一种龙眼开花调控基因DlWRKY25及其调控蛋白与应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种龙眼开花调控基因及其应用。

背景技术

龙眼(Dimocarpus longana Lour.)是我国热区重要的经济果树之一，在我国具有2000多年的栽培历史。龙眼的栽培品种花芽分化具有季节性，并且需要低温诱导，在我国主产区，如广东的粤西地区和海南等，由于不具备龙眼成花所需的低温，常常需要用KClO

作为高等植物中一类重要的转录调控因子，该基因家族因含有高度保守的WRKY结构域而得名，其结构域分别是N-端核心序列WRKYGQK与C-端的锌指结构。根据其结构域的数目及锌指结构序列的特点，WRKY蛋白通常被划分为3个主要类型。目前研究表明，WRKY基因家族大部分成员参与植物的生长发育以及不同的逆境胁迫响应过程。因其能特异结合位于下游基因启动子区的顺式作用元件，从而对植物的生长发育、胁迫应答和激素信号转导产生影响。WRKY基因的研究主要集中在其对各种逆境胁迫的响应，与成花相关的研究较少。成花时间的遗传调控和成花相关基因的鉴定和阐明，对缩短童期及提高果树产量等都有重要意义。尽管目前已有研究表明WRKY在植物开花中起一定作用，比如，FvWRKY71能够促进开花和增加分枝。在长光照下，过表达WRKY25导致拟南芥提前开花。MdWRKY35可能通过响应不同的逆境胁迫进而参与不同的成花过程。但WRKY具体如何影响成花过程，目前尚不完全清楚。

发明内容

本发明目的在于提供一种龙眼开花调控基因及其表达的蛋白与应用。

本发明目的按如下技术方案实现：

一种龙眼开花调控基因DlWRKY25，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种龙眼开花调控蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了含有前述编码基因的载体。

本发明还提供了含有前述载体的工程菌。

本发明进一步提供了前述基因在促进植株开花方面的应用。

进一步地，所述应用为将所述工程菌侵染植株，获得促进开花的转基因植株。

本发明具有如下有益效果：

本发明对DlWRKY25基因进行克隆、亚细胞定位分析、转基因功能分析，同时通过qRT-PCR对DlWRKY25基因在不同器官、花器官发育过程的表达规律进行研究，解析了DlWRKY25基因的功能；明确其在龙眼成花过程中的作用，为利用分子辅助加快早晚熟龙眼新品种的培育奠定基础。

本发明龙眼DlWRKY25基因的开放阅读框(open reading frame，ORF)全长为1038bp，编码345个氨基酸，具有典型的WRKY结构域和锌指结构，属于III型WRKY蛋白。qRT-PCR结果表明，该基因具有组织表达特异性，在茎中相对表达量较高、果皮和幼果器官中次之。

烟草表皮细胞瞬时表达结果显示，荧光信号主要集中在细胞核，DlWRKY25编码的蛋白定位于细胞核。

转基因拟南芥结果表明，作为典型的转录因子，龙眼DlWRKY25正调控植物成花；过表达DlWRKY25基因的拟南芥植株相对于野生型都能表现出不同程度的早花表型，野生型植株26天左右开花，而转基因株系在16-18天开花。

DlWRKY25在‘四季蜜’龙眼成花诱导早期呈下调表达，T1时期仅为T2时期的5倍，而在′石硖′龙眼成花诱导过程中DlWRKY52的表达水平未出现显著性差异表达。

本发明为深入探究龙眼DlWRKY25基因在其生长发育过程中的分子生物学功能研究奠定了良好的基础。

附图说明

图1为龙眼DlWRKY25基因PCR扩增图。

图2为不同物种(阿月浑子，Pistacia vera，XP_031278909.1；橡胶，Heveabrasiliensis，XP_021670644.1)间WRKY蛋白序列比对图。左侧框部分表示WRKYGQK氨基酸序列，右侧框部分表示C2H2锌指结构基序。

图3为龙眼DlWRKY25与GenBank中相似序列的进化树分析图。

图4为DlWRKY25在龙眼不同组织中的相对表达量示意图。不同字母靶标表示差异达到显著水平。

图5为DlWRKY25在2种龙眼品种成花诱导过程中的表达模式图。不同字母靶标表示差异达到显著水平。T1代表休眠期，T2代表花分生组织出现时期(“红点”)，T3代表花器官形成时期。

