扩增间充质基质细胞的方法

本申请要求于2018年10月5日提交的美国临时专利申请号62/741,933的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

背景

1.技术领域

本发明总体上涉及医学和免疫学的领域。更具体地，本发明涉及间充质基质细胞的扩增及其用途。

2.相关现有技术的描述

在过去十年中，骨髓来源的间充质基质细胞(BM-MSC)已经在各种各样的临床场景中治疗性使用，包括移植物抗宿主病、缺血性/非缺血性心血管疾病、缺血性卒中和作为基因递送运载体。利用BM-MSC的局限性包括随着供体年龄增加细胞的数目和分化潜能下降，BM-MSC产品的质量不一致和必要的BM抽吸操作的侵入性。在正常婴儿出生后，脐带血组织(CBt)一般被丢弃，因此起始物料的收集是非侵入性的。CBt-MSC可以比BM-MSC更快地扩增至更高的数目，并且具有相似的免疫抑制特性。因此，存在着开发符合GMP的程序以生成大量用于临床用途的CBt-MSC的未被满足的需求。

发明内容

在第一个实施方案中，本公开提供了扩增CBt来源的MSC的方法，包括：从脐带组织获得MSC群体；在选自由TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-17组成的组的至少三种细胞因子的存在下预激活所述MSC；和扩增所述预激活的MSC从而获得扩增的MSC群体。在具体的方面，所述方法是符合GMP的。在一些方面，来自脐带组织的所述MSC群体事先进行冷冻保存或来源于新鲜的脐带组织或事先已经进行冷冻保存的脐带组织。

在一些方面，所述获得包括利用酶混合物处理所述脐带组织。所述酶混合物可以包含透明质酸酶和胶原酶。在某些方面，所述胶原酶是胶原酶NB4/6。在其他方面，所述酶混合物进一步包含脱氧核糖核酸酶(即，DNA酶)。透明质酸酶的浓度可以为0.5-1.5U/mL，诸如0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5U/mL。在一些方面，胶原酶的浓度可以为0.1-1U/mL,诸如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1U/mL。在某些方面，脱氧核糖核酸酶的浓度为200-300U/mL,诸如200、225、250、275或300U/mL。

MSC可以在预激活前培养至至少85％汇合,诸如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％汇合。在一些方面，在预激活前将MSC培养6-8天，诸如6、7或8天。在某些方面，在预激活前获得至少5亿个,诸如6亿个、7亿个、8亿个、9亿个或10亿个MSC。预激活可以持续12-24小时，诸如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。

在某些方面，MSC在TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-17的存在下预激活。在一些方面，TNFα、IFNγ和/或IL-1β的浓度为5-15ng/mL,诸如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15ng/mL或更大。在某些方面，IL-17以20-40ng/mL,诸如20、25、30、35、40ng/mL或更大的浓度存在。

在一些方面，所述扩增在功能性封闭系统，诸如生物反应器中进行。例如，生物反应器是中空纤维生物反应器。在某些方面，扩增进行少于7天，诸如6、5或4天。MSC可以扩增至少50倍,诸如至少55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍或更大。在一些方面，所述MSC的倍增时间小于28小时，诸如27、26、25或24小时。在一些方面，所述方法进一步包括冷冻保存扩增的MSC。

在某些方面，所述扩增的MSC群体与骨髓MSC相比具有较高的免疫抑制表型。在一些方面，所述扩增的MSC群体与没有利用细胞因子预激活扩增的CBt来源的MSC相比具有较高的免疫抑制表型。在具体的方面，所述免疫抑制表型通过抗凋亡因子诸如VGEF和/或TGFβ、抗炎因子诸如TSG-6、免疫调节因子和/或趋化-归巢因子(chemoattraction-homingfactor)诸如CXCR4和CXCR3的表达测量。在一些方面，所述免疫调节因子选自由PD-L1、IDO、PGE2、IL-10和TGFβ组成的组。在特定的方面，所述扩增的MSC群体与BM-MSC相比具有增加的干细胞性标志物和/或趋化因子受体表达。示例性的干细胞性标志物包括巢蛋白、Stro-1、Oct-4、Nanog和Cox-2，且趋化因子受体包括VEGF、HLA-G、PGE、CXCR4、IL-10和TGFβ。在一些方面，扩增的MSC群体具有与几种免疫调节通路相关的基因的诱导表达，所述免疫调节通路诸如T细胞耗竭、粒细胞粘附和血细胞渗出、抗原呈递通路、免疫应答的负调节、Notch信号传导的正调节、淋巴细胞凋亡过程的正调节、无粒细胞粘附和血细胞渗出、对缺氧的细胞反应的调节、TGFβ信号传导、NFKβ信号传导、IL-6信号传导、iNos和eNos信号传导1、STAT4和PI3K信号传导的正调节，和对T细胞凋亡的诱导。在某些方面，所述扩增的MSC群体的与血细胞渗出和归巢相关的基因(包括归巢受体)以及与粘附和侵袭相关的关键粘附分子的表达增加。示例性的粘附和侵袭标志物包括GLG1、VCAM1、CXCR4、ICAM1、CSF3、CXCL3、CXCL8、SELPG、STAT1、IFITT3、ISG15、STAT2、MX1、OAS1、IFI6、JAK2、TAP1、IFI35、IFITM1、PSM89、IRF1、IFITM3、PTPN2、RELA、IFNAR2、HSP90AA1、JUN、ARNT、HIF1和CUL2。

本公开进一步提供了一种用于离解脐带组织的组合物，包含胶原酶、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶。在一些方面，所述组合物离解脐带组织用于分离MSC。在某些方面，所述组合物由胶原酶、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶组成。在具体的方面，所述组合物不包含或基本上没有BSA或胰蛋白酶抑制剂。例如，胶原酶是胶原酶NB4/6。透明质酸酶的浓度可以为0.5-1.5U/mL，诸如0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5U/mL。在一些方面，胶原酶的浓度为0.1-1U/mL，诸如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1U/mL。在某些方面，脱氧核糖核酸酶的浓度为200-300U/mL，诸如200、225、250、275或300U/mL。在一些方面，CBt来源的MSC事先已经进行了冷冻保存。

进一步的实施方案提供了药物组合物，所述药物组合物包含通过所述实施方案的方法制备的扩增的MSC和药学上可接受的载体。本文进一步提供了一种包含通过所述实施方案的方法制备的扩增的MSC的组合物，所述组合物用于治疗炎性疾病。在一些方面，所述炎性疾病是移植物抗宿主病(GVHD)、自身免疫病、急性缺血性卒中、心肌损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或炎性肠病。在具体的方面，所述MSC是同种异体的。所述MSC可以全身或局部施用。

在另一实施方案中，提供了治疗受试者中的炎性疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的所述CBt来源的MSC，诸如根据本发明的实施方案制备的CBt-MSC。在具体的方面，所述受试者是人。在一些方面，所述CBt来源的MSC事先已经进行了冷冻保存。

在一些方面，所述炎性疾病是GVHD、自身免疫病、急性缺血性卒中、心肌损伤、ARDS或炎性肠病。在具体的方面，所述MSC是同种异体的。所述MSC可以全身或局部施用。例如，所述MSC经直肠、鼻、含服、阴道、皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内途径施用，或经植入贮器施用。在另外的方面，所述MSC联合至少一种另外的治疗剂施用。在一些方面，所述至少一种另外的治疗剂是治疗有效量的免疫调节剂或免疫抑制剂。在具体的方面，所述免疫抑制剂是钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗体、化疗剂照射、趋化因子、白介素或趋化因子或白介素的抑制剂。

