用于因子Xa的新型化学发光底物

技术领域

本发明涉及适于监测凝血酶因子Xa的化学发光底物分子。该底物尤其可用于测定样品中的凝血因子和定量样品中的抗凝剂。

背景技术

血液凝固(Coagulation of blood)(也称为凝血(clotting))为血液从液体到凝胶的转变，导致血凝块。凝血是止血过程的一部分，并最终防止失血过多。凝血开始于血管的内皮衬里(endothelium lining)受损后不久。内皮下空间的暴露导致血浆因子VII(FVII)与组织因子的结合，其最终导致纤维蛋白的形成。在所谓的原发性止血中，血小板立即在受伤部位形成栓塞。所谓的继发性止血同时发生：凝血因子以复杂的级联反应响应以形成纤维蛋白链，从而增强血小板栓塞。凝血在整个生物学中高度保守。

因子X(FX)是凝血中的关键蛋白。FX为活化因子X(FXa)的酶原。FX可通过组织因子(TF)与因子VII(a)(FVII(a))的复合物或通过tenase复合物被激活。tenase复合物包含作为酶的活化的因子IX(FIXa)、作为辅因子的活化的FVIII(FVIIIa)以及酶原FX，它们都结合到含有一定百分比的带负电荷的磷脂的磷脂表面。复合物将FX转换为FXa。

由于各种原因，对FX或FXa活性的检测和定量是感兴趣的。FXa通过切割凝血酶原产生活性凝血酶而起作用；FX是FXa的酶原，因此FX可以转换为FXa。因此，它们的检测提供了凝血动力学方面的见解。FXa活性也可以用作抗凝剂活性的量度：FXa或其形成物的检测可用于测量抗凝蛋白(如蛋白C和蛋白S)的浓度。最后，FXa还可以用作几种抗凝药物(如类肝素或针对FXa的直接口服抗凝剂(DOAC)化合物)的读出值。

定量凝血因子的方法是公知的(参见S.S.van Berkel，PhD thesis chapter 1，2008，Radboud University Nijmegen)。M.van Geffen(PhD Thesis chapters 2and 3，2012，Radboud University Nijmegen)描述了整体止血测定法(global hemostasisassay)——一种较新类别的测定法。传统上，在这些已知的定量凝血因子的方法中，将纤维蛋白形成物作为读出值来测量。或者，当用酶(如凝血酶或FXa)切割肽时，后来开发的基于缀合到肽的对硝基苯胺的显色(chromogenic)探针可释放游离的对硝基苯胺(pNA)。所产生的颜色可以被定量并且是酶活性的量度。实例为商购自Chromogenix的S-2765，其为Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl；以及商购自Chromogenix的S-2222，其包含Bz-IIe-Glu-Gly-Arg-pNA·HCl(IEGR为SEQ ID NO:1)。

显色测试有缺陷：因为它们的方法取决于光密度的测量，所以它们不能在由于形成血块而变得混浊的混合物中进行，并且显色黄色干扰血浆的固有黄色。因此，它们应在去纤维蛋白且因此贫血小板血浆(platelet poor plasma)中进行。它们也需要二次采样，因为它们无法在连续装置中进行测量。从贫血小板血浆(PPP)到富血小板血浆(PRP)到全血，尽管伴随着生理系统变得更能够代表体内发生的事情，但是在技术上更加难以评估。荧光底物的应用使在无去纤维蛋白、富血小板血浆和全血中的测量成为可能，因此使测量系统更接近于生理系统，同时允许进行连续监测。上文引用的Van Berkel论文讨论了凝血酶荧光探针的开发。

荧光探针ab204711为可商购的(来自Abcam PLC，UK)。该因子Xa活性测定试剂盒(荧光法)(ab204711)利用因子Xa切割合成底物的能力，从而释放出可被荧光读取器定量的荧光团。类似的试剂盒可获自Merck公司(目录号MAK238-1KT)。

其他可商购的底物为Eurogentec的

荧光底物有缺陷：凝血系统分析的商业平台通常不支持荧光分析，因此需要另外的仪器。另外，期望尽可能地在一个分析仪上进行所有凝血测试，以简化测试并将人工减至最少。因此，使用单独的仪器进行整体分析测量会降低其作为常规方法的适用性。由于内滤效应(inner-filter effect)和淬灭效应，荧光信号还具有与产物浓度不成线性的缺陷。

发光底物没有这些缺陷。它们比显色底物或荧光底物更敏感，且不需要复杂的滤光器或激发源。US5035999涉及发光底物，然而这些底物不适于在水溶液(例如血浆)中的测量，也不适于连续测量。WO2012096566涉及凝血酶或纤溶酶的底物。Cosby等人(―Customenzyme substrates for luciferase-based assays”，Cell Notes，第18期，第9-11页，2007年)涉及发光底物，然而它们不适于在水溶液(例如血浆)中的测量，也不适于连续测量。溶解性差通常需要有机助溶剂，这会降低测定的生理条件，或者需要更大体积的样品或添加更大体积的试剂。

对于许多临床情况(例如，在儿科抽血、家庭情况下的护理点监测、在使用直升机救护车的外出重症监护情况下)而言，期望具有需要较小反应体积从而需要较少血液的针对凝血因子的诊断测试。该系统的设计应相当简单，并且不需要复杂的技术，从而使其可以应用于(一次性)一体式护理设置(all in one point of care device)。此外，探针应允许较宽的动态范围，优选超过现有测定法提供的三个数量级。探针应特异于其酶(例如FXa)，并且敏感以便在小样品体积中使用。实时测量的启用将提高可以使用这些新探针的测定的灵活性。

存在以下需求：一种用于测量FXa产生和/或测量其他凝血因子或其活性的新的测定方法，其不具有上述缺点，即它应该更简单并且应该能够以直接的方式(优选以线性方式)测定凝血的产生和纤溶因子(fibrinolytic factor)。本发明的目的是提供用于这种测定的底物和方法。

发明内容

本发明属于用于医学相关的测定作为底物的新分子领域，特别是血液凝固领域。当用合适的酶切割分子时，分子会释放化学发光物质。更具体地，新分子可以用于直接测量止血因子活性的新方法中。更确切地说，本发明涉及分子，其用于定量凝血因子的方法，或其用于在整体测定法中分析FXa产生的方法。待定量的凝血因子至少为促凝血因子FIX、FVIII、FVII和抗凝血因子抗凝血酶、蛋白C和蛋白S。本发明还涉及定量针对Xa的类肝素和直接口服抗凝剂(DOAC)的方法。

在一方面，本发明涉及通式(I-3)或(I-4)的化合物或其生理学上可接受的盐，

其中r为0、1、2或3；r’为0、1、2或3；d为0、1或2；g为0或1；g’为0或1；X为选自以下的末端部分：NH

在另一方面，本发明涉及一种组合，其包含如第一方面所定义的化合物和至少一种选自荧光素酶、ATP、Mg

在另一方面，本发明涉及定量样品中凝血因子的方法，该方法包括以下步骤：a)使样品与包含第一方面的化合物的组合物接触以释放氨基荧光素；b)使氨基荧光素与荧光素酶接触；和c)测定由荧光素酶产生的相对光强度。当在步骤a)中提供FXa时，该方法可用于定量样品中的抗凝剂。