图6为DlWRKY25蛋白在烟草中的亚细胞定位图。GFP：绿色荧光蛋白；Chloroplast：叶绿体自发荧光；Bright：明场；Merged：2种荧光与明场融合；标尺为10μm。

图7为DlWRKY25转基因拟南芥成花表型图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1目的基因的克隆

1材料和方法

1.1植物材料来源

中国热带农业科学院南亚热带作物研究所龙眼种质圃中3组长势和树龄(9年龄)一致的具有不断成花习性的′四季蜜′龙眼和正常成花主栽品种′石硖′龙眼。

1.2取样目的与部位

成花诱导表达分析取样部位：三个成花诱导时期的顶芽，分别为T1休眠期(顶芽未萌动，水分含量很少，硬度高)；T2″红点″时期(顶芽开始萌动发育成花序，芽轴伸长，基部的腋芽明显膨大，变为红色，俗称″红点″)；T3第1花序时期，(顶芽完全发育成花序，未开花)。

组织表达分析取样部位：取′四季蜜′龙眼的花、花芽、叶、果皮、果肉、根、种子、茎和幼果(花后60d整果)等器官。

所有的试验设3次重复，取样后立即放入液氮速冻并转入-80℃冰箱中保存、备用。

1.3 DlWRKY25基因序列的克隆及生物信息分析

从龙眼基因组数据库(NCBI Sequence Read Archive，SRA315202)中获得DlWRKY25基因(Dlo_011410.1)的碱基序列和氨基酸序列信息。利用Primer Premier 5.0根据DlWRKY25基因的ORF序列设计引物W25-S和W25-A(表1)，委托天一辉远生物科技有限公司(广州)合成。用北京华越洋生物公司的植物RNA提取试剂盒提取‘四季蜜’龙眼叶片的RNA，采用Takara公司的PrimeScript RT-PCR试剂盒，具体操作步骤参照说明书，反转录cDNA作为模板，进行PCR扩增克隆DlWRKY25基因。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环(变性-延伸)；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物进行切胶回收和纯化连接到pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，挑取阳性单克隆送天一辉远生物科技有限公司(广州)进行测序。

利用在线软件SMART程序(http：//smart.emblheidelberg.de/)预测蛋白结构域，利用ExPASy(http：//expasy.org/tools/)分析蛋白的等电点和分子量。根据克隆所得的cDNA序列，利用BLASTp对氨基酸序列进行同源性对比，同时利用MEGA 5软件进行氨基酸序列同源性分析及系统发育分析，构建Neighbor-Joining进化树，1000次重复，其它均为默认设置。

1.4表达分析

根据克隆所得的DlWRKY25基因序列设计qRT-PCR引物qW25-S和qW25-A(表1)，并在NCBI里利用BLASTn检验以确保引物的特异性。以龙眼的Actin基因(Dlo_028674)为内参基因，具体引物序列见表1。

表1所用引物信息

qRT-PCR反应所用仪器为Roche的LightCycler 480，PCR反应酶为Takara公司的SYBR Green Master Mix。反应体系为20mL，其中模板cDNA 40ng，上、下游引物各250nM，SYBR Green Master Mix 10μL，其余用ddH

实施例2亚细胞定位分析

根据克隆所得的DlWRKY25基因序列设计引物(去除终止子)(表1)，扩增DlWRKY25的ORF全长，PCR反应程序如上。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测、纯化后连接pMD18-T载体上，转化DH5α。挑取单菌落，经PCR检测后提质粒测序。然后将测序正确的目的基因与表达载体pBWA(V)HS-osgfp进行连接。将酶连后的质粒转入大肠杆菌DH5α，阳性检测后挑选正确的菌株测序，然后提取得到pBWA(V)HS-DlWRKY25-osgfp质粒。接着利用电转化法将构建成功的质粒转入农杆菌LB4404，28℃培养2d后，刮去农杆菌菌块接种于YEB培养基中，170r/min 1h，4000r/min离心4min，去上清收集菌液，并用10nmol/L MgCl