进一步的实施方案提供了治疗有效量的CBt来源的MSC，诸如根据本发明的实施方案制备的CBtMSC治疗炎性疾病的应用。在一些方面，所述CBt来源的MSC事先已经进行了冷冻保存。在一些方面，所述炎性疾病是GVHD、自身免疫病、急性缺血性卒中、心肌损伤、ARDS或炎性肠病。在具体的方面，所述MSC是同种异体的。所述MSC可以全身或局部施用。例如，所述MSC经直肠、鼻、含服、阴道、皮下、皮内、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内途径施用，或经植入贮器施用。在另外的方面，所述MSC联合至少一种另外的治疗剂施用。在一些方面，所述至少一种另外的治疗剂是治疗有效量的免疫调节剂或免疫抑制剂。在具体的方面，所述免疫抑制剂是钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、抗体、化疗剂照射、趋化因子、白介素或趋化因子或白介素的抑制剂。

从下面的详述中本发明的其他目的、特征和优势将是很显然的。然而，应当理解，详述和具体实施例尽管表示本发明的优选实施方案，但仅借助于举例说明的方式给出，因为对于本领域技术人员来说，根据此详述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改都将是很显然的。

附图说明

下面的附图形成本说明书的一部分并且被包括用来进一步证明本公开的某些方面。可以通过参照这些附图中的一个或多个结合本文给出的具体实施方案的详述来更好地理解本公开内容。

图1：描绘从脐带组织分离和扩增MSC的符合GMP的规程的示意图。

图2：描绘使用生物反应器从脐带组织扩增和生成预激活的MSC的符合GMP的规程的示意图。

图3：在Terumo生物反应器中从骨髓与脐带组织相比大规模扩增MSC的数据。

图4：流式细胞术分析显示与来自骨髓的MSC相比，来自脐带组织的MSC表达更高水平的干细胞性标志物。

图5A-5B：预激活的CBt-MSC表现出比未处理的CBt-MSC更高的对T细胞增殖和激活的抑制效应。未处理的MSC与预激活的MSC相比由它们介导的对(图5A)CD4

图6A-6C：CBt-MSC的预激活增强了它们的免疫抑制治疗潜力。(图6A)预激活的CBt-MSC显示了比预激活的骨髓MSC更高的免疫抑制表型。(图6B)MSC的预激活增加了免疫调节分子TGS-6的分泌。(图6C)CBt-MSC的预激活诱导它们表面上的免疫调节分子的表达并使它们的治疗效应最大化。

图7：利用本发明的细胞因子混合物(TNF、IFN、IL1和IL-17)预激活CBt-MSC的疗效比常规制剂大。

图8A-8C：新鲜CBt来源的MSC增加了异种移植物抗宿主病(GVHD)小鼠模型中的生存期。(图8A)显示了接受了新鲜BM或CBT来源的MSC的小鼠与GVHD对照相比总生存期显著增加。(图8B)组织病理学样品证明了与GVHD对照相比经处理(BM-MSC或CBT-MSC)的小鼠的肝脏、脾脏和结肠的GVHD征象的轻微减少。(图8C)使用DiR-免疫荧光标记的MSC经尾静脉输注至小鼠中的短期生物分布实验。与BM-MSC相比，CBt-MSC显示在72小时的时程内显著的持久改善。

图9A-9B：CBt-MSC的激活揭示了具有较高免疫抑制特性的独特谱。(图9A)在静息和激活的MSC之间差异表达的基因的热图显示与静息CBt-MSC相比，在激活的CBt-MSC中有816种基因上调，383种基因下调。(图9B)对静息和激活的CBt-MSC评价的基因的创新路径分析(Ingenuity Pathway Analysis，IPA)揭示了细胞的激活诱导与几种免疫调节通路相关的基因的表达，所述通路诸如T细胞耗竭、免疫应答的负调节、IL-6信号传导和对T细胞凋亡的诱导。

图10A-10H：激活增强GVHD异种移植小鼠模型中的CBt-MSC归巢和生物分布。(图10A)在从激活的CBt-MSC与静息CBt-MSC提取的RNA上进行的IPA分析的热图揭示了在激活的CBt MSC上与血细胞渗出和归巢相关的几种基因(包括归巢受体)以及与粘附和侵袭相关的关键粘附分子的激活。(图10B)在激活的CBT MSC与静息MSC上归巢受体、粘附分子和侵袭蛋白(金属蛋白酶)的热图，它们通过流式细胞术评价。(图10C-10D)在72小时荧光分析后，观察到激活的CBT-MSC在小鼠中持续时间比对照CBt-MSC长，长达3天。(图10E)在注射后3小时、48小时和72小时收获小鼠组织，并按组织计算平均辐射效率。与对照MSC组相比，激活的CBt-MSC组显示较高的荧光水平的趋势，如(图10F)中的肺、(图10G)中的肝脏和(图10H)中的脾脏所示。

图11A-11C：冷冻保存的激活的CBt-MSC证明了与新鲜的激活的CBt-MSC相似的活力、表型和控制T细胞激活的效率。(图11A)使用膜联蛋白V和碘化丙啶测定通过流式细胞术确定的CBt-MSC的活力的代表性FACS图。(图11B)T细胞增殖CFSE测定的代表性直方图，证明了在所有不同的比率下对利用CD3/CD28珠子激活的T细胞的全部抑制。(图11C)利用新鲜或冷冻/解冻的细胞对激活的MSC表型的代表性FACS作图，显示了免疫抑制因子的表达的持久性。

图12A-12G：冷冻保存的激活的CBt-MSC增加了总体的生存期并减少了GVHD毒性。图12A-12C概述了多组小鼠的体内实验(每组n＝8只小鼠)。(图12A)未处理(GVHD对照)、未激活CBt-MSC的接受者和激活CBt-MSC的接受者的生存期曲线。数据证明了激活CBT-MSC的接受者与未激活MSC或对照相比的生存期收益。(图12B)体重百分比变化证明了激活CBt-MSC的接受者与其余两组相比有较少的体重减轻。(图12C)平均GVHD评分再次显示激活CBT-MSC组较少的GVHD。(图12D)在终点时间点时三组之间比较肝门炎症。(图12E)未处理(对照)、用静息CBt-MSC处理与激活(激活的)MSC处理的小鼠的血液学检验的比较。血液学检验包括WBC计数、MCV、MCHC、血细胞比容、血红素、血小板计数、RBC计数、MCH、RDW、白蛋白、碱性磷酸酶、钾、LDH、AST、葡萄糖、ALT、磷、总蛋白。结果显示在用激活MSC处理的组中与对照或未激活MSC组相比在血小板计数、葡萄糖、WBC计数和肝功能(ALT,AST)方面有改善。(图12F)在小鼠血液中细胞因子水平的结果，揭示了与对照小鼠相比，激活和未激活的CBt-MSC两者都减少炎性细胞因子的存在。(图12G)在第24天时小鼠血液中人CD45的百分比。左图面显示了来自每组的代表性FACS图，而右图面显示了带有与对照组(未处理)比较的统计学比较的条形图，其中**p-值<0.01,****p-值<0.0001，证明在两个MSC接受者组中人CD45

具体实施方式

骨髓来源的MSC很多年来已经被用来治疗难治性移植物抗宿主病(GVHD)并且近几年被用于再生医学的情形中，包括缺血性卒中、心血管疾病、炎性肠病和急性呼吸窘迫综合征。来自胎盘静脉的脐带血已经被广泛地评价，它是MSC的次优来源，与骨髓相比，其具有非常不一致且不足的MSC产生。因此，本公开的某些实施方案提供了对来源于脐带组织的MSC的扩增方法。本发明的方法提供了用于在生物反应器中产生大剂量的CBt来源的MSC的稳定的符合良好生产规范(GMP)的方法。

