物组合物可用于基因治疗、用作疫苗或用于其它治疗目的。
IP序列(免疫沉淀后进行AAV条形码序列)过程已通过蛋白A/G磁珠进行优化。此过程在2015年4月24日提交的PCT国际专利申请号PCT/US2015/027536中有所描述。AAV2衣壳中由小鼠单克隆抗体针对完整AAV2颗粒(A20)识别出的表位已通过IP序列来作图。AAV2衣壳中的表位已作图，该表位通过小鼠多克隆抗体而鉴定出来，小鼠多克隆抗体在通过静脉注射AAV2载体而免疫的小鼠体内生成。基于新的IP序列数据，已开发出用于产生抗AAV中和抗体逃逸AAV衣壳突变体的策略。
PK序列(通过AAV条形码序列的药动学曲线建立)是AAV衣壳中和抗体表位可通过对每个AAV-HP突变体或AAV-DP突变体进行基于AAV条形码序列的药动学曲线建立而进行鉴定的过程。此过程在2015年4月24日提交的PCT国际专利申请号PCT/US2015/027536中有所描述。简而言之，将由一组AAV-HP衣壳突变体或AAV-DP衣壳突变体和参考对照AAV组成的经DNA/RNA条形编码的AAV库(例如，打包了HP扫描突变体或DP扫描突变体的经DNA/RNA条形编码的dsAAV-U6-VBCLib库)与人或动物血清一起在试管中于37℃下温育一小时。然后将AAV库和每种血清样本的混合物静脉注射到小鼠体内，并且在注射后1分钟、10分钟、30分钟、1小时和4小时的时间点收集血样。从每个样本中提取出AAV病毒基因组DNA，并且对其进行AAV条形码序列分析(Adachi K等人，Nat Commun(《自然·通讯》)，第5期，第3075页，2014年)，以确定AAV库中包含的每个AAV菌株的血液清除率。
当AAV-HP或DP突变体与含有抗AAV中和抗体的人或动物血清一起进行预温育时，其HP或DP氨基酸序列包含抗AAV衣壳中和抗体表位的AAV-HP或DP突变体表现出更快的血液清除率。
最近已建立起AAV条形码序列(Adachi K等人，Nat Commun(《自然·通讯》)，第5期，第3075页，2014年)，这是基于NGS的方法，其允许以高通量方式对数百种不同AAV菌株(即，天然存在的血清型和实验室工程化突变体)的表型进行表征，同时显著缩短时间并减少工作量，并且仅使用少量个体(即，组织培养物和实验动物)。通过此方法，可对包括但不限于血液清除率、转导效率、组织嗜性和对抗AAV NtAb的反应性的生物学方面进行评估。图1A至图1E示意性地示出了AAV条形码序列方法。此方法的原理如下。将包括许多不同AAV菌株的库原液施用于某些类型的样本(例如细胞)时，如果AAV菌株中的每个在给定上下文中具有完全相同的生物学属性，则理论上，AAV种群的组成在初始输入库与从样本中回收的库之间不发生变化。然而，如果一些菌株显示出与其它菌株相比不同的生物学属性(例如更快的血液清除率或更有效的细胞内化)，则输入库(即，库原液)与输出库(即，从样本中回收的库)之间的种群组成将存在变化。基本方法由输入库与输出库之间的生物信息学比较组成，使用的原理与RNA序列(Wang Z等人，Nat Rev Genet(《自然综述·遗传学》)，第10期，第57-63页，2009年)中采用的原理类似。此方法可允许将不同AAV菌株之间的表型差异作为菌株种群统计的函数进行量化。通过为每个AAV菌株打上唯一的短DNA条形码标记并对所得种群应用ILLUMINA条形码测序，此类分析变得可能(Smith AM等人，Genome Res(《基因组研究》)第19期，第1836-1842页，2009年)。
已设计出通用的条形码序列体系来表达RNA条形码，被称为AAV DNA/RNA条形码序列(Adachi K等人，Mol Ther(《分子治疗》)，第22期，2014年)。在此体系中，产生了AAV库，其中每个病毒颗粒包含缺乏rep和cap基因但转录成对于其自身衣壳而言唯一的RNA条形码的DNA基因组。此RNA条形码体系AAV DNA/RNA条形码序列已用于抗AAV NtAb表位作图。
在此体系中，可产生打包了HP扫描突变体的经DNA/RNA条形编码的dsAAV-U6-VBCLib库。此类HP突变体可为用于抗AAVx NtAb表位作图的AAV2R585E-HP扫描突变体(x＝除AAV2之外的不与抗AAV2 NtAb交叉反应的任何菌株)以及用于抗AAV2 NtAb表位作图的AAV9-HP扫描突变体。AAV2R585E-HP突变体的结构在图1C中示出。AAV9-HP突变体是其中AAV9 HP被衍生自AAV2衣壳的那些替换的突变体。
代替六肽(HP)，十二肽(DP)也可以相同方式用于抗AAVx NtAb表位作图。许多AAV9-DP突变体已成功产生，如图6和图9所示。
代替AAV9作为启动平台血清型，AAV5也可以相同方式用于抗AAVx NtAb表位作图。许多AAV5-DP突变体已成功产生，如图7所示。与其它常见血清型相比，抗AAV5抗体在人类群体中的盛行率较低，这使得AAV5成为用于抗体表位作图的HP和DP扫描的引人注目的平台。
基于IP序列的方法不需要动物，并且能够通过多路复用ILLUMINA测序同时对多个样本进行抗体表位作图。基于IP序列的抗AAV抗体表位作图的过程可如下所述，并且在图4中进行了简要说明。首先，可将25μl血清样本(含有抗AAV NtAbs)和20μl PROTEIN A/GPLUS-AGAROSE(SANTA CRUZ sc-2003)在旋转装置上，于4℃下，在1.5ml管中的总体积为100μl的PBS中温育1小时。用PBS冲洗后，可将经DNA/RNA条形编码的dsAAV-U6-VBCLib库和包披有免疫球蛋白的琼脂糖珠在总体积为100μl的PBS中混合，然后可在旋转装置上于4℃下温育过夜。第二天，可遵循标准IP过程，可收集上清液和免疫沉淀物，并且在对样本进行蛋白酶K处理之后可使用WAKO DNA提取试剂盒(诸如购自富士胶片和光纯药株式会社(FUJIFILMWako Pure Chemical Corp.)的DNA