实施例3过表达载体构建及转基因拟南芥功能验证

使用特异PCR引物OEW25-S/OEW25-A(表1)，以龙眼cDNA为模板，进行PCR扩增。该引物5′端分别加有BamH I酶切位点，反引物5′端分别加有Sac I酶切位点。获得的PCR产物与pMD19-T载体连接并进行测序。最后，提取测序正确的质粒，用BamHI和Sac I分别双酶切pBI121和测序正确的质粒，通过T4 DNA连接酶构建含有DlWRKY25目标基因的植物表达载体，并命名为pBI121-DlWRKY25。通过液氮冻融法将所构建的过量表达载体pBI121-DlWRKY25转入农杆菌菌株GV3101，参照文献(Clough，Steven J，Bent，et al.Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.[J].Plant Journal，1998(16)，735-743.)，通过农杆菌花絮侵染法将DlWRKY25基因转入野生型拟南芥，获得T0代种子。在含30ug/ml的MS固体培养基上筛选阳性拟南芥，同时用pBI121质粒特异引物检测阳性转基因拟南芥幼苗。将T3代转基因植株分别和野生型在相同环境中培养，并比较它们的开花表型。

实施例4结果与分析

1、DlWRKY25基因的克隆及生物信息学分析

以龙眼cDNA为模板，用W25-S/W25-A(表1)引物扩增出1000bp左右的片段(图1)。测序结果显示。该片段与龙眼(′红核子′)基因组数据库中的目的序列(Dlo_001658.1)完全一致，大小为1038bp，编码345个氨基酸，其分子量为38.65kDa，理论等电点为5.93。根据龙眼WRKY家族基因组的定位信息，命名为DlWRKY25。氨基酸序列分析表明，DlWRKY25含有1个WRKY结构域及C

利用BLASTp对D1WRKY25的氨基酸序列进行同源性检索，然后利用MEGA 6.0软件构建系统进化树(图3)。结果表明，与单子叶植物的WRKY亲缘关系较远，比如玉米(Zea mays)的ZmWRKY70(ACG28802.1)。

2、DlWRKY25基因组织表达特性分析

qRT-PCR结果表明DlWRKY25基因在被检测的9种龙眼组织中都有表达，其中在茎中表达最高，在果皮和幼果次之(图4)。

3、DlWRKY25基因在花器官发育过程中的表达模式

利用qRT-PCR技术，我们分析了DlWRKY25在′四季蜜′和′石硖′龙眼3个成花阶段的表达。结果表明，DlWRKY25在‘四季蜜’龙眼成花诱导早期呈下调表达，T1时期仅为T2时期的1/5。而在′石硖′龙眼成花诱导过程中DlWRKY25的表达水平未出现显著性差异表达(图5)。

4、DIWRKY25基因的亚细胞定位分析

为检测DlWRKY25蛋白在细胞中的定位，本发明构建了含有增强型绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白表达载体(35S：D1WRKY25-GFP)，转化烟草进行顺势表达，并用激光共聚焦显微镜进行观察。如图6所示，在480nm波长的激化下，35S：D1WRKY25-GFP只在细胞核里观察到荧光信号，细胞质和细胞膜中均无GFP信号，而35S：GFP对照组则在整个细胞中都能观察到GFP信号，没有明确的定位。该结果表明，DlWRKY25蛋白定位于细胞核上。

5、转DIWRKY25基因的拟南芥表型分析

结果显示，过表达DlWRKY25基因的拟南芥植株相对于野生型都能表现出不同程度的早花表型，野生型植株26天左右开花，而转基因株系在16-18天开花(图7)，说明DlWRKY25基因过量表达会显著促进植物开花。

序列表

<110> 重庆文理学院

<120> 一种龙眼开花调控基因DlWRKY25及其调控蛋白与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggttactc tcatgttgtc tgaaaacagt agtaacagtc atccagttgc tgttaacagg 60