具体地，本发明的扩增MSC的方法可以包括预激活步骤，该步骤导致生成了比不采用预激活生成的MSC显著更有抑制性的CBt来源的MSC。预激活步骤可以包括在细胞因子的存在下培养MSC，所述细胞因子诸如TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-17。因此，本发明的方法使用新的符合GMP的系统可以在较短的时期内生成比BM来源的MSC更大剂量的CBt来源的MSC。CBt-MSC因此可以比BM来源的MSC更廉价和更有效地生成。

在本研究中，发现预激活和扩增的MSC比BM来源的MSC表达更多的“干细胞性”标志物。干细胞性标志物的表达增加可以允许预激活和扩增的MSC具有提供更特异性再生生命器官的能力，所述生命器官包括脑、心脏、胃肠道和肺。本发明的预激活的MSC还表达更高水平的免疫抑制因子和趋化因子受体，所述免疫抑制因子和趋化因子受体可以增强它们在GVHD中归巢到炎症部位(包括胃肠道和皮肤)以及在再生医学背景中归巢到正经受急性炎症的脑和心脏的能力，包括VEGF、HLA-G、PGE、CXCR4、IL-10和TGFβ。还发现通过本发明的方法制备的激活的MSC诱导与几种免疫调节通路相关的基因的表达，所述免疫调节通路诸如T细胞耗竭、粒细胞粘附和血细胞渗出、抗原呈递通路、免疫应答的负调节、Notch信号传导的正调节、淋巴细胞凋亡过程的正调节、无粒细胞粘附和血细胞渗出、对缺氧的细胞反应的调节、TGFβ信号传导、NFKβ信号传导、IL-6信号传导、iNos和eNos信号传导1、STAT4和PI3K信号传导的正调节、和对T细胞凋亡的诱导。激活的MSC还显示在激活的CBt MSC上与血细胞渗出和归巢相关的几种基因(包括归巢受体)以及与粘附和侵袭相关的关键粘附分子的激活，所述关键粘附分子诸如GLG1、VCAM1、CXCR4、ICAM1、CSF3、CXCL3、CXCL8、SELPG、STAT1、IFITT3、ISG15、STAT2、MX1、OAS1、IFI6、JAK2、TAP1、IFI35、IFITM1、PSM89、IRF1、IFITM3、PTPN2、RELA、IFNAR2、HSP90AA1、JUN、ARNT、HIF1和CUL2。

本发明的系统可以用来在符合GMP的功能性封闭系统中生成大量的临床级CBt来源的MSC，用于作为再生药物输注到患者中。因此，本文进一步提供了本文提供的高度免疫抑制性MSC的使用方法，诸如用于治疗炎性状态，诸如GVHD和自身免疫病，以及用于再生医学情形中，包括急性缺血性卒中、心肌损伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和炎性肠病。

I.定义

如本文所用，“基本上不含”，就所指定的组分而言，在本文中用来表示所指定的组分没有有意地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，组合物的任意非故意污染所产生的所指定的组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中利用标准分析方法检测不到指定组分的量的组合物。

如本文在说明书中所用，“一个”或“一种”可以意指一个或多个或者一种或多种。如本文在权利要求中所用，当结合词“包含”使用时，词“一个”或“一种”可以意指一个或多于一个或者一种或多于一种。

在权利要求中术语“或”的使用用来意指“和/或”，除非明确指示仅是可选方案或所述可选方案是互斥的，尽管本公开支持指仅是可选方案和“和/或”的定义。如本文所用“另一个”可以意指至少第二个或更多个。术语“约”是指所提及值加或减5％。

术语“间充质干细胞”、“间充质基质细胞”或“MSC”，如本文所用，是指来源于中胚层的专能成体干细胞，具有自我再生和分化能力以产生具有很大表型多样性的子代细胞，包括结缔组织、骨髓基质、脂肪细胞、真皮和肌肉等等。MSC通常具有一定的细胞标志物表达谱，该表达谱的特征在于它们是标志物CD19、CD45、CD14和HLA-DR阴性，标志物CD105、CD106、CD90和CD73阳性。MSC可以从任何类型的组织分离。通常，MSC将从骨髓、脂肪组织、脐带或外周血分离。在具体的实施方案中，MSC是骨髓来源的干细胞。

术语“功能性封闭”是指通过将整个系统不透气密封或通过在与收集系统的全部连接处提供无菌屏障滤器的被密封以确保流体无菌性的系统。

术语“生物反应器”是指在闭合无菌系统中向细胞提供营养素和移除代谢物，以及提供对细胞生长有利的物理-化学环境的大规模细胞培养系统。在具体的方面，在监测的和控制的环境和操作条件下发生生物学和/或生物化学过程，所述条件例如pH、温度、压力、营养素供应和废物移除。根据本公开，适合于本发明的方法使用的基本类型的生物反应器包括中空纤维生物反应器。

术语“中空纤维”意在包括包含限定尺寸、形状和密度的孔的(任意形状的)中空结构，用于向生物反应器内容纳的细胞递送营养素(处于溶液中)和移除来自生物反应器内容纳的细胞的废料(处于溶液中)。为了本公开的目的，中空纤维可以由可再吸收或不可再吸收的材料构造而成。纤维包括，但不限于，管状结构。

“免疫病症”、“免疫相关病症”或“免疫介导病症”是指其中免疫应答在疾病的发展或进展中起关键作用的病症。免疫介导病症包括自身免疫病、同种异体移植排斥、移植物抗宿主病以及炎性和变态反应病症。

“自身免疫病”是指其中免疫系统针对作为正常宿主的一部分的抗原(即，自身抗原)产生免疫应答(例如，B细胞或T细胞应答)、随后损害组织的疾病。自身抗原可以来源于宿主细胞，或可以来源于正常定植在粘膜表面的共生生物体诸如微生物(已知为共生生物体)。

术语“移植物抗宿主病(GVHD)”是指骨髓移植的常见和严重并发症，其中存在捐献的免疫活性淋巴细胞针对移植接受者自身组织的反应。GVHD是使用或含有来自相关或不相关供体的干细胞的任何移植物的可能并发症。在一些实施方案中，GVHD是慢性GVHD(cGVHD)，在一些实施方案中，GVHD是急性GVHD(aGVHD)。

“免疫应答的参数”是免疫应答的任何具体的可测量方面，包括，但不限于，细胞因子分泌(IL-6、IL-10、IFN-γ等)、趋化因子分泌、改变的迁移或细胞积累、免疫球蛋白产生、树突状细胞成熟、调节活性、调节性B细胞的数目和免疫系统的任何细胞的增殖。免疫应答的另一参数是免疫攻击引起的任何器官的结构性损害或功能性衰退。本领域技术人员可以使用已知的实验室测定容易地确定这些参数中的任一个的增加。在一个具体的非限制性实例中，为了评估细胞增殖，可以评估

“治疗”疾病或病况或疾病或病况的疗法是指执行方案，所述方案可以包括向患者施用一种或多种药物，以努力减轻疾病的征象或症状。治疗的期望效应包括减少疾病进展的速率，缓解或缓和疾病状态，以及缓解或改善的预后。减轻可以在疾病或病况的征象或症状出现之前发生，以及在它们出现后发生。因此，“治疗”或“疗法”可以包括“防止”或“预防”疾病或不期望的病况。另外，“治疗”或“疗法”不需要征象或症状的完全减轻，不需要治愈，并且特别地包括对患者仅具有轻微效应的方案。