后续过程可类似于用于AAV条形码序列的过程，如以下文献所述：Adachi K等人Nat Commun(《自然·通讯》)，第5期，第3075页，2014年。简而言之，左侧病毒克隆特定条形码和右侧病毒克隆特定条形码(图1A至图1E中的lt-VBC和rt-VBC)可通过从IP上清液和沉淀物中回收的病毒基因组DNA进行PCR扩增。PCR引物可按样本专用DNA条形码进行索引编码。可随后将所有PCR扩增子混合到池中，并且可对该池进行ILLUMINA测序。可对ILLUMINA测序数据进行生物信息学分析，以检测每个样本中的AAV库的种群统计变化。该方法的原理是，与其它克隆体相比对样本免疫球蛋白具有更高亲和性的病毒克隆体可被检测为在上清液中减少或耗尽，同时通过ILLUMINA条形码测序富集在沉淀物中的克隆体。此类克隆体可能携带所研究的抗AAV抗体的表位，并且抗体靶向的表位可能是结合到特定AAV克隆体的衣壳中的异源肽，从而显示出种群统计变化。每根1.5ml管使用了1×10
此处使用IP序列过程。在此过程中，曾产生经DNA条形编码的AAV9-六肽(HP)扫描衣壳突变体库，除了野生型AAV9(阴性对照)以及野生型AAV2和AAV2R585E肝素结合缺陷突变体(阳性对照)之外，该库还包括总共153个AAV9-HP突变体。每个AAV9-HP突变体包含衍生自野生型AAV2衣壳的不同区域的6个连续氨基酸的置换，使得AAV2衣壳中的各个HP区域可以几乎天然的四级结构显示在异源AAV9衣壳上。AAV2衣壳的HP扫描以两个氨基酸间隔进行，从而形成153个重叠的HP。这些AAV9-HP突变体涵盖不同于AAV2衣壳的那些氨基酸的AAV2衣壳氨基酸中的大部分。AAV9-HP-584-00002和AAV9-HP-586-00002的产量很差。这两个突变体涵盖AAV2衣壳585-RGNR-588的肝素结合位点，因此，使用AAV9-HP突变体的方法不能确定肝素结合位点是否构成抗体表位。此限制可通过应用如下所述的AAV9-DP突变体方法来克服。
IP序列过程可包括以下步骤：(1)用商购获得的试剂或动物血清中存在的单克隆或多克隆抗体对AAV9-HP库(包含经DNA条形编码的基因组的AAV病毒颗粒)进行IP；(2)从免疫沉淀物中提取出经DNA条形编码的基因组；以及(3)对回收的病毒基因组进行ILLUMINA条形码测序，然后进行生物信息学分析。优化实验揭示，结合包披有A/G蛋白的磁珠并且用2％BSA进行封闭，这是降低非特定结合率且不对库克隆体的结合造成限制的最佳条件。在IP序列分析中，基于PD值来确定是否每个突变体结合到测试样本。当在AAV衣壳突变体库中包括的所有AAV菌株中，特定AAV-HP或AAV-DP突变体的PD被鉴定为极端异常值时，此类异常突变体被认为是结合了抗AAV衣壳抗体的AAV-HP或AAV-DP突变体。极端异常值被定义为以下中的任一项：(1)显示PD值高于所有PD值的第三个四分位数(Q3)中的四分位距(IQR)的两倍的那些，所有PD值从相同物种获得的抗AAV衣壳抗体阴性血清样本中获得(即，>Q3+2IQR)；(2)>Q3+3IRQ；(3)>M(平均值)+2SD(标准偏差)以及(4)>M+3SD。在针对异常值的四项标准中，Q3+3IQR是最严格的截止值，并且M+2SD是最不严格的截止值。虽然无论使用哪项标准，五个最常见表位中的四个表位均可容易地通过基于AAV9-HP的IP序列进行鉴定(图5)，但当使用Q3+3IQR时，可通过PK序列明确地鉴定的若干表位不能通过IP序列进行鉴定。例如，当使用Q3+3IQR截止值时，即使PK序列清楚地揭示Ep8是中和抗体表位，Ep8也不能通过IP序列鉴定为表位。当使用M+2SD截止值时，可容易地鉴定出Ep8。因此，我们为所有后续的IP序列实验选择了M+2SD截止值。
与基于Q3+3IQR截止值的鉴定相比，我们对M+2SD截止值的选择可能增大IP序列分析中的假阳性发现率(FDR)，即使我们的选择可增强鉴定表位的能力。为了有助于鉴定潜在的假阳性信号和假阴性信号，我们的IP序列分析始终伴随着两种另外的数据(所有IP序列数据中的区域B和C)(图5、图6和图7)，从而示出相对于野生型参考对照物(例如AAV9或AAV5)，每个突变体结合到包披有抗体的珠的能力。
在这两个另外的数据集中，使用下列项来测定结合能力：抗AAV抗体阴性人血清样本(图5、图6和图7中的区域B)和表位信号呈阳性的样本(图5、图6和图7中的区域C)。下列项最可能为真表位：抗体阴性样本中显示出相对结合效率约为1的表位(图5、图6和图7中的区域B)、以及抗体表位信号呈阳性的样本中结合效率远大于1的表位(图5、图6和图7中的区域C)。另一方面，假阳性可能包括在显示出相对结合效率接近1的表位中。因此，在Ep4的N末端区域上游鉴定出的阳性信号中的一些或许多阳性信号可能并不代表真表位，并且在使用不同AAV9突变库的两个单独IP序列实验中无法重现(图5和图6)。
使用AAV9-HP突变体库和IP序列过程，鉴定出包含在A20小鼠单克隆抗体的已知表位中的对抗完整AAV2颗粒的氨基酸，这证实了该方法的原理验证。随后，使用相同的方法，在AAV2免疫小鼠的血清中鉴定出多克隆抗AAV2衣壳抗体的表位。鉴定出的表位包括：261-SSQSGA-266(SEQ ID NO:3)(与A20的表位相同)和451-PSGTTT-456(SEQ ID NO:4)，这些表位被多个血清样本共有。
人血清的初始ELISA筛选已显示，许多对于抗AAV2抗体呈阳性的人血清样本对于抗AAV9抗体也呈阳性。这可能导致在一些情况下难以将IP序列过程直接应用于人样本，因为抗AAV2抗体表位的有效作图通常仅在样本不结合AAV9时才可以进行。为了解决此问题，已开发了以下的抗AAV9抗体中和技术并通过ELISA进行了确认：在对血清进行IP序列之前，将人血清与过量的AAV9颗粒一起进行温育(图12)。因此，可筛选人血清，以找到用于进行IP序列和多克隆人抗体表位鉴定的合适血清样本。IP序列过程可为用于对构象抗AAV衣壳抗体表位进行作图以及抗AAV中和抗体逃逸突变体的未来开发的有效方法。
为了测定足以中和具有抗AAV2衣壳抗体和抗AAV9衣壳抗体两者的20μl人血清样本中的抗AAV9衣壳抗体活性的AAV9病毒颗粒的量，使用与以下不同量的AAV9载体颗粒在37℃下预温育一小时的人血清样本或IVIG，进行抗AAV2衣壳抗体ELISA和抗AAV9衣壳ELISA：0vg、1×10