具体实施方式

发明人出乎意料地发现，一类化学发光化合物可用于止血测定中以检测FXa活性，或通过FXa检测间接检测其他因子的活性。因此，在第一方面，本发明提供了通式(I-3)或(I-4)的化合物或其生理学上可接受的盐，

其中

-r为0、1、2或3；

-r’为0、1、2或3；

-d为0、1或2；

-g为0或1；

-g’为0或1；和

-X为选自以下的末端部分：NH

任选地其中羧酸部分用C

下文将这类化合物称为本发明的化合物。

通式I-3的化合物包含通过酰胺键与化学发光胺连接的三肽。通式I-4的化合物包含通过酰胺键与化学发光胺连接的四肽。在X形成氨基酸的情况下，术语三肽仍用于通式I-3，四肽用于通式I-4；尽管四肽包含三肽，但是当这些术语旨在指通式I-3或I-4的结构时，而不是通常指三肽和四肽，上下文将变得清楚。通式I-3和I-4共有许多特征。因此，如本文中所使用的，提及没有指明诸如-3或-4的通式旨在涉及该通式的-3和-4变体。例如，通式I涉及I-3和I-4，并且通式Is涉及I-3s和I-4s。为了便于参考，三肽或四肽中存在的氨基酸从与化学发光胺直接相邻的阳离子氨基酸开始编号。因此，在通式I-3中与X连接的残基为残基3，而在通式I-4中为残基4。

化学发光分子是本领域已知的。化学发光胺的实例为荧光素的胺，例如萤火虫荧光素的胺、Latia荧光素的胺、细菌荧光素的胺、腔肠素的胺、海萤荧光素

在优选的实施方案中，提供了本发明的化合物，其中所述化合物具有通式(II-3)或(II-4)：

其中r、r’、d、g、g’和X如本文其他地方所定义，优选其中氨基荧光素部分的4-羧酸为S。

当化学发光胺包含在本发明的化合物中时，它们不能是其相应的荧光素酶的底物。通过FXa的切割可释放化学发光胺，并能通过相应的酶进行转化，从而导致光子的发射，或换句话说，产生光量子。

本发明的化合物可以具有羧酸部分。任选地，这些可以用C

因此，本发明的化合物也可由通式0表示：

其中r、r’、d、g、g’和X如上定义，并且其中R为H或C

本发明的化合物可为生理学上可接受的盐。这样的盐是本领域已知的，并且技术人员可以选择合适的盐形式。在本发明的上下文中，生理学上可接受的盐为在下文示例的测定中仍可以用作底物的盐。生理学上可接受的盐的实例为酸加成盐或碱金属盐(例如钠盐或钾盐)。优选为酸加成盐。合适的酸加成盐为通过添加甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸(tosylic acid)或氢卤酸(如HBr或HCl)而形成的盐。在优选的实施方案中提供了本发明的化合物，其中所述化合物为酸加成盐，其任选地选自HCl盐、乙酸盐、甲酸盐、TFA盐和甲磺酸盐，优选为HCl盐或TFA盐，最优选为TFA盐。

通式I-4化合物的第三残基具有可以为1、2或3个亚甲基单元长的侧链。这是因为d为0、1或2。当d为0时，第三残基可为天冬氨酸；当d为1时，第三残基可为谷氨酸。这种化合物显示出良好的结果。因此，在优选的实施方案中，提供了本发明的化合物，其中d为0或1，优选为1。

通式I的第一残基具有阳离子侧链，并且通式I-3的第三残基也具有阳离子侧链。当g或g’为0时，这些阳离子侧链可基于伯胺，而当g或g’为1时，这些阳离子侧链可基于胍部分。其中g为1的底物对FXa具有良好的亲和力；因此，在优选的实施方案中，g为1。在优选的实施方案中，g'为1。在更优选的实施方案中，g和g'为1。当g为1时，优选r为1，由于精氨酸的r为1并且g为1。类似地，当g为0时，优选r为2，因为赖氨酸的r为2且g为0。类似地，当g’为1时，优选r’为1。类似地，当g’为0时，优选r′为2。在优选的实施方案中，提供了本发明的化合物，其中r为1或2，或其中g为1，优选其中r为1，更优选其中r为1且g为1。

优选精氨酸和赖氨酸用于定量丝氨酸蛋白酶活性，包括FXa。当需要更快速作用的底物时，精氨酸可为优选的。当需要更慢作用的底物时，赖氨酸可为优选的。本发明的化合物对FXa的亲和力影响测定参数。对于整体测定，需要具有较低亲和力的底物。对于定量分析，需要具有更高亲和力的底物。

发现具有特定手性的底物对FXa具有改善的亲和力。优选地，第一残基为L。对第二残基(其缺少侧链，因此其可以说是甘氨酸)而言，没有手性优选。对于第三残基而言，没有普遍的优选，但是对于具有三肽的通式而言，优选为D，而对于具有四肽的通式而言，优选为L。第四残基优选为L。因此，在优选的实施方案中，本发明的化合物的第一残基为L。在更优选的实施方案中，当该化合物具有通式I-3时，本发明的化合物的第一残基为L且第三残基为D；或者当该化合物具有通式I-4时，第三残基或第四残基为L。因此，在优选的实施方案中，提供了本发明的化合物，其中该化合物具有通式(I-3s)或(I-4s)，

其中r、r’、d、g、g’和X如本文其他地方所定义。

X为选自以下的末端部分：NH

当X为NHC(＝O)(O)

如X中所包含的，C

如X中所包含的，C

如X中所包含的，(OCH

X也可为NP’。P’为胺保护基。胺保护基是本领域已知的，并且可以保护胺中的氮原子以及其他氮原子。合适的胺保护基的实例在本领域中有广泛的记载，例如由P.G.M.Wuts和T.W.Greene，Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis，第四版，2006年(ISBN：978-0-471-69754-1)。本领域技术人员将能够选择根据本发明使用的合适的保护基。合适的胺保护基的实例为三苯甲基、烯丙基、苄基(Bn)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)、2-三甲基甲硅烷基乙氧羰基、甲苯磺酰基(Ts)、乙酰基(Ac)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰亚胺、亚苄基胺(benzylideneamine)和烯丙氧羰基(Alloc)。P’的优选基团是三苯甲基、烯丙基、苄基(Bn)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)、甲苯磺酰基(Ts)和烯丙氧羰基(Alloc)。P’的更优选基团为烯丙氧羰基和叔丁氧羰基。P’总是与氮原子相连，并且胺保护基的多个实例可保护单个胺或氮原子——如技术人员所理解的，胺保护基也可以保护非严格意义上的胺的氮原子，例如吡啶环中的氮原子。应该添加或省略氢，以保持与P’相连的氮的正确化合价。因此，在化合价允许的情况下，NP’可以与NHP’互换，而NHP’可以与NP’互换。在优选的实施方案中，提供了本发明的化合物，其中P’选自三苯甲基、烯丙基、苄基(Bn)、苯甲酰基(Bz)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)、2-三甲基甲硅烷基乙氧羰基、甲苯磺酰基(Ts)、乙酰基(Ac)、三氟乙酰基、邻苯二甲酰亚胺、亚苄基胺(bezylideneamine)和烯丙氧羰基(Alloc)，优选选自苄基(Bn)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)、甲苯磺酰基(Ts)和烯丙氧羰基(Alloc)，更优选P’为苄氧羰基。