术语“治疗益处”或“治疗上有效的”如本申请中各处所用，是指就该病况的医学治疗而言促进或增加受试者的健康的任何事务。这包括，但不限于，疾病的征象或症状的频次或严重性的减小。例如，癌症的治疗可以涉及，例如，肿瘤尺寸的减小，肿瘤侵袭性的减小，癌症生长速率的减小，或预防转移。癌症的治疗还可以指延长患有癌症的受试者的生存期。

“受试者”和“患者”是指人或非人，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在具体的实施方案中，受试者是人。

如本文中一般使用的那样，“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与组织、器官和/或人类和动物的体液接触而不会有过多的毒性、刺激、变态反应或其他问题或并发症的与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

“药学上可接受的盐类”意指本文公开的化合物的盐类，所述盐类是如上所定义的药学上可接受的，并且拥有期望的药理学活性。此类盐类包括与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或与有机酸形成的酸加成盐，所述有机酸诸如1,2-乙烷二磺酸，2-羟基乙磺酸，2-萘磺酸，3-苯丙酸，4,4′-亚甲基二(3-羟基-2-烯-1-甲酸)，4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸，乙酸，脂肪族单-和二羧酸，脂肪族硫酸，芳香族硫酸，苯磺酸，苯甲酸，樟脑磺酸，碳酸，肉桂酸，柠檬酸，环戊基丙酸，乙磺酸，富马酸，葡庚糖酸，葡萄糖酸，谷氨酸，乙醇酸，庚酸，己酸，羟基萘甲酸，乳酸，十二烷基硫酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，甲磺酸，己二烯二酸，o-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸，草酸，对氯苯磺酸，苯基取代的烷酸，丙酸，对甲苯磺酸，丙酮酸，水杨酸，硬脂酸，琥珀酸，酒石酸，叔丁基乙酸(tertiarybutylacetic acid)，三甲基乙酸，等等。药学上可接受的盐类还包括碱加成盐，当存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应则可以形成碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。应当认识到形成本发明的任何盐的一部分的具体阴离子或阳离子不重要，只要在整体上该盐是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐类的其他实例及其制备方法和使用参见Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use(P.H.Stahl&C.G.Wermuth编,Verlag Helvetica Chimica Acta,2002)。

“药学上可接受的载体”，“药物载体”，或简称“载体”是与活性成分药物一起配制的药学上可接受的物质，它们参与携带、递送和/或转运化学药剂。药物载体可以用来改善药物的递送和有效性，包括例如，控释技术来调节药物生物利用度，减少药物代谢，和/或减小药物毒性。一些药物载体可以增加药物递送至特定靶部位的有效性。载体的实例包括：脂质体，微球(例如，由聚(乳酸-共聚-乙醇酸)制成)，白蛋白微球，合成聚合物，纳米纤维，蛋白质-DNA复合物，蛋白质缀合物，红细胞，病毒颗粒和树枝状聚合物。

术语“培养”是指细胞在合适培养基中的体外维持、分化和/或繁殖。“富集”意指包含以比在它们存在于生物体中的组织中所发现的总细胞的百分比更高的百分比存在的细胞的组合物。

“分离的”生物组分(诸如一部分血液材料，诸如血液成分)是指已经基本上与所述组分天然存在的生物体的其他生物组分分离或从中纯化的组分。分离的细胞是已经基本上与所述细胞天然存在的生物体的其他生物组分分离或从中纯化的细胞。

如本文所用，术语“基本上”用来代表包含至少80％的期望组分、更优选90％的期望组分、或最优选95％的期望组分的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少80％、82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的期望组分。

II.间充质基质细胞

本公开涉及MSC的扩增。在培养中使用的MSC可以包括来源于任何干细胞来源的细胞，诸如脐带、脐带血、胎盘、胚胎干细胞、脂肪组织、骨髓或其他组织特异性间叶细胞。这些样品可以是新鲜的、冷冻的或冷藏的。在具体的方面，MSC来源于脐带组织和扩增这些CBt来源的MSC的方法。在具体的方面，MSC是人MSC，它可以是自体的或同种异体的。

A.从脐带组织分离MSC

在一个实施方案中，在一种或多种酶活性的存在下分离MSC。用于从组织分离细胞的大量消化酶在本领域中是已知的，包括那些被认为弱消化性(例如，脱氧核糖核酸酶和中性蛋白酶，分散酶)的酶到强消化性的酶(例如，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)。目前优选的是粘液溶解酶活性、金属蛋白酶、中性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶(诸如胰蛋白酶、糜蛋白酶或弹性蛋白酶)和脱氧核糖核酸酶。更优选的是选自下列的酶活性：金属蛋白酶、中性蛋白酶和粘液溶解活性。细胞可以在胶原酶、透明质酸酶和分散酶中的一种或多种活性的存在下分离。

脐带组织可以获自哺乳动物，诸如人。具体地，脐带组织获自择期剖宫产后的足月新生儿。脐带组织可以在勃脉力(plasmalyte)中运输，诸如含有青霉素/链霉素的勃脉力。脐带组织然后可以切成多个小部分并在30-40℃、特别是37℃孵育诸如30-90分钟，特别是70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80分钟。

脐带组织可以在本文提供的包含胶原酶、透明质酸酶和/或脱氧核糖核酸酶的酶混合物中被离解。具体地，胶原酶是胶原酶-NB4/6(Serva)。脐带组织然后可以在分离器诸如GentleMACS Octo分离器(Miltenyi)中被离解。然后细胞悬液被过滤、洗涤并重新悬浮在培养基中，诸如含有10％血小板裂解物、L-谷氨酰胺、肝素的含有青霉素-链霉素的α-MEM培养基(完全培养基)并接种到T175培养瓶中，然后培养直至MSC为约80％汇合。然后收获细胞并使用不含抗生素的完全培养基扩增至约80％汇合。培养可以持续约6-8天，特别是约7天。

用于MSC培养的细胞培养表面包括但不限于标准组织培养容器和二维表面，包括片、载玻片、培养皿、培养烧瓶、袋、培养瓶或多孔培养皿。

提供生长条件允许对细胞的培养基、补充剂、气氛条件和相对湿度有很大范围的选项。优选的温度为37℃；然而，温度可以为约35℃至39℃，取决于其他培养条件和细胞或培养物的期望用途。

专业技术人员将认识到生长培养基可以以本领域中已知的任一种方式进行各种各样地补充和改变，并且可以对特定的原因进行优化。另外，细胞能够在许多其他培养基中生长，包括不添加血清的化学成分确定的培养基。几种此类培养基在下面举例说明。除了细胞的常规培养和维持以外，许多其他培养基在本领域中已知用于影响此类潜能细胞分化成特定类型的细胞或特定细胞的祖细胞。专业技术人员将认识到这些培养基可用于许多目的，并且包括在本发明的范围内，但它们对于常规培养和扩增不一定是优选的。

除了细胞关于培养基的灵活性以外，所述细胞可以在各种各样的环境条件下生长。具体地，细胞可以在宽范围的气氛条件下生长。目前优选的是范围在约5％O

在培养前细胞的冷冻保存或本文公开的扩增细胞的冷冻保存可以根据已知的方法进行。例如，细胞可以以例如约1-2×10

在一些实施方案中，从任何干细胞来源刚分离的细胞可以被冷冻保存以构成细胞库，其一部分可以通过解冻被取出，然后根据需要用来产生本发明的扩增细胞。解冻可以快速进行，例如，通过将小瓶从液氮转移到37℃水浴。小瓶的解冻内容物可以在无菌条件下立即转移到包含适宜培养基诸如营养培养基的培养容器中。一旦在培养中，所述细胞可以每日检查一次，例如，利用倒置显微镜以检测细胞增殖，并且一旦达到适宜的密度就进行传代培养。