相同的预温育方法已建立并成功地用于使用AAV5-DP库的IP序列。
除AAV9-HP突变体库之外，AAV9-HP+DP库也已产生并用于表位作图。DP扫描方法使得可以产生具有AAV2衣壳衍生的585-RGNR-588肝素结合基序的AAV9突变体；即，AAV9-DP-582-00002(H584L/S586R/A587G/Q588N/A589R/Q592A)、AAV9-DP-584-00002(H584L/S586R/A587G/Q588N/A589R/Q592A/G594A/W595D)和AAV9-DP-586-00002(S586R/A587G/Q588N/A589R/Q592A/G594A/W595D/Q597N)。用于此研究的AAV9-HP+DP库包含33个AAV9-HP突变体和19个AAV9-DP突变体。AAV9-DP-578-00002和AAV9-DP-580-00002的产量很差，因此没有从这两种突变体收集数据。
除AAV9-HP和AAV9-DP突变体库之外，我们还构建了用于图7的AAV5-DP库。我们构建了总共68个AAV5-DP突变体衣壳(表4)。在这些突变体中，18个突变体不产生或仅产生很低的滴度，因此排除于AAV5-DP库之中。
已(使用IP序列)鉴定出AAV2衣壳蛋白中的短氨基酸序列，这些序列可构成存在于人血清中的抗AAV2衣壳多克隆抗体的构象表位。病毒中和抗体NtAb表位作图可在开发用于预防和治疗感染性疾病的新疫苗和药物方面发挥作用。表位作图也可在可从宿主免疫系统逃逸的新型基因递送载体的开发方面发挥作用。与许多个体共有的抗AAV2衣壳多克隆抗体表位的鉴定可助于设计出逃避宿主免疫应答(这是有效体内基因治疗的障碍)的新型载体。
使用常规方法诸如肽扫描进行的先前研究仅产生有限量的关于人抗AAV衣壳表位的信息。然而，使用IP序列时，鉴定出许多已感染AAV2的个体共有的五个人抗AAV2衣壳多克隆抗体构象表位(Ep1、Ep2、Ep3、Ep4和Ep5)。除这些常见表位之外，还鉴定出Ep6、Ep7、Ep8、Ep9和Ep10。Ep6、Ep7、Ep8、Ep9和Ep10不如Ep1、Ep2、Ep3、Ep4和Ep5常见，但在采用M+2SD截止值的IP序列或者PK序列中的测定中的至少一者中，可以发现在对于抗AAV2衣壳抗体呈阳性的34个个体中的至少5个个体中存在Ep6、Ep7、Ep8、Ep9和Ep10(参见图5、图6、图7、图8和图9)。在IP序列和PK序列表位热图中，在Ep1、Ep6和Ep10内存在间隙(图5和图8)；然而，我们认为它们是单个表位，因为包含旁侧表位(flanking epitope)的扫描肽在间隙上重叠。请注意，我们将与鉴定出的表位的N端侧相邻的另外5个氨基酸以及与鉴定出的表位C端侧相邻的另外5个氨基酸作为表位的一部分。我们发现，携带DP“
明确地说，显示为Ep1、Ep2、Ep3、Ep4、Ep5、Ep6、Ep7、Ep8、Ep9和Ep10的氨基酸序列是对于形成抗体结合表位至关重要但不一定足以构成抗体结合位点的氨基酸残基。更明确地说，当通过氨基酸添加、缺失或置换进行改变时，Ep1、Ep2、Ep3、Ep4、Ep5、Ep6、Ep7、Ep8、Ep9和Ep10中的氨基酸序列将潜在地导致病毒衣壳丧失结合抗AAV衣壳抗体的能力。
如上所述，鉴定出以下五个表位：Ep1、Ep2、Ep3、Ep4和Ep5。这些是与曾感染AAV2的许多个体共有的常见人抗AAV衣壳多克隆抗体构象表位。这些表位的氨基酸序列如下：
Ep1：439-DQYLY
Ep2：650-NTPVP
Ep3：700-YTSNY
Ep4：243-STRTW
Ep5：320-VKEVT
请注意，带下划线以粗体字母所指示的氨基酸序列是通过IP序列和PK序列中的任一者或两者鉴定出的表位，并且添加到表位的N端和C端中的每一端的另外5个氨基酸是可能包含如上所述表位的氨基酸。
在包含抗AAV2衣壳抗体的34个人血清样本的至少五个样本中发现的其它人抗AAV衣壳多克隆抗体构象表位包括：
Ep6：498-SEYSW
Ep7：523-MASHK
Ep8：534-FPQSG
Ep9：570-PVATE
Ep10：409-FTFSY
虽然在研究中较不常发现Ep9(其序列已通过AAV9-HP-582-00002和AAV9-HP-588-00002确定)，但此研究所用的方法在确定Ep9作为表位的实际频率方面并没有结论。这是因为AAV9-HP-584-00002和AAV9-HP-586-00002突变体产量很差，因此不能提供关于表位的信息。
也就是说，此问题已通过使用AAV9-DP突变体得到部分解决(图6)。
这些氨基酸区域(Ep1、Ep2、Ep3、Ep4、Ep5、Ep6、Ep7、Ep8、Ep9和Ep10)是可通过人抗AAV2衣壳多克隆抗体识别的表位。通过使用其中这些区域中的氨基酸序列首先被随机化处理并随后借助于定向进化而被选择用于不再结合抗体的氨基酸序列的方法，可能产生可逃逸抗体中和的新型AAV2衍生衣壳。
为了显示用于产生新型抗体逃逸AAV2衍生突变体衣壳的上述定向进化方法的原理验证，在人胚肾(HEK)293细胞上进行使用AAV2Ep123衣壳库的定向进化实验(图10)。AAV2Ep123衣壳突变体库包含各种不同的突变体，这些突变体在AAV2衣壳的Ep1、Ep2或Ep3表位区中的7-mer、5-mer和5-mer肽序列是随机的。
AAV2Ep123衣壳突变体库如下构建。AAV2Ep1衣壳突变体库、AAV2Ep2衣壳突变体库和AAV2Ep3衣壳突变体库独立地在HEK293细胞中产生。从所产生的病毒颗粒中提取的病毒基因组DNA的Ep1、Ep2和Ep3编码区首先单独进行PCR扩增，并且通过金门组装随机地连接。所得的重组DNA用于在HEK293细胞中产生AAV2Ep123衣壳突变体库(图10)。
首先将AAV2Ep123衣壳突变体库与包含针对各种AAV血清型(包括AAV2)的中和抗体的IVIG一起温育。然后在腺病毒5型的存在下，将经IVIG处理的AAV2Ep123衣壳突变体库施用于HEK293细胞。HEK293细胞中扩增的AAV突变型病毒颗粒回收自HEK293细胞并且用于对其进行下一轮选择。总共进行四轮选择，以获得对抗抗AAV衣壳抗体中和的AAV2Ep123突变体。