在优选的实施方案中，X由通式X-2表示：

其中m为0、1、2、3、4、5或6；p为0、1、2、3、4、5或6；s为0、1、2、3、4、5或6；且a为0或1；其中在m、s或p中包含的亚甲基部分可以被甲基、乙基或异丙基取代，任选地其中所得的烷基或亚烷基部分可以被一个或多个卤素原子(例如氟或氯)取代。因此，在优选的实施方案中，提供了本发明的化合物，其中该化合物具有通式(III-3)或(III-4)，

其中

-d为0、1或2；

-r为0、1、2或3；

-r’为0、1、2或3；

-g为0或1；

-g’为0或1；

-m为0、1、2、3、4、5或6；

-p为0、1、2、3、4、5或6；

-s为0、1、2、3、4、5或6；和

-a为0或1；

其中m、s或p中包含的亚甲基部分可以被甲基、乙基或异丙基取代，任选地其中所得的烷基部分可以被一个或多个卤素原子(例如氟或氯)取代。可以添加或去除氢原子以保持正确的化合价。优选地，当m中包含的亚甲基部分被取代时，m为1或2；更优选地，当m中包含的亚甲基部分被取代时，m为2并且与氧原子相邻的亚甲基部分被一个或两个甲基部分取代。这分别形成异丙氧基和叔丁氧基。当p为1、2、3、4、5或6时，优选m为0、1或2，并且当m为2时，与氧原子相邻的亚甲基部分被一个或两个甲基部分取代。

a为0或1的整数，因此它可以在X中引入酰胺部分。由于它们方便的合成可及性，优选其中a为1的化合物。

s为0、1、2、3、4、5、6或6的整数。当s为0且a为1时，X包含氨基甲酸酯部分。在其他情况下，s可形成将肽与低聚乙二醇部分(当存在时)或末端醇或甲基醚连接的接头部分。s中的亚甲基部分可以任选地被甲基、乙基或甲氧基取代，并且任选地被一个或多个卤素原子(如氟或氯)取代。当p为1、2、3、4、5或6时，优选s为0、1或2，更优选为1或2，更优选为1。当p为1、2、3、4、5或6时，优选a为0且s为0、1或2，更优选a为1且s为1或2，更优选为1。

p为0、1、2、3、4、5、6或6的整数。它可以形成对本发明的化合物的水溶性具有积极作用的低聚乙二醇部分。p中的乙二醇部分可以任选地被甲基取代，并且可以任选地被一个或多个卤素原子(如氟或氯)取代。优选p为1、2、3或4，更优选为1、2或3，甚至更优选为2或3，最优选为2。

在优选的实施方案中，本发明提供了通式III-3或III-4的化合物，其中

-d为0或1，优选为1；和/或

-r为1或2，优选为1；和/或

-r’为1或2，优选为1；和/或

-g为0或1，优选为1；和/或

-g’为0或1，优选为1；和/或

-m为0或1；和/或

-p为1、2或3，优选为2；和/或

-s为1或2，优选为1；和/或

-a为1。

表1显示了通式I-4、I-4s、II-4或III-4的优选实施方案。

表1

在优选的实施方案中，通式I-4、I-4s、II-4或III-4的化合物选自AE、AF、AG、AH、AM、AN、AO、AP、AU、AV、AW和AX。在优选的实施方案中，通式I-4、I-4s、II-4或III-4的化合物选自AE、AF、AG、AH、AM、AN、AO和AP。在优选的实施方案中，通式I-4、I-4s、II-4或III-4的化合物选自AE、AF、AG、AM、AN和AO，更优选选自AF、AG、AN和AO，甚至更优选选自AF和AN，最优选其为AN。

表2显示了通式I-3、I-3s、II-3或III-3的优选实施方案。

表2

表3显示了X的优选实施方案，其中X具有通式X-2。

表3

在表3的实施方案其中m为1或2的优选实施方案中，其为1。优选地，在表3的其中m为1或2的实施方案中，当m为2时，与氧原子相邻的亚甲基部分被一个或两个甲基部分取代。在优选的实施方案中，X选自XBO、XBP、XBQ、XBR、XBS、XBT、XBU、XBV、XBW、XBX、XBY、XBZ、XCA、XCB、XCC和XCD，更优选选自XBO、XBP、XBQ、XBR、XBS、XBT、XBU和XBV，更优选选自XBO、XBP、XBQ、XBS、XBT和XBU，最优选为XBT。

在优选的实施方案中，通式I-4、I-4s、II-4或III-4的化合物选自AE、AF、AG、AH、AM、AN、AO、AP、AU、AV、AW和AX，最优选为AN；其中X选自XBO、XBP、XBQ、XBR、XBS、XBT、XBU、XBV、XBW、XBX、XBY、XBZ、XCA、XCB、XCC和XCD，更优选选自XBO、XBP、XBQ、XBR、XBS、XBT、XBU和XBV，更优选选自XBO、XBP、XBQ、XBS、XBT和XBU，最优选为XBT。在优选的实施方案中，通式I-4、I-4s、II-4或III-4的化合物选自AE、AF、AG、AH、AM、AN、AO和AP，最优选为AN；其中X选自XBO、XBP、XBQ、XBR、XBS、XBT、XBU、XBV、XBW、XBX、XBY、XBZ、XCA、XCB、XCC和XCD，更优选选自XBO、XBP、XBQ、XBR、XBS、XBT、XBU和XBV，更优选选自XBO、XBP、XBQ、XBS、XBT和XBU，最优选为XBT。在优选的实施方案中，通式I-4、I-4s、II-4或III-4的化合物选自AE、AF、AG、AM、AN和AO、最优选为AN；其中X选自XBO、XBP、XBQ、XBR、XBS、XBT、XBU、XBV、XBW、XBX、XBY、XBZ、XCA、XCB、XCC和XCD，更优选选自XBO、XBP、XBQ、XBR、XBS、XBT、XBU和XBV，更优选选自XBO、XBP、XBQ、XBS、XBT和XBU，最优选为XBT。

表4显示了本发明的化合物的优选实施方案。本发明的更优选的化合物为表4中所示的化合物的生理学上可接受的盐，更优选为酸加成盐，最优选为TFA盐。在优选的实施方案中，提供了本发明的化合物，其中本发明的化合物选自MePEG2-IEGR、MePEG2-IDGR、MePEG3-IEGR、MePEG3-IDGR、MePEG2-RGR、MePEG2-RGK、MePEG3-RGR和MePEG3-RGK。

表4

在更优选的实施方案中，化合物选自MePEG2-IEGR、MePEG2-IDGR、MePEG3-IEGR、MePEG3-IDGR、MePEG2-RGR和MePEG3-RGR。在甚至更优选的实施方案中，化合物选自MePEG2-IEGR、MePEG2-IDGR、MePEG3-IEGR和MePEG3-IDGR。在最优选的实施方案中，提供了本发明的化合物，其中本发明的化合物选自MePEG2-IEGR和MePEG2-IDGR，优选为MePEG2-IDGR；更优选为其生理学上可接受的盐，例如TFA盐。