可以根据需要从细胞库取出细胞，并且将所述细胞用于在体外产生新的干细胞或组织，例如，作为三维支架培养，或在体内产生新的干细胞或组织，例如，通过将细胞直接施用到需要组织重建或修复的部位。如本文所述，本公开的扩增的MSC可以用来重建或修复受试者中的组织，其中所述细胞最初从该受试者的自身组织分离(即，自体细胞)。备选地，本文公开的扩增的MSC可以用作广泛的供体细胞以重建或修复任何受试者中的组织(即，异体细胞)。

B.MSC预激活

从脐带组织分离的MSC然后可以在细胞因子的存在培养进行预激活。细胞因子可以是TNFα、IFNγ、IL-1β和/或IL-17，并且特别是TNFα、IFNγ、IL-1β和IL-17。预激活步骤可以持续约12-24小时，诸如13、14、15、16、17、18或19小时，特别是16小时。TNFα、IFNγ和/或IL-1β的浓度可以为5-15ng/mL,诸如6、7、8、9、10、11、12、13或14ng/mL，特别是约10ng/mL。IL-17可以以20-40ng/mL,诸如25、30或35ng/mL,特别是约30ng/mL的浓度存在。

C.在生物反应器中的MSC扩增

MSC然后可以在功能性封闭系统诸如生物反应器中扩增。扩增可以在Quantum生物反应器(Terumo)中进行，诸如持续4-10天，特别是5-6天。

生物反应器可以根据一般类别分组，包括：静态生物反应器、搅拌瓶式生物反应器、旋转壁式容器生物反应器、中空纤维生物反应器和直接灌注式生物反应器。在生物反应器内，细胞可以是游离的，或固定的，接种在多孔三维支架(水凝胶)上。

中空纤维生物反应器可以用来增强培养期间的质量传递。中空纤维生物反应器是基于中空纤维的3D细胞培养系统，它是以平行阵列排列的小半透性毛细管膜，其典型的截留分子量(MWCO)范围为10-30kDa。这些中空纤维膜经常被捆扎并安装在管状聚碳酸酯壳内以形成中空纤维生物反应器筒。在还装有入口和出口端口的筒内，有两个室：中空纤维内的毛细管内(IC)空间，和围绕中空纤维的毛细管外(EC)空间。

因此，对于本公开，生物反应器可以是中空生物反应器。中空纤维生物反应器可以具有包埋在纤维腔内的细胞，培养基灌注腔外空间，或可选地，可以通过中空纤维提供气体和培养基灌注，细胞在腔外空间内生长。适合于本公开的中空生物反应器在本领域中是已知的，并且可以包括，但不限于，Caridian(Terumo)BCT Quantum细胞扩增系统。

中空纤维应当适合于递送营养素和移除生物反应器中的废物。中空纤维可以是任何形状，例如，它们可以是圆形的和管状的或为同心环的形式。中空纤维可以由可再吸收的或不可再吸收的膜制成。例如，中空纤维的合适组分包括聚二氧六环酮、聚丙交酯、羟乙酸乳酸聚酯(polyglactin)、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙醇酸/三亚甲基碳酸酯、纤维素、甲基纤维素、纤维素聚合物、纤维素酯、再生纤维素、泊洛沙姆、胶原、弹性蛋白以及它们的混合物。

生物反应器可以在接种细胞之前进行准备。所述准备可以包括用缓冲液诸如PBS冲洗。所述准备还可以包括用细胞外基质蛋白诸如纤连蛋白涂覆生物反应器。生物反应器然后可以用培养基诸如αMEM洗涤。

MSC可以以约100-1,000个细胞/cm

在生物反应器中接种的细胞的总数可以为约1.0x10

所述细胞可以接种在任何合适的细胞培养基中，许多细胞培养基是市售的。示例性的培养基包括DMEM、RPMI、MEM、培养基199、HAMS，等等。在一个实施方案中，所述培养基是αMEM培养基，特别是补充了L-谷氨酰胺的αMEM。所述培养基可以补充下列中的一种或多种：生长因子、细胞因子、激素或B27、抗体、维生素和/或小分子药物。特别地，所述培养基可以是无血清的。

在一些实施方案中，所述细胞可以在室温孵育。培养箱可以被湿化并且具有约5％CO

III.使用方法

本公开的扩增的MSC在治疗和减轻疾病和损伤方面具有广泛的应用。本公开的扩增的MSC可用于许多治疗应用中，包括修复、重建和再生组织以及基因递送。本公开的MSC可以包含谱系定向细胞和非谱系定向细胞两者；因此，两种细胞类型可以一起使用以实现多种治疗目标，在一些实施方案中甚至同时使用。例如，在一些实施方案中，本公开的扩增的MSC可以直接用作干细胞移植物或以悬液的形式或在细胞培养支持支架上用于干细胞移植物中，如上文所述。

本公开的某些实施方案涉及使用本文提供的MSC用于治疗或预防炎性疾病或免疫介导病症的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的MSC，由此治疗或预防所述受试者中的炎性疾病或免疫介导病症。

根据本发明的方法生成的MSC具有许多潜在的用途，包括实验性和治疗性用途。具体地，设想此类细胞群将非常有用的用于抑制不合乎需要的或不适宜的免疫应答。

在一个实施方案中，向患有自身免疫病或炎性疾病的受试者施用本文提供的MSC。在一个实施方案中，所述受试者患有自身免疫病。自身免疫病的非限制性实例包括：斑秃，强直性脊柱炎，抗磷脂综合征，自身免疫性艾迪生病，肾上腺的自身免疫病，自身免疫性溶血性贫血，自身免疫性肝炎，自身免疫性卵巢炎和睾丸炎，自身免疫性血小板减少症，白塞病，大疱性类疱疮，心肌病，乳糜泻-皮炎(celiac spate-dermatitis)，慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)，慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病，Churg-Strauss综合征，瘢痕性类天疱疮，CREST综合征，冷凝集素病，克罗恩病，盘状狼疮，原发性混合型冷球蛋白血症，纤维肌痛-纤维肌炎，肾小球肾炎，格雷夫斯病，格林巴利综合征(Guillain-Barre)，桥本甲状腺炎，特发性肺炎纤维化，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，IgA肾病，青少年关节炎，扁平苔藓，红斑狼疮，梅尼埃病，混合结缔组织病，多发性硬化，1型或免疫介导糖尿病，重症肌无力，肾病综合征(诸如微小病变肾病,局灶性肾小球硬化,或膜性肾病)，寻常型天疱疮，恶性贫血，结节性多动脉炎，多软骨炎，多腺性综合征，风湿性多肌痛，多肌炎和皮肌炎，原发性无丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，银屑病，银屑病关节炎，雷诺现象，Reiter综合征，类风湿性关节炎，结节病，硬皮病，干燥综合征，僵人综合征，系统性红斑狼疮，红斑狼疮，溃疡性结肠炎，葡萄膜炎，血管炎(诸如结节性多动脉炎，大动脉炎，颞动脉炎/巨细胞性动脉炎，或疱疹样皮炎血管炎)，白癜风和韦格纳肉芽肿。因此，可以使用本文公开的方法治疗的自身免疫病的一些实例包括，但不限于，多发性硬化症,类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，I型糖尿病，克罗恩病；溃疡性结肠炎，重症肌无力，肾小球肾炎，强直性脊柱炎，血管炎或银屑病。受试者还可以具有变态反应病，诸如哮喘。