此定向进化实验鉴定出至少16个AAV2Ep123突变体，其中AAV2Ep123mt1是最富集的(表4)。此突变体是在Ep3表位位置上携带非天然氨基酸序列的唯一突变体。所有其它突变体(AAV2Ep1mt2至AAV2Ep1mt16)都在Ep3表位区中具有野生型序列，这表明Ep3区对氨基酸变化的耐受不如Ep1或Ep2区。AAV2Ep123mt1对于Ep1携带GGTAATE(SEQ ID NO:14)，对于Ep2携带PARQL(SEQ ID NO:15)，并且对于Ep3携带SVDGN(SEQ ID NO:16)。
通过两组独立的体外细胞培养实验，评估AAV2Ep123mt从抗体介导的中和中逃逸的能力。将1×10
除上述定向进化方法之外，此信息可用于其它类型的AAV衣壳工程化。IP序列和PK序列方法可应用于其它AAV血清型或突变体以鉴定人抗AAV衣壳多克隆抗体构象表位。
如上所述，使用条形编码的六肽(HP)或十二肽(DP)扫描库，以高通量方式进行的病毒中和抗体(NtAb)表位作图的原理验证在AAV的背景下成立。使用Clustal Omega软件进行的AAV1、2、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的VP蛋白的测序对齐揭示出衍生自非AAV2血清型的AAV衣壳的潜在抗AAV衣壳抗体表位(图13)。此信息可用于开发衍生自对NtAb更具抗性的各种血清型和衣壳突变体的新型AAV衣壳。
以下实施例例示了本发明所公开的方法。根据本公开，本领域技术人员将认识到，无需过多实验，这些实施例以及本发明所公开的方法的其它实施例的变型将是可能。
从俄勒冈健康与科学大学(Oregon Health&Science University，OHSU)血液实验室收集553个人血清样本，并通过ELISA筛选抗AAV2衣壳抗体。对最多34个通过ELISA显示出高抗体滴度的人血清样本进行IP序列，并且测定抗AAV2衣壳多克隆抗体构象表位。
产生经DNA/RNA条形编码的dsAAV-U6-VBCLib库，该库打包了AAV9-HP扫描突变体(参见表1)。被称为dsAAV9-HP-U6-VBCLib的此库包含153个AAV9-HP突变体(每个突变体2个克隆)、AAV2(2个克隆)以及两个参考对照AAV2R585E和AAV9(每个15个克隆)。将PIERCE
产生另一个经DNA/RNA条形编码的dsAAV-U6-VBCLib库，该库打包了AAV9-HP和AAV9-DP扫描突变体(参见表2)。被称为dsAAV9-HP+DP-U6-VBCLib的此库包含33个AAV9-HP突变体(每个突变体2个克隆)、19个AAV9-DP突变体(每个突变体2个克隆)、AAV2(5个克隆)以及一个参考对照AAV9(15个克隆)。使用该库的IP序列分析以与上述相同的方式进行。
上述基于dsAAV9-HP-U6-VBCLib和dsAAV9-HP+DP-U6-VBCLib库的IP序列方法可鉴定抗AAV2衣壳抗体表位。然而，不可能确定结合了通过IP序列鉴定的表位的抗体是否具有中和AAV感染的能力。为了解决此限制，开发了使用dsAAV9-HP-U6-VBCLib或dsAAV9-HP+DP-U6-VBCLib库的体内PK序列方法。此体内方法的概念已描述于2015年4月24日提交的PCT国际专利申请号PCT/US2015/027536中。将50μl含抗AAV衣壳抗体的样本(3个抗AAV2衣壳抗体阳性人血清样本和10mg/ml IVIG)或抗体阴性对照样本(3个抗AAV2抗体阴性人血清样本和PBS)与20μl的1×10
将也具有抗AAV9抗体的抗AAV2衣壳抗体阳性人血清样本通过与AAV9病毒颗粒一起预温育而预清除，以从样本中去除抗AAV9多克隆抗体(图12)。在图5所示的IP序列分析中，使用四种不同的标准来定义为阳性(即，与结合到珠的AAV9-HP突变体或AAV9-DP突变体)。在图5的顶部区域和第二顶部区域中，将以下值视为阳性并且分别以黑框示出：显示超过从抗体阴性样本获得的上四分位数且大于四分位距(IQR)两倍和三倍(>Q3+2IQR和>Q3+3IQR)的值(即，结合到珠的AAV9-HP突变体或AAV9-DP突变体)。在图5的底部区域和第二底部区域中，将以下值视为阳性并且分别以黑框示出：显示超过从抗体阴性样本获得的平均值且大于标准偏差两倍和三倍(>M+2SD和>M+3SD)的值。发现了与许多样本共有的五个常见表位(Ep1、Ep2、Ep3、Ep4和Ep5)，并且还发现了五个较不常见但与至少5个样本共有的表位(Ep6、Ep7、Ep8、Ep9和Ep10)。图5中的前六行指示了通过抗AAV2衣壳抗体ELISA评估的没有抗AAV2抗体的人血清。已发现，在缺乏抗AAV2衣壳抗体的情况下，两种AAV9-HP突变体(514-00002和516-00002)和野生型AAV2可非特异性地结合到IP珠，从而形成来自抗AAV2衣壳抗体阴性人血清样本的高背景信号(图5B)。应当考虑到，高背景可能削弱检测真阳性的能力。每个AAV菌株(AAV9-HP突变体和AAV2阳性对照)相对于AAV9菌株的结合效率提供了可用于解释IP序列数据的信息，尽管这些数据不提供明确结论(图5C)。即，高值(即，显著高于1.0)有力地指示了真表位，但具有低值(即，接近1.0)的阳性不一定排除它们是真表位的可能性。
可通过使用AAV9-HP突变体的IP序列来鉴定的常见表位也通过使用AAV9-DP突变体的IP序列来鉴定。我们发现，使用AAV9-DP的IP序列具有优于使用AAV9-HP突变体的IP序列的若干优点。首先，包含AAV2衣壳的肝素结合位点585-RGNR-588的4个AAV9衣壳突变体中的3个可以对下游IP序列过程足够的含量产生。即，在包含585-RGNR-588的AAV9-DP580-00002、AAV9-DP582-00002、AAV9-DP584-00002和AAV9-DP586-00002中，仅AAV9-DP580-00002的产量很差。第二，使用AAV9-DP突变体的IP序列具有更好的鉴定真表位的能力。例如，在将Ep8鉴定为表位时，经证实，灵敏度较高。PK序列将Ep8鉴定为人样本ID402和ID481的明确的中和抗体表位(图8和图9)。使用AAV9-DP的IP序列也表明Ep8是这些样本的表位(图6)，而使用AAV9-HP突变体的IP序列未能将Ep8鉴定为表位(图5)。