在另一方面，本发明提供了一种组合，其包含本发明的化合物和至少一种选自荧光素酶、ATP、Mg

荧光素酶是使用荧光素作为底物产生生物发光的氧化酶类别的总称。荧光素酶不需要外部光源，但确实需要荧光素和O

ATP为荧光素酶所需的，并且优选以适合于激活荧光素酶活性的量存在于本发明的组合中，或者以适合于制备能启动荧光素酶活性的稀释液的量存在于原液中。合适的ATP原液为在蒸馏水中的1mM溶液，但在任何生理学上可接受的溶剂体系中，它也可为200μM至10mM范围内的任何原液。

本发明的组合可以进一步包含镁离子，因为发现这些镁离子放大了由荧光素酶产生的发光信号。然而，也可使用其他二价阳离子(例如Mn

本发明的组合可进一步包含凝血因子。凝血因子有时被称为止血因子，且在本领域中为公知的。合适的凝血因子的实例为丝氨酸蛋白酶，特别是丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)，优选选自凝血酶、FXa、纤溶酶、因子VIIa、因子IXa、血浆激肽释放酶、因子XIIa、因子XIa、组织型纤溶酶原活化剂(tPA)(优选双链tPA(tc-tPA))、活化的蛋白C和尿激酶(uPA)(优选tc-uPA)。丝氨酸蛋白酶的酶原也包括在内，例如凝血酶原、FX、FVII、FIX、前激肽释放酶、FXII、FXI、sc-tPA(单链tPA)、蛋白C和sc-uPA。在非常优选的实施方案中，止血因子为FXa或FX。优选地，凝血因子以这样的组合形式存在，即可通过存在的因子产生FXa，或者当本发明的组合与包含其他凝血因子的样品接触时可产生FXa。在此情况下，样品提供级联反应中缺少的凝血因子以产生FXa，且与样品接触允许产生FXa。优选地，在此种级联反应中存在的仅缺少单个因子的所有因子相对于缺少因子的预期浓度过量存在。这允许样品中的因子产生随其浓度而变化的FXa，此后FXa可产生与其浓度成比例的发光信号，且因此与样品中的因子浓度成比例。关于方法的部分有更多关于如何构成此类组合物的细节。

在优选的实施方案中，组合的物质包含在单个组合物中。这样的组合物可以包含其他物质，例如赋形剂。水(如蒸馏水)为合适的赋形剂。其他合适的赋形剂为缓冲盐，例如三(三(羟甲基)氨基甲烷)。

在其他优选的实施方案中，组合的物质包含在不同的组合物中。这对于提供成套试剂盒很方便。在优选的实施方案中，本发明提供了成套试剂盒，其包含本发明的化合物和至少一种选自荧光素酶、ATP、Mg

在特定的实施方案中，本发明提供了一种用于测量化学发光的装置，该装置包含本发明的化合物，优选地，其中该装置为护理点装置。下文将这种装置称为本发明的装置。

本发明的装置可为例如发光计(如常规的台式发光计或用于手术室的发光计)，或其可为光学显微镜；优选地，其为发光计。发光计和显微镜为本领域已知的，且技术人员可选择适合与本发明的化合物一起使用的发光计或显微镜。本发明的装置也可为包含本发明的化合物或本发明的组合的一次性或非一次性药筒或插入物或比色皿或反应器体积。优选这种装置被设计用于常规的发光计或显微镜。

在优选的实施方案中，本发明的装置为护理点装置。可使用如下文所述的本发明的方法测量的小体积使得该方法理想地适合于护理点分析，例如床旁分析(bedsideanalysis)、现场分析(analysis in the field)或移动时分析(analysis while mobile)。优选的护理点装置包括移动式发光计，并适于测量在现场、或移动时或在床旁获得或已经获得的样品中的酶活性。

优选地，本发明的装置不包括用于分析的光源。优选地，本发明的装置具有可用于同时分析多个参数的多个体积或通道。优选地，本发明的装置被配置为分析体积最多为100、80、60、50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1μL的样品，更优选体积最多为15、10、5、4、3、2或1μL的样品，甚至更优选体积最多为5μL的样品。优选地，本发明的装置被配置为实时呈现其分析结果，例如经由显示屏或经由仪表或液位指示器。非常优选，当本发明的装置被配置用于同时分析至少两种不同的测定时，优选酶活性(例如FVIII活性或FXa活性)的定量测定以及例如凝血测定的整体测定。

在另一方面，本发明提供了一种用于定量样品中凝血因子的方法，该方法包括以下步骤：

a)使样品与包含本发明的化合物的组合物接触以释放氨基荧光素；

b)使氨基荧光素与荧光素酶接触；和

c)测定由荧光素酶产生的相对光强度。

这样的方法在下文中被称为本发明的测定法。在本发明的上下文中，凝血因子的定量可以理解为凝血因子活性的定量。技术人员将理解，当确定酶原活性时，其相应酶的活性为测定的一部分。

涉及荧光素酶的化学发光原理为技术人员公知的。通常使用荧光素酶、荧光素、ATP和分子氧来产生光子；已知Mg

发明人发现，通过使用本发明的化合物，可以连续、半连续或以直接的方式测量止血因子的产生(例如直接的或非直接的FXa产生)或FXa的浓度本身，而无需计算用于测量凝血因子产生的发色方法或荧光方法所需的一阶导数。通常，在通过感兴趣的止血因子切割本发明的底物时，释放出“发光分子”，即氨基荧光素，其易于随后进行产生可检测的光信号(或“光量子”或“光子”或“光单位”)的化学转化或酶促转化。由于光量子是在不可逆的步骤中产生的，因此没有输出信号的累积；该信号为FXa活性(因此也可能为在FXa产生中涉及的因子的活性)的直接量度。与使用荧光底物或显色底物的现有方法相比，本方法的显著优势为可以实时检测到与在任何给定时间点存在的止血因子的量成正比的信号；无需计算累积光信号的一阶导数。在本方法中，不干扰光信号的进一步产生。此外，测量信号不需要外部光源和光学滤波器。因此，本发明的方法比现有技术的方法更方便。

样品可为来自受试者的样品，优选为先前已经从受试者获得的样品。受试者可为人类。受试者可为非人类。样品优选为流体。优选的样品为血液或来源于血液。合适的样品为全血和血浆，例如贫血小板血浆或富血小板血浆。最优选的样品为贫血小板血浆，例如先前已从受试者获得的贫血小板血浆。

凝血因子为本领域公知的。在本发明的测定法的上下文中，优选的凝血因子为因子IX(FIX)、因子IXa(FIXa)、因子VIII(FVIII)、因子VIIIa(FVIIIa)、因子VII(FVII)、因子VIIa(FVIIa)、因子XI(FXI)、因子XIa(FXIa)、因子XII(FXII)、因子XIIa(FXIIa)、因子X(FX)和因子Xa(FXa)。符号(例如FX(a))指的是FX和FXa两者或其中之一。

凝血因子的生理作用为最终使凝血酶产生。就其反馈激活作用而言，凝血酶是凝血级联反应中最重要的组成部分。通常，在人类中该过程的各个部分如下：FVIIa的循环量高于任何其他活化的凝血因子。血管受损后，FVII(a)可与组织因子(TF)接触，最终形成活化的复合物(TF-FVIIa)。TF-FVIIa激活FIX以形成FIXa，并激活FX以形成FXa。TF-FVIIa对FX的激活(以形成FXa)几乎立即被TF-TFPI-FXa复合物中的TF(组织因子)通路抑制剂(TFPI)抑制。FXa及其辅因子FVa形成凝血酶原酶复合物，其将凝血酶原激活为凝血酶。然后凝血酶激活凝血级联反应的其他组分，包括FV和FVIII(其与FIX形成复合物)，并激活和释放FVIII使其不与vWF结合，以形成FVIIIa。FVIIIa为FIXa的辅助因子，它们共同形成激活FX的“酶”复合物，从而继续循环。