在又另一个实施方案中，受试者是移植的器官或干细胞的接受者，并且扩增的MSC用来预防和/或治疗排斥。在具体的实施方案中，所述受试者具有移植物抗宿主病或处于发生移植物抗宿主病的危险。GVHD是任何使用或包含来自相关或不相关供体的干细胞的移植物的可能并发症。有两种类型的GVHD，即急性和慢性GVHD。急性GVHD在移植后前三个月内出现。急性GVHD的征象包括手脚上有发红的皮疹，其可以播散并变得更加严重，皮肤脱皮或起水泡。急性GVHD还可以累及胃肠，在这种情况下存在痉挛、恶心和腹泻。皮肤和眼睛发黄(黄疸)指示急性GVHD已经累及了肝脏。慢性GVHD基于其严重性分级：1期/级轻微；4期/级严重。慢性GVHD在移植后三个月或更晚发生。慢性GVHD的症状类似于急性GVHD,但另外，慢性GVHD还可以累及眼睛中的粘液腺、口中的唾液腺以及润滑胃粘膜和肠的腺体。移植的器官的实例包括实体器官移植物，诸如肾脏、肝脏、皮肤、胰腺、肺和/或心脏，或细胞移植物诸如胰岛、肝细胞、成肌细胞、骨髓或造血干细胞或其他干细胞。移植物可以是复合移植物，诸如面部的组织。MSC可以在移植之前、与移植同时，或在移植后施用。在一些实施方案中，MSC在移植之前施用，诸如移植前至少1小时，至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少1周，至少2周，至少3周，至少4周，或至少1个月。在一个具体的非限制性实例中，治疗有效量的MSC的施用在移植前3-5天进行。

在进一步的实施方案中，将治疗有效量的MSC施用于受试者治疗或抑制受试者中的炎症。因此，该方法包括向受试者施用治疗有效量的MSC以抑制炎性过程。炎性疾病的实例包括，但不限于，哮喘,脑炎,炎性肠病,慢性阻塞性肺病(COPD),变态反应性疾病，感染性休克，肺纤维化,未分化脊柱关节病,未分化关节病,关节炎,炎症性骨溶解和由慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。本文公开的方法还可以用来治疗变态反应性疾病。

无论何时期望免疫抑制炎症或抑制炎症都可以利用MSC的施用，例如，在疾病或炎症的第一征象或症状时。这些征象或症状可以是一般的，诸如疼痛、水肿、体温升高，或可以是与所累及的器官的功能障碍相关的特定征象或症状。例如，在肾移植排斥中，可以存在血清肌酐水平升高，而在GVHD中，可以存在有红疹，在哮喘中，可以存在有呼吸短促和喘息。

还可以利用MSC的施用来预防目标受试者中的免疫介导疾病。例如，MSC可以在移植前施用于将是移植接受者的受试者。在另一个实例中，MSC施用于接受同种异体骨髓移植且没有T细胞耗竭的受试者。在进一步的实例中，MSC可以施用于具有糖尿病家族史的受试者。在其他实例中，MSC施用于患有哮喘的受试者以防止哮喘发作。在一些实施方案中，将治疗有效量的MSC在症状出现前施用于所述受试者。与接受不包括调节性细胞的其他疗法的患者相比，MSC的施用可以导致后续的免疫事件或症状(诸如哮喘发作)的发生率或严重性降低，或提高患者生存期。

可以通过本领域技术人员已知的许多方法测量治疗的有效性。在一个实施方案中，使用白细胞计数(WBC)来确定受试者的免疫系统的应答性。WBC测量受试者的白细胞数目。使用本领域中熟知的方法，将受试者的血样中的白细胞与其他血细胞分离并计数。白细胞的正常值为约4,500-约10,000个白细胞/μl。较低的白细胞数可以指示受试者中的免疫抑制状态。

在另一个实施方案中，受试者的免疫抑制可以使用T-淋巴细胞计数来确定。使用本领域中熟知的方法，将受试者的血样中的白细胞与其他血细胞分离。使用本领域中的标准方法区分T-淋巴细胞和其他白细胞，诸如，例如，免疫荧光或FACS。T细胞数减少或特定的T细胞群的数目减少可以用作免疫抑制的度量。与治疗前的T细胞数(或特定群体的细胞数)相比T细胞数或特定T细胞群的数目减少可以用来指示已经诱导了免疫抑制。

在其他实例中，为了评估炎症，可以测量炎症部位处的中性粒细胞浸润。为了评估中性粒细胞浸润，可以测量髓过氧化物酶活性。髓过氧化物酶是存在于多形核白细胞和单核细胞的嗜天青颗粒(azurophilic granule)中的血红素蛋白。它催化卤离子氧化成各自的次卤酸，次卤酸用于吞噬细胞杀死微生物。因此，组织中髓过氧化物酶活性的减少反映了中性粒细胞浸润减少，并且可以充当抑制炎症的度量。

在另一个实例中，可以通过测量受试者中的细胞因子水平来测定对受试者的有效治疗。体液或细胞样品中的细胞因子水平通过常规方法测定。例如，可以使用免疫斑点测定，诸如酶联免疫斑点或“ELISPOT”测定。免疫斑点测定是高度灵敏的定量测定，用于检测单细胞水平的细胞因子分泌。免疫斑点方法和应用在本领域中是熟知的，并且记述于例如，EP 957359。标准免疫斑点测定的变化形式在本领域中是熟知的，并且可以用来检测本公开的方法中细胞因子产生的改变(参见，例如，美国专利号5,939,281和美国专利号6,218,132)。

治疗有效量的MSC可以通过许多途径施用，包括肠胃外施用，例如，静脉内，腹膜内，肌内，胸骨内，心内或关节内注射，或输注。

用于诱导免疫抑制或治疗或抑制炎症的MSC的治疗有效量是在被治疗的受试者中实现期望效应的量。例如，它可以是抑制自身免疫病或同种异体免疫病的进展或导致其缓解，或能够减轻由自身免疫引起的症状病(诸如疼痛或炎症)所必需的MSC的量。其可以是减轻与炎症相关的症状(诸如疼痛、水肿和体温升高)所必需的量。其还可以是消除或预防移植器官的排斥所必需的量。

MSC可以以与疾病相符的治疗方案施用，例如，在1天至几天内单次或几次剂量以改善疾病状态或在延长的时间内的周期性剂量以抑制疾病进展和防止疾病复发。在制剂中待采用的准确剂量也将取决于施用途径，和疾病或病症的严重性，并且应当根据主治医生的判断和每个患者的情况来决定。MSC的治疗有效量将取决于被治疗的受试者，疾病的严重性和类型，以及施用方式。在一些实施方案中，在人受试者的治疗中可以使用的剂量范围为至少3.8×10

本公开的扩增的MSC在施用前可以放置在载体媒介物中。对于输注，本公开的扩增的MSC可以在生理学上可接受的媒介物中经血管内施用，包括静脉内施用，尽管它们也可以被引入到其他方便的部位，诸如到骨髓中，在此细胞可以找到用于再生和分化的适宜部位。通常，将施用至少约1×10