可通过使用AAV9-HP或AAV9-DP突变体的IP序列来鉴定的常见表位也通过使用AAV5-DP突变体的IP序列来鉴定(图7)。我们发现，AAV5-DP突变体方法是AAV9-HP和AAV9-DP突变体方法的补充，因为AAV5-DP方法可鉴定出AAV9-HP和AAV9-DP方法未能鉴定的表位。例如，利用抗AAV2抗体阳性人血清样本，通过IP序列，将AAV5-DP-235-00002、AAV5-DP-237-00002、AAV5-DP-239-00002、AAV5-DP-241-00002、AAV5-DP-243-00002、AAV5-DP-245-00002和AAV5-DP-247-00002(图14A)沉淀为异常值，这导致鉴定出ALPTYNNHLYKQISSQSGA是包括Ep4的氨基酸。然而，通过使用AAV9-HP突变体的IP序列，不能将ALPTYNNHLYK序列(Ep4的左半部)鉴定为Ep4的一部分(图14B)。
通过生成一组旨在鉴定抗AAV2中和抗体逃逸AAV2突变体的AAV2Ep123mt突变体的过程举例说明，可利用表位信息来开发衍生自可逃逸预先存在的免疫力的任何AAV菌株(常见血清型、各种天然变体和衣壳工程化突变体)的新型突变体。该过程的示例如下：(1)随机化或合理地修饰每个常见中和表位中的氨基酸；(2)在存在或不存在合适的抗AAV中和抗体的情况下，使用合适的方法，对包含氨基酸序列改变的单个表位或者两个或更多个氨基酸序列改变的表位的组合的AAV衣壳突变体进行定向进化或筛选；(3)在存在或不存在适当的抗AAV中和抗体的情况下，使用适当的方法，对包含通过过程(2)选择的序列改变的表位的组合的AAV衣壳突变体进行进一步定向进化或筛选；以及(4)使用适当的方法，评估每个所选AAV衣壳突变体从抗AAV抗体介导的中和中逃逸并转导动物的培养细胞或靶器官中的靶细胞的能力。
表1：六肽扫描AAV9衍生的突变体
本公开中引用的所有参考文献均全文以引用方式并入。
对于本领域技术人员将显而易见的是，可在不偏离本发明的基本原理的情况下对上述实施方案的细节作出许多改变。因此，本发明的范围应该仅由以下权利要求书确定。
序列表
<110> 俄勒冈健康与科学大学（Oregon Health & Science University）
<120> 人抗AAV2衣壳多克隆抗体表位
<130> 2319
<160> 65
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 腺相关病毒1
<400> 1
Gln Ser Gly Ser Ala Gln
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 腺相关病毒9
<400> 2
Gly Ser Gly Gln Asn
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 3
Ser Ser Gln Ser Gly Ala
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Pro Ser Gly Thr Thr Thr
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
1 5 10
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ala Ala Lys Phe Ala
1 5
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Gln Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly
1 5 10
<210> 9
<211> 29
<212> PRT
<213> 腺相关病毒2
<400> 9
Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys
1 5 10 15
Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
20 25
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 腺相关病毒2
<400> 10
Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn
1 5 10 15
Leu Thr
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala
1 5
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Val Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile
1 5 10 15
Glu
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV2Ep123mt1
<400> 14
Gly Gly Thr Ala Ala Thr Glu
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV2Ep123mt1
<400> 15
Pro Ala Arg Gln Leu
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<213> 人工序列
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<400> 16
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<400> 17