在优选的实施方案中，提供了本发明的测定法，其中凝血因子选自因子IX、因子IXa、因子VIII、因子VIIIa、因子VII、因子VIIa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子X和因子Xa。凝血因子应为FXa或应有助于FXa的形成。

例如，当待测定的凝血因子为FXa时，则凝血因子为FXa。当待测定的凝血因子不是FXa时，则凝血因子应有助于FXa的形成。为此，FX应存在。

在某些组合中，FXa的产生与酶复合物中的几种凝血因子(如FVIII、FIX和FX)或TF-FVIIa复合物中的组织因子或FVIIa的浓度成比例。当除了缺少因子之外的所有因子都过量存在时，则缺少因子的活性可与通过发光输出测定的最终FXa活性相关。

FX可通过FVIIa转化为FXa或在TF存在下通过FVIIa转化为FXa，因此，当待测定FVIIa时，凝血因子应为FX；这是因为样品中的FVIIa然后可以将过量的FX转化为FXa。

在所谓的酶复合物中，FX也可通过FIXa和FVIIIa转化为FXa。酶复合物由FIXa、FVIIIa、FX、阴离子磷脂和钙组成。因此，当待测定FIXa时，凝血因子应该为FX或FVIIIa，且优选FX和FVIIIa都应存在，更优选与阴离子磷脂和钙一起存在。因此，当待测定FVIIIa时，凝血因子应为FX或FIXa，且优选FX和FIXa都应存在，更优选与阴离子磷脂和钙一起存在。反过来，FIX可通过FXIa转化为FIXa，因此当待测定FIX时，除了针对FIXa所述的条件之外，还优选存在FXIa。技术人员了解凝血通路中的各种相互作用，并且能够根据待测定的凝血因子来选择存在于本发明的测定中的合适的凝血因子。通常，凝血通路的组分应过量存在，而待测定的组分则被省略。然后，通过样品提供待测定的凝血因子，并且由于其任何底物、辅因子或其他相互作用物过量存在，因此待测定的凝血因子的量将与产生的FXa的活性直接相关，且该活性最终通过本发明的化合物检测到。

技术人员将理解，酶原的检测通常将涉及相应酶的检测，且因此酶原的检测相当于酶原和相应活性酶的检测。例如，检测FVII导致同时检测FVII和FVIIa。

在一类优选的实施方案中，存在凝血通路的所有组分。这种测定在本文中称为整体测定，并且优选地使用样品本身提供的凝血因子进行整体测定。因此，在整体测定中，优选地，凝血通路的组分以一定比率存在，该比率类似于生理系统中发现的比率。优选用于整体测定的样品为全血和血浆，例如富血小板血浆或贫血小板血浆，更优选血浆，最优选贫血小板血浆。优选整体止血测定通过向血浆中加入活性凝血因子(例如FXIIa、FXIa或FIXa)或组织因子(TF)和/或钙来启动，更优选加入TF和/或钙，最优选加入TF和钙两者；这导致FXa产生，接着产生凝血酶和随后形成凝块。启动后，级联反应的传播和终止需要凝血酶。在这样的整体设计中测量FXa浓度可提供有关样品的凝血级联能力的信息。

在步骤a)中，使样品与包含本发明的化合物的组合物接触以释放氨基荧光素。FXa能够识别包含在本发明的化合物中的肽，并将其从发光部分切割以释放氨基荧光素。因此，当FXa为待测定的凝血因子时，在步骤a)中不需要存在其他凝血因子。在非常优选的实施方案中，钙和磷脂存在于步骤a)中。钙和磷脂应适合于形成酶复合物。优选这些磷脂为阴离子磷脂。

凝血因子活性的条件为本领域已知的，且在这些情况下，优选进行接触。实例为使用生理学上可接受的缓冲液，例如任选地包含1％血清白蛋白(如BSA)的Tris缓冲液。合适的Tris缓冲液的实例为Tris缓冲盐水(TBS；50mM Tris-HCl，150mM NaCl；pH 7.4)。优选本发明的底物的浓度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50μM或更高，更优选为至少20或30μM，例如为至少30μM。优选本发明的底物的浓度为至多5000、4000、3000、2000、1750、1500、1250、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60μM或更低，更优选为至多2500或200μM或1750μM或1500μM或1250μM或1000μM或900μM或800μM或700μM或600μM或500μM或更低，甚至更优选为至多2000或750μM或更低，例如为至多750μM。

该步骤为将待测定的凝血因子的存在与发光输出相关联，因此在该步骤中释放荧光素酶的底物。在本发明的上下文中，释放被解释为例如通式II-4(其中羧酸为S)所示的氨基荧光素部分的水解。根据底物，还可释放其他发光部分。释放是为了使化学发光底物可用于步骤b)中的后续转化，因为当化学发光底物包含在本发明的化合物中时，其不可用于进一步的转化。

在优选的实施方案中，提供了本发明的测定法，其中待测定的凝血因子选自因子IX、因子IXa、因子VIII、因子VIIIa、因子VII、因子VIIa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子X、因子Xa、前激肽释放酶和激肽释放酶，优选选自因子IX、因子IXa、因子VIII、因子VIIIa、因子X和因子Xa，

任选地，其中在步骤a)中，组合物包含至少一种其他凝血因子，其选自因子IX、因子IXa、因子VIII、因子VIIIa、因子VII、因子VIIa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子X、前激肽释放酶和激肽释放酶，优选选自因子IX、因子IXa、因子VIII、因子VIIIa和因子X。凝血因子应为FXa或应如上所述有助于FXa的形成。其他凝血因子应有助于FXa的产生。

在所谓的酶复合物中，FX可以通过FIXa和FVIIIa转换为FXa。酶复合物由FIXa、FVIIIa、FX、阴离子磷脂和钙组成。因此，当待测定FIXa时，凝血因子可为FX或FVIIIa中的一种，而其他凝血因子则优选为FX或FVIIIa，这取决于哪个因子不是已经被选择的凝血因子。因此，当待测定FVIIIa时，凝血因子应为FX或FIXa之一，且其他凝血因子应优选为FX或FIXa，这取决于哪个因子不是已经被选择的凝血因子。技术人员了解凝血通路中的各种相互作用，并且能够根据待测定的凝血因子来选择存在于本发明的测定中的合适的凝血因子和其他凝血因子。

在步骤b)中，使氨基荧光素与荧光素酶接触。该接触的目的为从步骤a)中释放的化学发光分子(例如从释放的氨基荧光素)中产生光量子。在本领域中建立了用于转换化学发光底物以产生光量子的方法，且当在该接触过程中还存在其他物质时，荧光素酶(优选萤火虫荧光素酶)可变得更有功能。因此，在优选的实施方案中，步骤b)还包括使释放的化学发光分子与ATP接触。在优选的实施方案中，步骤b)还包括使释放的化学发光分子与Mg