aagaaagtga ttgaagagct ggttcaaggg aggagattcg cggagaagct ccggatcctg 120

cttcagaggc cctttggtgg agctgggtcg tcggaggtgg cggaggagga gctggtggtg 180

aagatcttga ggtcttttac taagagtttg tctgtgctgt gtggtggtgg tggtgagact 240

atatcgtctg ccggggaggt gcagggggtt tgttacgatg attcgatggt ttccggtggc 300

cggagattgg aggattacgg tgagagtaag aagaggctgc tgggtcctaa ggggaggaga 360

ggttgttaca agagaaagaa gaattcagag acatggagga cagagactgc caccattgaa 420

gatggtcatg catggaggaa atatgggcaa aaggatatcc tcaatactac acatccaagg 480

agctacttca ggtgcacaca caagtatgat caaggttgca aagccacaaa acaggtgcaa 540

aaaattgaaa acaatccaca aatgtttgag accatctaca taggcaacca cacttgcagg 600

aaccaagtca catacccagc atcgcaaatg atcgtcacag gcaataatgg accctggact 660

agcagtacta ctagtgcctc tgcacttagc tcatccagca ctccatcaac agtagtagtt 720

aaacaggaat acaatttcaa agaagaaaca ccaagtactg gtgatgattt gtcagaaaac 780

ttgtcatcat ctcatcatta ccatcatgat gatcatgatc atgagcagct ggagtattct 840

gctatgtggg aggatttggc ccctttggaa acggatgtgg ttgtttctag tgtttattca 900

tgtaatgata tcggtgatca tcatcagaat catcatcata ttatcgccac cactaccacc 960

accacatctc atggtttgaa cactgatttt gacacagagc tttgttttga tgagactgat 1020

atttttctct ctagctag 1038

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Thr Leu Met Leu Ser Glu Asn Ser Ser Asn Ser His Pro Val

1 5 10 15

Ala Val Asn Arg Lys Lys Val Ile Glu Glu Leu Val Gln Gly Arg Arg

20 25 30

Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Leu Leu Gln Arg Pro Phe Gly Gly Asp

35 40 45

Gly Ser Ser Glu Val Ala Glu Glu Glu Leu Val Val Lys Ile Leu Arg

50 55 60

Ser Phe Thr Lys Ser Leu Ser Val Leu Cys Gly Gly Gly Gly Glu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Ala Gly Glu Val Gln Gly Val Cys Tyr Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Val Ser Gly Gly Arg Arg Leu Glu Asp Tyr Gly Glu Ser Lys Lys Arg

100 105 110

Leu Ser Gly Pro Lys Gly Arg Arg Gly Cys Tyr Lys Arg Lys Lys Asn

115 120 125

Ser Glu Thr Trp Arg Thr Glu Thr Ala Thr Ile Glu Asp Gly His Ala

130 135 140

Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Asp Ile Leu Asn Thr Thr His Pro Arg

145 150 155 160

Ser Tyr Phe Arg Cys Thr His Lys Tyr Asp Gln Gly Cys Lys Ala Thr

165 170 175

Lys Gln Val Gln Lys Ile Glu Asn Asn Pro Gln Met Tyr Glu Thr Ile

180 185 190

Tyr Ile Gly Asn His Thr Cys Arg Asn Gln Val Thr Tyr Pro Val Pro

195 200 205

Gln Met Ile Val Thr Gly Asn Asn Gly Pro Trp Thr Ser Ser Thr Thr

210 215 220

Ser Ala Ser Ala Leu Ser Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr Val Val Val

225 230 235 240

Lys Gln Glu Tyr Asn Phe Lys Glu Glu Thr Pro Ser Thr Gly Asp Asp

245 250 255

Leu Ser Glu Asn Leu Ser Ser Ser His His Tyr His His Asp Asp His

260 265 270

Asp His Glu Gln Leu Glu Tyr Ser Ala Met Trp Glu Asp Leu Val Pro

275 280 285

Leu Glu Thr Asp Val Val Val Ser Ser Val Tyr Ser Cys Arg Asp Ile

290 295 300

Gly Asp His His Gln Asn His His His Ile Ile Ala Thr Thr Ser Thr

305 310 315 320

Thr Thr Ser His Gly Leu Asn Thr Asp Phe Asp Thr Glu Leu Cys Phe

325 330 335

Asp Glu Thr Asp Ile Phe Leu Ser Ser

340 345

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatcccg atggttactc tcatgttgtc 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgagctcgct agctagagag aaaaatat 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggagctggtg gtgaagatct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taatcctcca atctccggcc 20

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagtggtctc acaacatggt tactctcatg ttgtc 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagtggtctc atacagctag agagaaaaat atcag 35

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attgttgagc agcttgtccg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaacacaac tttggcgagt 20