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<220>
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<220>
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Asp Arg Arg Leu Leu
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<220>
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Ser Leu Ala Ser Thr Leu Glu
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<220>
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Thr Leu Pro Met Lys
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<213> 腺相关病毒9
<400> 43
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<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> AAV9突变体
<400> 45
Leu Gly Ala Ala His Glu Gly Cys
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV9突变体
<400> 46
Leu Gly Ser Ala Ala Ala Gly Cys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV9突变体
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Leu Thr Ala Ala Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV9突变体
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<213> 腺相关病毒2
<400> 49
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<400> 50
Arg Thr Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr
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<400> 51
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 腺相关病毒2
<400> 52
Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 735
<212> PRT
<213> 腺相关病毒2
<400> 53
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145 150 155 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
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Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
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Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
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Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
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Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485 490 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500 505 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515 520 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530 535 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
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Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565 570 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580 585 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595 600 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
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Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625 630 635 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645 650 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660 665 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675 680 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690 695 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705 710 715 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 54
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相关病毒1
<400> 54
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260 265 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275 280 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290 295 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305 310 315 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325 330 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340 345 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355 360 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370 375 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405 410 415
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420 425 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435 440 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565 570 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580 585 590
Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610 615 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625 630 635 640
Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645 650 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660 665 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
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Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
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Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
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<210> 55
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相关病毒3B
<400> 55
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
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Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50 55 60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260 265 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275 280 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290 295 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305 310 315 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325 330 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340 345 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355 360 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370 375 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385 390 395 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405 410 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420 425 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435 440 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450 455 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
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Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
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Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
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595 600 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
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Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
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Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
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675 680 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690 695 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705 710 715 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725 730 735
<210> 56
<211> 734
<212> PRT
<213> 腺相关病毒4
<400> 56
Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu
1 5 10 15
Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys
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Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
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Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val
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Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
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Ala Glu Phe Gln Gln Arg Leu Gln Gly Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100 105 110
Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu
115 120 125
Gly Leu Val Glu Gln Ala Gly Glu Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro
130 135 140
Leu Ile Glu Ser Pro Gln Gln Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys
145 150 155 160
Lys Gly Lys Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Val Phe Glu Asp Glu Thr
165 170 175
Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Thr Ser Gly Ala Met Ser
180 185 190
Asp Asp Ser Glu Met Arg Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Val Glu Gly
195 200 205
Gly Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys
210 215 220
Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly His Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr
225 230 235 240
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- 人抗AAV2衣壳多克隆抗体表位
- 人hcrcn81的原核重组质粒及其所表达的蛋白与兔抗人多克隆抗体及用途