步骤a)和步骤b)可以同时和/或在相同的反应体积中进行。在优选的实施方案中，步骤a)和步骤b)在相同的反应体积中进行，其优选同时包含步骤a)和b)所需的所有试剂。这允许释放的化学发光分子被荧光素酶立即转化。

在步骤c)中，测定发光信号。这可以以本领域中任何已知的方式来完成，例如使用发光计。所测定的光强度用作定量待测定的凝血因子的基础。这是因为，如上文所述以及实施例5和6示例的，凝血因子的浓度与相对光强度相关，优选表示为相对光单位(RLU)。在一些实施方案中，将相对光强度与参考值或校准曲线进行比较。优选地，使用已知量的待测定的凝血因子来制定这样的校准曲线，例如如实施例中所示。参考值可为设定值(例如预定值)，或者可为对照样品的测定结果。在本发明的上下文中，优选对照样品为已知满足某些要求的样品，或者是(先前)从健康受试者获得的样品，或者是正常混合血浆。

相对光强度直接表示实际的荧光素酶活性，而荧光素酶活性又直接表示所释放的发光底物的实际量，而发光底物的实际量又直接表示FXa活性。如上所述，FXa活性又可直接表示其他凝血因子的活性。由于所涉及的酶和底物的固定的k

因此，在某个时间点确定的相对光强度直接提供了有关凝血因子活性的相关信息。尽管如此，在设定的持续时间内或直到满足某种条件的相对光强度的测定仍可提供有关测定动力学的相关信息。这对于如上所述的整体测定特别有用，其中输出通常将为钟形曲线。因此，在优选的实施方案中，步骤c)包括测定荧光素酶在一段时间内产生的相对光强度。优选该时间段最长为150、120、90、80、70、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟或更短，更优选最长为35、30、15或10分钟或更短。优选时间段至少为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒，更优选至少为10、20或30秒，例如至少为30秒。

可修改本发明的测定法以允许定量抗凝剂。因此，本发明还提供了一种用于定量样品中抗凝剂的方法，该方法包括以下步骤：

a)使样品与包含因子Xa和本发明的化合物的组合物接触以释放氨基荧光素；

b)使氨基荧光素与荧光素酶接触；和

c)测定由荧光素酶产生的相对光强度。

该方法为量化FXa活性抑制的方法，在下文中称为本发明的抑制测定法。与如上所述的本发明的测定法的不同之处在于，在该方法中步骤a)中还提供FXa。其结果为，当不存在FXa的抑制剂时，由于FXa活性从本发明的化合物释放氨基荧光素，将产生已知量的发光信号。因此，例如当存在抗凝剂时，发光输出的任何降低都可归因于FXa抑制。优选待测定的抗凝剂为直接作用抗凝剂(DOACs)、肝素和类肝素。优选DOACs针对FXa，例如利伐沙班(rivaroxaban)(CAS 366789-02-8)、阿哌沙班(apixaban)(CAS 503612-47-3)和依度沙班(edoxaban)(CAS 480449-70-5)。

如所讨论的，在步骤a)中已经提供了FXa。FXa的此提供可为FXa的直接提供，或其可提供可产生FXa的组合物。这样的组合物在本领域为已知的。优选地，当步骤a)包括提供能产生FXa的组合物时，该组合物产生固定量的或已知量的FXa。

步骤b)和c)没有实质性的区别，并因此已在上文进行了描述。对于该方法中使用的用于定量抗凝剂的步骤c)，与参考值比较可为优选的，特别是当参考值为校准曲线时，其中已使用通过已知量的待测定的抗凝剂的FXa抑制作用。这在实施例4和在图4中示例。

在优选的实施方案中，本发明提供了本发明的测定法或本发明的抑制测定法，其中步骤c)包括测定荧光素酶在一段时间内产生的相对光强度，和/或其中所述测定法或抑制测定法不包括确定由荧光素酶产生的相对光强度的一阶导数。

总之，本发明提供了一种改进的、灵敏的用于监测测试样品中止血因子的产生的方法。本发明的方法允许设计用于测量一种或多种止血因子产生的光学护理点装置。

在优选的实施方案中，本发明的化合物和组合物用于本发明的方法中，或用于本发明的用途。除非另外指出，否则本文所标识的每个实施方案可组合在一起。

当本领域技术人员将结构式或化学名称理解为具有手性中心，却未指示手性时，对于每个手性中心，单独参考外消旋混合物(具有任何过量的对映异构体)、纯R对映异构体和纯S对映异构体中的所有三种。

本发明提供的化合物和使用的化合物可以被任选地取代。合适的任选取代为-H被卤素取代。优选的卤素为F、Cl、Br和I。其他合适的可任选的取代为一个或多个-H被-NH

每当在本发明的上下文中讨论物质的参数时，除非另有说明，都假定参数是在生理条件下测定、测量或显示的。生理条件是本领域技术人员已知的，并且包括水性溶剂体系、大气压、在6和8之间的pH值、从室温至约37℃(从约20℃至约40℃)范围的温度和合适浓度的缓冲盐或其他组分。可以理解，电荷通常与平衡相关联。所述携带或带有电荷的部分是这样的部分：其处于带有或携带这样的电荷的状态比不带有或不携带这样的电荷的状态更频繁。如此，如本领域技术人员所理解的，在本公开内容中指示为带电的原子可以在特定条件下不带电，且中性部分可以在特定条件下带电。

在本发明的上下文中，待评估参数的减少或增加意指该参数对应值的至少5％的变化。更优选地，该值的减小或增大意指至少10％，甚至更优选至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少90％或100％的变化。在后一种情况下，其可为这种情况——不再有与该参数关联的可检测值。

在本文及其权利要求中，动词“包括(to comprise)”及其词形变化形式以其非限制性意义使用，意指包括该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。“止血(Hemostasis)”和“止血(Haemostasis)”在本文中可互换使用。另外，不定冠词“一(a)”或“一个(an)”所提及的要素不排除存在一个以上要素的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个要素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。当词语“约(about)”或“大约(approximately)”与数值(例如约10)结合使用时，优选意指该值可为多于或少于该值的1％的给定值(为10)。另外，动词“由……组成(to consist)”可由“基本上由……组成(toconsist essentially of)”代替，意指本发明的组合物可以包含除特别确定的组分之外的其他组分，所述其他组分不改变本发明的独特的特征。

本说明书中引用的所有专利和文献参考均通过引用的方式全文纳入本文。

在本发明的上下文中，细胞或样品可以是获自受试者的样品中的细胞或样品。这样获得的样品可以是先前从受试者获得的样品。这样的样品可以从人类受试者获得。这样的样品可以从非人类受试者获得。

以下是本发明中提及的序列：

SEQ ID NO：1IEGR SEQ ID NO：2IDGR

SEQ ID NO：3IEGK SEQ ID NO：4IDGK

附图简要说明

图1–本发明的化合物的合成。A)合成共有的Gly-Arg/Gly-Orn核心；B)将共有的核心转化为具有肽核心Ile-Glu-Gly-Arg的前体；C)将Ile-Glu-Gly-Arg中间体转化为MePEG2-IEGR。

图2–FXa浓度为1.6nM的酶FXa及其底物MePEG2-IEGR的米氏(Michaelis-Menten)动力学。确定Vmax＝468000RLU且KM＝619μM，导致K