在一个实施方案中，本公开的扩增的MSC群体可以用来修复或重建受损或患病的间质组织，诸如心脏、胰腺、肝脏、脂肪组织、骨、软骨、内皮细胞、神经、星形胶质细胞、真皮等。一旦扩增的MSC迁移到或被放置在损伤部位，它们可以分化形成新的组织并且补充器官功能。在一些实施方案中，使用所述细胞来促进血管化，并且因此改善了氧合和废物从组织的移除。在这些实施方案中，本公开的扩增的MSC可以用来增加分化组织和器官的功能，诸如心衰中的缺血心脏或卒中中的缺血神经。

本公开的扩增的MSC还可以用于有需要的患者中的基因疗法。在一些实施方案中，更成熟的谱系定向细胞是有用的，特别是需要瞬时基因表达的时候或通过细胞的成熟和分裂促进基因转导的时候。例如，一些逆转录载体要求对于待整合的基因细胞要正处于细胞周期中。转导干细胞和祖细胞以递送新的治疗性基因的方法在本领域中是已知的。

施用的MSC还可以包含本文所述的细胞和另外的感兴趣细胞的混合物。另外的感兴趣细胞包括，不限于：分化的肝细胞、分化的心肌、分化的胰腺细胞，等等。

扩增的MSC可以与一种或多种其他的用于治疗免疫介导病症的治疗剂联合施用。联合疗法可以包括，但不限于：一种或多种抗微生物剂(例如，抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂)，抗肿瘤药(例如，氟尿嘧啶、氨甲喋呤、紫杉醇、氟达拉滨、依托泊苷、阿霉素或长春新碱)，免疫耗竭剂(例如，氟达拉滨、依托泊苷、阿霉素或长春新碱),免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤或糖皮质激素类,诸如地塞米松或强的松),抗炎药(例如，糖皮质激素类诸如氢化可的松、地塞米松或强的松，或非甾体抗炎药诸如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠),细胞因子(例如，白介素-10或转化生长因子-β),激素(例如，雌激素)，或疫苗。另外，可以施用免疫抑制剂或致耐受剂，包括但不限于：钙调磷酸酶抑制剂(例如环孢霉素和他克莫司)；mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)；霉酚酸酯,抗体(例如识别CD3、CD4、CD40、CD154、CD45、IVIG或B细胞)；化疗药(例如氨甲喋呤、苏消安、白消安)；辐射；或趋化因子，白介素或它们的抑制剂(例如BAFF、IL-2、抗-IL-2R、IL-4、JAK激酶抑制剂)。此类另外的药剂可以在施用调节性B细胞之前、期间或之后施用，取决于期望的效应。细胞和药剂的这种施用可以通过相同的途径或通过不同的途径、在相同的部位或在不同的部位处施用。

IV.试剂盒

在一些实施方案中，提供的试剂盒可以包括，例如，一种或多种用于制备MSC的培养基和组分。此类制剂可以包含因子的混合物，以适合于与MSC组合的形式存在。试剂系统可以包装在水性介质中或以冻干的形式包装，视情况而定。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，组分可以放置在其中，并且优选地所述组分适当地进行等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，所述试剂盒还通常包含第二、第三或其他另外的容器，另外的组分可以单独地放置在这些容器中。然而，在小瓶中可以包含各种组合的组分。试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，通过添加合适的溶剂可以将所述粉末复配。设想所述溶剂也可以在另一容器装置中提供。所述试剂盒还典型地包括用于商业销售的用于密闭地容纳试剂盒组分的装置。此类容器可以包括注塑模制成型或吹塑模制成型的塑料容器，所需的小瓶保留在所述注塑模制成型或吹塑模制成型的塑料容器中。所述试剂盒还可以包括使用说明书，诸如以打印格式或电子格式，诸如数字格式。

V.实施例

包括下列实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在实施本发明时运行良好的技术，因此可以被认为构成实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员应当理解，根据本公开，在不偏离本发明的精神和范围的前提下，在公开的具体实施方案中可以做出许多改变并仍然获得类似的或相似的结果。

实施例1–间充质基质细胞的扩增

Terumo Quantum细胞扩增系统(使用的生物反应器)是设计用于GMP相适应的细胞生产的自动化中空纤维细胞培养平台。简言之，从正常的婴儿分娩获得脐带组织，使用包含透明质酸酶的酶混合物(胶原酶NB6 0.5U/ml,透明质酸酶1U/ml和脱氧核糖核酸酶250U/ml)来消化组织。在消化后，将细胞接种在培养瓶中，培养几天。当细胞为～85％汇合时将它们用胰蛋白酶消化、重新接种并再次培养，当汇合时移除并冷冻作为第1代(P1)。(图1)。

然后解冻P1细胞并在Quantum生物反应器中扩增4-6天(直至达到汇合)。一旦基于生物反应器中的葡萄糖和乳酸盐水平鉴定到理想的汇合，用本发明的包括TNF、IFN-γ、IL-1β和IL-17的细胞因子组合预激活所述细胞16小时，洗涤，收获并在多个测定中评价或冷冻用于临床用途(图2)。

当将2000万个脐带组织来源的与骨髓来源的MSC加入到生物反应器时，在较短的时间内利用脐带组织生成的MSC的数目几乎为骨髓来源的MSC的两倍(图3)。CBt-MSC表达显著较大数目的“干细胞性”标志物巢蛋白、Stro-1、Oct-4、Nanog和Cox-2(图5)。重要的是，预激活的CBt-MSC比基线(未激活的)CBt-MSC或BM-MSC更有抑制性(图5)。它们表达较高水平的抗凋亡因子(VGEF、TGFβ)、抗炎/抗增殖因子(TSG-6)、免疫调节因子(PD-L1、IDO、PGE2、IL-10、TGFβ)和趋化-归巢因子(CXCR4、CXCR3)(图6)。因此，预激活的扩增的CBt-MSC以很大的临床相关剂量有效地生成并且具有比其他MSC制剂更大的治疗效应(图7)。

实施例2–材料和方法

在择期剖宫产后，从知情同意的足月新生儿的健康母亲获得CBt。CBt在含有青霉素/链霉素的勃脉力中运输。将CBt切成7个相等的部分并在37℃在含有包括胶原酶-NB4/6(Serva)和透明质酸酶(Sigma Aldrich)有或无脱氧核糖核酸酶(Genentech)的各种酶组合的C-管(Miltenyi)中在GentleMACS Octo分离器(Miltenyi)中孵育76分钟。将细胞悬液过滤、洗涤并重新悬浮在含有10％血小板裂解物、L-谷氨酰胺、肝素的含有青霉素-链霉素的α-MEM培养基(完全培养基)中并接种到T175培养瓶中，然后培养直至MSC为80％汇合为止。将细胞收获并在T175培养瓶中使用不含抗生素的完全培养基扩增至P1到80％汇合。

在收获P1后，通过流式细胞术分析MSC的典型MSC表面标志物的表达并将其冷冻保存。随后在Quantum生物反应器(Terumo)中扩增5-6天。通过CD4

72小时后，用BFA(10X)、PMA(100X)和离子霉素(10X)处理各孔。收获一半的孔，洗涤并用抗-CD4(Biolegend)或活-死细胞染料(ThermoFisher Scientific)染色。在Cytofix/Cytoperm固定和透化溶液(BD Biosciences)后，加入1X缓冲液，对细胞染色IL-2(BD)、TNF-α(BD)和干扰素γ(BD Bioscien ces)。第5天，收获剩余的细胞并利用抗-CD4-APC(Biolegend)和活-死细胞染料(ThermoFisher Scientific)染色。对所有样品使用Fortessa X20(BD Biosciences)进行流式细胞术，然后利用FlowJo软件分析。

在酶消化后，不含脱氧核糖核酸酶的样品从P0至P1生长很差(到第10天小于80％汇合)，因此剔除。NB4、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶成为标准的酶组合。在以51x 10E6个CBt-MSC(范围为45至62x10E6个细胞)的中位数接种生物反应器后，在生物反应器扩增5-6天产生了中位数为1495x 10E6个CBt-MSC(范围为1245至1935x 10E6)。CBt-MSC的中位倍增时间(MSC增殖且数目加倍所需的时间)为28.2小时(范围为24.5至29.7)(n＝3)。免疫抑制测定证明CBt MSC以剂量依赖方式抑制CD4

实施例3–间充质干细胞的表征

体内表征在实施例1中得到的MSC以确定它们的功能性。发现新鲜的CBt来源的MSC在异种移植物抗宿主病(GVHD)小鼠模型中增加生存期(图8)。

NSG(NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ)7周龄雄性小鼠购自JacksonLaboratory(Bar Harbor,ME,USA)并在实验前使其适应1周。小鼠(11周龄)接受亚致死量照射(300cGy)24小时，然后在实验的第0天移植2×10

在一些实验中，使用Xenolight DiR(Perkin Elmer,Rodgau,德国)标记BM或CBt-MSC，Xenolight DiR是一种在750nm激发的NIR亲脂性碳菁染料，其发射峰在782nm。将细胞重悬于PBS(1×10

下一步，发现CBt-MSC的激活揭示了具有较高免疫抑制特性的独特谱(图9)。使用补充了1％L-谷氨酰胺和5％人血小板裂解物的αMEM培养基培养CBt-MSC，直至85％汇合。然后，将培养基更换为激活培养基(αMEM培养基,补充了1％L-谷氨酰胺、IFNγ(10ng/ml)、TNFα(10ng/ml)、IL-1B(10ng/ml)和IL-17(10ng/ml))持续24-36小时。该时间后，收获细胞并根据生产厂商说明书(RNeasy Plus Mini Kit,Qiagen)提取和纯化RNA。每个培养条件分析12个样品。在RNA提取、cDNA预扩增和测序质控后，制备cDNA文库，并在Illumina HiSeq 2500系统上测序这些细胞的转录组。由MD Anderson生物信息部(MD Anderson Bioinformaticsdepartment)进行对RNAseq数据的分析。使用TOPHAT2v2.0.1346将测序读数与人参照基因组(hg38)比对。通过使用HTSEQ47,48基于hg38 GENCODE v25基因模型对作图的读数计数来测量基因表达水平。使用EdgeR package48鉴定差异表达的基因，FDR(错误发现率)截止值<0.01，差异倍数>2。通过使用Ingenuity Pathway

如图9A中所概述的那样，静息和激活MSC之间差异表达的基因的热图显示了与静息CBt-MSC相比在激活的CBt-MSC中，816种基因上调，383种基因下调。对静息和激活的UC-MSC评价的基因的创新路径分析(IPA)揭示了细胞的激活诱导了与几种免疫调节通路相关的基因的表达，所述通路诸如T细胞耗竭、免疫应答的负调节、IL-6信号传导和T细胞凋亡的诱导(图9B)。

还观察到激活增强在GVHD异种移植小鼠模型中的CBt-MSC归巢和生物分布(图10)。在热图上给出了在从激活与静息CBt-MSC提取的RNA上进行的IPA分析，它揭示了在激活的CBt MSC上与血细胞渗出和归巢相关的几种基因(包括归巢受体)以及与粘附和侵袭相关的关键粘附分子的激活(图10A)。在激活的CBT MSC与静息MSC上归巢受体、粘附分子和侵袭蛋白(金属蛋白酶)的热图，它们通过流式细胞术评价(图10B)。对于生物分布实验，在GvHD诱导(在第0天输注PBPC)后在第+8天将用DiR预标记的静息或激活CBt-MSC经尾静脉注射施用于NSG小鼠(每只小鼠2×10

如图10C和10D中所示，在72小时荧光分析后，观察到激活的CBT-MSC在小鼠中持续时间比对照CBt-MSC长，长达3天。如图10E中所示，在注射后3小时、48小时和72小时收获小鼠组织，并按组织计算平均辐射效率。激活的CBt-MSC组与对照MSC组相比显示较高的荧光水平的趋势，如图10F中的肺、图10G中的肝脏和图10H中的脾脏所示。

下一步，观察到冷冻保存的激活的UCMSC证明了与新鲜的激活的UCMSC相似的活力、表型和控制T细胞激活的效力(图11)。收获激活的细胞并冷冻2周。该时间后，将细胞解冻，并使用流式细胞术分析它们的表型。图11A显示了使用膜联蛋白V和碘化丙啶测定通过流式细胞术确定的CBt-MSC的活力的代表性FACS图。通过CFSE测定评价由(静息的和激活的)CBt MSC介导的T细胞免疫抑制。简言之，从健康志愿者PBMNC获得淋巴细胞并通过ficoll分离。使用Pant T细胞微珠(Miltenic)分离T细胞并用5(6)-羧基荧光素二乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯(CFSE；Sigma-Aldrich)染色。然后将它们悬浮在淋巴细胞培养基：含有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640培养基(Gibco,Grand Island,NY,USA)中。对于共培养测定，将100ul MSC以不同的浓度(1x10

还观察到冷冻保存的激活的CBt-MSC增加了总体生存期并减少了GVHD毒性(图12)。小鼠接受300cGy辐照，接着如上所述在24小时内输注2×10

图12A-12C概述了多组小鼠的体内实验(每组n＝8只小鼠)。图12A显示了未处理(GVHD对照)、未激活CBt-MSC的接受者和激活CBt-MSC的接受者的生存期曲线。数据证明了激活CBT-MSC的接受者与未激活MSC或对照相比的生存期收益。图12B显示了体重百分比变化证明了激活CBt-MSC的接受者与其余两组相比有较少的体重减轻。图12C显示了平均GVHD评分，再次表明激活CBT-MSC组较少的GVHD。图12D显示了在终点时间点时三组小鼠之间比较肝门炎症。图12E显示了未处理(对照)、用静息CBt-MSC处理与激活(激活的)MSC处理的小鼠的血液学检验的比较。血液学检验包括WBC计数、MCV、MCHC、血细胞比容、血红素、血小板计数、RBC计数、MCH、RDW、白蛋白、碱性磷酸酶、钾、LDH、AST、葡萄糖、ALT、磷、总蛋白。结果显示与对照或未激活MSC组相比在用激活MSC处理的组中在血小板计数、葡萄糖、WBC计数和肝功能(ALT,AST)方面有改善。

图12F显示了在小鼠血液中细胞因子水平的结果，揭示了与对照小鼠相比，激活和未激活的CBt-MSC两者都减少炎性细胞因子的存在。图12G显示了在第24天时小鼠血液中人CD45的百分比。左图面显示了来自每组的代表性FACS图，而右图面显示了带有与对照组(未处理)比较的统计学比较的条形图，其中**p-值<0.01,****p-值<0.0001，证明在两个MSC接受者组中人CD45

根据本公开，在不需要过多实验的情况下可以做出和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管本发明的组合物和方法借助于优选实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员显而易见的是在不偏离本发明的概念、精神和范围的前提下可以对本文所述的方法以及所述方法的步骤或步骤的次序进行改变。更具体地，很显然在化学和生理学上均相关的某些药剂可以代替本文所述的药剂，同时将实现相同或相似的结果。对本领域技术人员来说很明显的所有这样的相似替代和修改被认为在由附带的权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。

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下列参考文献以它们提供示例性程序或对在本文中给出的那些补充的其他细节的程度通过引用具体地并入本文。

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