图3–底物MePEG2-IEGR与除FXa之外的丝氨酸蛋白酶的交叉反应最小。A)80nm FXa产生1,000,000RLU的信号；52nM凝血酶产生～30,000RLU；8nM纤溶酶产生～8,000RLU；193IU/mL tPA(促进纤维蛋白溶解的常规浓度)产生～6,000RLU；145nM FXIIa产生～500RLU；tPA以外的其他浓度代表活化后人血浆中的浓度。B)图A的一部分的近距离视图，其中y-轴已转换为对数刻度。

图4–阿哌沙班抑制底物MePEG2-IEGR的转化。在存在100pg/mL至100mg/mL阿哌沙班下，FXa(4nM)在10–1000ng/ml的范围内显示抑制作用。

图5–通过提供包含级联反应参与物过量组分但缺乏FVIII的反应混合物，基于FXa活性来测定样品中的FVIII活性。因此，由FXa活性引起的发光成为FVIII活性的量度。A)在不同的FVIII浓度下测得的RLU，表示为正常混合血浆的百分比；B)用于图A结果的校准线。该校准的线性回归为y＝30331+4376x且r

图6–通过提供包含级联反应参与物过量组分但缺乏FIX的反应混合物，基于FXa活性来测定样品中的FIX活性。因此，由FXa活性引起的发光成为FIX活性的量度。A)在不同的FIX浓度下测得的RLU，表示为正常混合血浆的百分比；B)用于图A结果的校准线。该校准的线性回归为y＝97471+8547x且r

图7–使用高组织因子浓度和低组织因子浓度(7pM或0.28pM)在整体止血测定中进行的FXa激活。

图8–A)使用化学发光读取器进行动力学测量的原始数据。B)此实施例使用固定的时间点(在这种情况下为3分钟)来绘制校准曲线。C)此实施例计算每个校准样在0.5–3分钟之间的斜率，以绘制校准曲线。

图9–A)用来测量31个FVIII临床样品的4条校准曲线的叠加。这四条结合的校准曲线的平均R

图10–A)使用化学发光读取器进行动力学测量的原始数据，其中包含各种FIX水平的校准样。B)绘制的校准曲线。

具体实施方式

实施例1–提供本发明的底物

如图1A所示，通过关键中间体A1合成底物。该中间体的合成开始于苯并噻唑1向腈2的转化，产率为91％。在直相和反相快速柱色谱法后，还原得到纯苯胺，产率为54％。在吡啶中，用PCl

如图1B中所示，在2步中，Fmoc-脱保护并立即与Fmoc-Glu(OtBu)-OH 12进一步偶联得到13，产率为72％。重复该顺序，但是这次使用Fmoc-Ile-OH 15，在2步中得到四肽16，产率为78％。将Fmoc-脱保护至关键结构单元A1的产率为95％。为提供通式I-3或I-4的化合物(其中存在其他氨基酸)，用所述其他氨基酸重复上述方案。

如图1C所示，通过A1与[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸17向18的肽偶联继续进行合成，产率为93％。对于其他部分X，可使用适当的试剂进行类似的偶联。通过反相制备色谱法纯化后，与D-半胱氨酸19的偶联得到氨基荧光素20，产率为76％。通过使用三氟乙酸进行保护基的去除，此后通过在乙醚中研磨分离出产物，命名为MePEG2-IEGR。

实施例2–本发明的底物的动力学行为

测定了酶FXa及其底物MePEG2-IEGR的米氏(Michaelis-Menten)动力学(在这些实施例中使用了TFA盐)。在冰上的微量试管中制备以下组合物：

组合物1：

160μL Tris缓冲盐水(TBS)50mM Tris-HCl，150mM NaCl(pH 7.4)

4μL ATP(最终浓度333μM)

4μL MgCl

12μL荧光素酶(最终浓度0.9mg/ml)

底物组合物2a-g：

准备具有30μL底物浓度的微量试管，导致最终浓度为2000、1333、1000、666、333、167和66μM。

酶组合物3：

在冰上的微量试管中制备FXa(Coachrom，16nM)组合物

随后，将以下组合物一起添加至白色384孔板中：

24μL组合物1

3μL组合物2a-g

3μL组合物3

随后，将孔板放置在37℃的恒温Flexstation 3(Molecular Devices)中。发光放射波长为1500ms的积分时间，在30分钟内每30s测量1s。

结果显示在图2中。在FXa浓度为1.6nM时，确定V

实施例3–交叉反应性

为了确定交叉反应性，使用以在人血浆中代表性浓度的一系列凝固酶进行测定。选定的酶浓度与活化后的体内预期浓度相当。对于组织型纤溶酶原活化剂(tPA)，这是促进纤维蛋白溶解的常规浓度。

浓度为80nm的FXa产生的信号为1.000.000RLU。其他凝血酶产生以下信号：52nM凝血酶产生～30,000RLU，8nM纤溶酶产生～8,000RLU，193IU/mL tPA产生～6,000RLU，145nMFXIIa产生～500RLU(图3)。这些数据表明本发明的底物优先被FXa切割。

实施例4–定量抗凝剂活性

作为抗凝剂的一个实例，将阿哌沙班(CAS号503612-47-3)以不同的浓度添加到FXa和MePEG2-IEGR的混合物中。阿哌沙班是一种用于治疗静脉血栓栓塞事件的口服抗凝剂。它是直接的FXa制剂。图4显示了在100pg/mL至100mg/mL的阿哌沙班存在下，阿哌沙班对底物通过FXa(4nM)转化的抑制作用。在10-1000ng/ml范围内显示出对FXa活性的抑制作用。

实施例5–定量FVIII测定

该发光FVIII测定为两步活性测定，其导致来自样品的固定量的FVIII的活化，这随后导致FX活化并因此导致本发明的底物的稳定转化。由于光子的快速衰减时间，发光因子测定法导致稳定的底物转化，而显色或荧光底物会积累信号(例如在405nm)，从而导致信号随时间增加(OD/min)。对于后一种测定法，必须计算斜率以确定转化率。在发光测定法中，平面输出(以RLU)直接表示转化率，这使得本发明的方法非常方便。

在测定中，添加凝血酶以激活FVIII。活化的因子VIII与因子IXa、磷脂(PLP)和钙形成酶复合物。该复合物将因子X激活为FXa；在测定中以恒定且过量的浓度提供FX。FXa作用于本发明的底物以释放荧光素酶的底物，从而导致发光活性。因此，发光活性与因子VIII活性的量直接相关，在恒定量的因子IXa存在下，因子VIII活性为限制因子。然后通过其对本发明的特定因子Xa发光底物的活性来精确地测量所产生的Xa因子。因子Xa切割底物并导致光子释放。产生的光子的量(表示为相对光单位，RLU)与因子Xa活性成正比，因此与因子VIII的量成正比。这种测定法的显色类似物为可商购的(例如Hyphen Biomed的BIOPHENFactor VIII测定法，目录号221402)。与该实施例的重要区别在于，本发明的底物与ATP、Mg

在测定中使用了不同量的FVIII(使用正常混合血浆(NPP)或其稀释液)。将样品与FX溶液混合。在37℃下孵育约2分钟后，添加FIXa、凝血酶、钙和磷脂在蒸馏水中的溶液，然后将反应在37℃下孵育约3分钟。然后将MePEG2-IEGR(在这种情况下为TFA盐)作为FXa的底物加入，然后使用荧光素酶、ATP和Mg

实施例5.1–详细的FVIII测定

试剂1(R1)：

用于测试或用于校准曲线的稀释的血浆样品。用含有50mM咪唑和100mM NaCl(pH7.4)的缓冲液稀释样品。

试剂2(R2)：

人因子IXa、人凝血酶、钙、作为纤维蛋白聚合抑制剂的Gly-Pro-Arg-Pro和合成磷脂(28％磷脂酰丝氨酸)。磷脂和钙在4–8℃下储存。其他组分在-80℃下储存。试剂混合物在含有50mM咪唑和100mM NaCl(pH 7.4)的缓冲液中制备。

试剂3(R3)：

人因子X、ATP、镁、因子Xa特定的发光底物(在本实施例中，使用MePEG2-IEGR)和Promega的重组荧光素酶Ultra-Glo。可将荧光素酶换成QuantiLum荧光素酶，两种类型都可使用。镁在4–8℃下储存。各个组分均储存在-80℃的水溶液中。试剂混合物在含有50mM咪唑和100mM NaCl(pH 7.4)的缓冲液中制备。

表5显示了用于FVIII测定的校准样品的制备。如表5所示，为绘制校准曲线，将以下稀释的血浆样品混合。在384孔测定板中，对10μL的测试体积使用3μL的稀释样品或校准样。未知样品的制备与100％样品相同。

表5

*缓冲液为50nM咪唑和100nM NaCl

表6和表7分别描述试剂2或3的制备。这些体积代表384孔板中的一个反应或一个样品，其中最终测试体积为10μL或30μL。表8描述了每个孔中的最终浓度。

表6

表7

表8

该测试使用化学发光读取器在37℃下进行。三种混合物分别分散于在37℃下孵育的384孔微孔板中。表9显示了仅一个孔的分配(division)。在测试过程中，将反应物混合，并在20分钟内动态测量相对光单位(RLU)强度。下面说明如何处理最终结果。

表9

基于化学发光的定量FVIII测定可进行校准以分析因子VIII。如表5所示，该测定法涵盖动态范围。至少有两种方法使用动力学数据绘制校准曲线。第一种选择是在观察到原始数据之后设置时间点。当各个校准样样品的曲线形成平稳状态时，可以考虑为非常合适的时间点。第二种选择是确定大约0.5到3分钟之间的斜率。两种方法的校准曲线均以对数-对数的形式绘制。

图中所示的校准曲线为在Flex3 Station(Molecular Devices，美国)上以10μL的最终测试体积获得。基于该图(原始数据)，使用上述两种选择来绘制最终的校准曲线。

这种定量分析的早期版本主要是以30μL和使用QuantiLum荧光素酶(Promega)进行的。后者是一个重要的说明，考虑到该荧光素酶在相同的环境中无法达到与用于10μL结构的Ultra-Glo荧光素酶相同的强度。因此，图1–3和图4–6不能一一比较。图4至图6展示了使用30μL测定结构获得的结果。使用31位接受FVIII替代治疗的血友病患者的临床样品对本测定进行了验证。22个样品包含重组PEG化FVIII产物，其中三个样品被分配低于1％的FVIII，且其中回收的FVIII低于1％。10个样品包含重组全长FVIII产物，其中一个样品被分配低于1％的FVIII，且被回收的FVIII低于1％。这些样品均通过金标准测试以及基于发光的FVIII测定进行了测量。用于验证的金标准测定为包含牛因子的显色FVIII测定。

实施例6–定量FIX测定

使用与实施例5中相同的策略，设计发光FIX测定法。该测定法设计与上述FVIII测定法相当，但更具体而言，通过提供过量的FXIa而不是FIXa使之对FIX敏化。FIX是一种可被FXIa切割产生FIXa的酶原。在Ca

实施例6.1–详细的FIX测定

试剂4(R4)：

用于测试或用于校准曲线的稀释的血浆样品。将样品在含有50mM咪唑和100mMNaCl缓冲剂(pH 7.4)的缓冲液中稀释。

试剂5(R5)：

重组人因子VIII、人因子XIa、人凝血酶、合成磷脂(28％)、钙和Gly-Pro-Arg-Pro作为纤维蛋白聚合抑制剂。各个成分在-80℃的水溶液中储存。试剂混合物在含有50mM咪唑和100mM NaCl缓冲液(pH 7.4)的缓冲液中制备。

试剂6(R6)：

人因子X、ATP、镁、因子Xa特定的发光底物(在本实施例中，使用MePEG2-IEGR)和Promega的重组荧光素酶Quantilum。可将荧光素酶换成Ultra-Glo荧光素酶，两种类型都可使用。镁在4–8℃下储存。各个组分均储存在-80℃的水溶液中。试剂混合物在含有50mM咪唑和100mM NaCl(pH 7.4)的缓冲液中制备。

如表6所示，为绘制校准曲线，将以下稀释的血浆样品混合。在384孔测定板中，对30μL的测试体积使用6μL的稀释样品或校准样。未知样品的制备与100％样品相同。

表6

*缓冲液为50nM咪唑和100nM NaCl

表7和表8示出了制备试剂的方法。这些体积代表384孔板中的1个样品或1个孔，其中最终测试体积为30μL。一个样品中的每种组分的最终浓度显示在表9中。

表7

表8

表9一个样品中的每种组分的最终浓度

该测试使用化学发光读取器在37℃下进行。四种混合物分别分散在37℃下孵育的384孔微孔板中。表10示出了仅一个孔的分配。在测试过程中，动态测量相对光单位(RLU)的强度。

表10

FIX发光测试可进行校准，以用于因子IX或治疗浓缩物的测定。涵盖建议动态范围的血浆校准样显示在表6中，且可用于绘制校准曲线。首先，对原始数据进行视觉评估，然后选择合适的时间点使形成校准曲线。校准曲线以对数-对数的形式绘制。

图中所示的校准曲线是在Flex3 Station(Molecular Devices，美国)上获得的。根据该图(原始数据)，使用上述两种选择来绘制最终的校准曲线。

实施例7–FXa产生测定

该底物还用于整体止血测定中，其中FXa是在贫血小板血浆中通过组织因子、磷脂和钙引发的凝血过程中FX的活化而产生的。FXa产生测定通过向血浆中添加组织因子和钙来引发，从而导致产生FXa，之后产生凝血酶和随后形成凝块。FXa的产生及其随后受到生理抑制剂的抑制作用会导致钟形曲线(图7)。使用不同剂量的组织因子：7pM或0.28pM。在这样的整体设计中测量FXa浓度可得到有关因子Xa水平的凝血级联反应能力的信息。

序列表

<110> 恩泽尔私人有限公司

<120> 用于因子Xa的新型化学发光底物

<130> CP1210298P/CB

<150> EP18201051.2

<151> 2018-10-17

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FXa的识别序列

<400> 1

Ile Glu Gly Arg

1

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FXa的识别序列

<400> 2

Ile Asp Gly Arg

1

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FXa的识别序列

<400> 3

Ile Glu Gly Lys

1

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FXa的识别序列

<400> 4

Ile Asp Gly Lys

1