牛AANAT和ASMT基因的SNP标记及应用
文献发布时间:2023-06-19 13:30:50
技术领域
本发明涉及牛遗传标记筛选技术领域,具体涉及牛褪黑素合成酶AANAT、ASMT基因中与血清及乳中褪黑素性状相关的SNP标记及应用。
背景技术
褪黑素(Melatonin,MT),化学式为N-乙酰-5-甲氧基色胺,具有抗应激、抗炎症、提高机体免疫力、改善睡眠质量、调节情绪、繁殖等功能。在体内的分布具有昼夜、季节节律,在生物体中的含量水平随每天的时间变化而变化。褪黑素具有白天含量低,夜晚含量高的特点,其高峰值通常出现在午夜。褪黑素的合成前体是色氨酸,松果体细胞从血液中摄取色氨酸后,在羟化酶和脱羧酶的作用下生成血清素,然后在甲基化酶的作用下生成褪黑素。此过程需要羟基吲哚-O-甲基转移酶(ASMT)参与,松果体中AANAT水平和褪黑素水平基本保持一致并受到光照调控,后续研究表明,ASMT同样具有调节褪黑素周期性分泌的作用,因此认为AANAT和ASMT均对褪黑素合成起到限速作用。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)指的是由单个核苷酸——A、T、C或者G的改变而引起的DNA序列的多态性,包括碱基的插入、缺失、转化和变换等。SNP位点分布是均匀的,在非编码区比在编码区更常见,SNP造成包括人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。
近年来,健康食品的发展趋势导致了奶制品的竞争加剧。为了满足消费者的需求,功能性牛奶已开发出含有更高生物活性化合物的产品。褪黑素牛奶作为一种天然褪黑素补充来源,在国外市场已经发售,具有很大的市场前景,深受消费者欢迎。牛本身体内褪黑素水平具有个体差异性,褪黑素合成酶基因AANAT、ASMT调控的合成酶影响牛褪黑素合成。本发明通过对牛AANAT、ASMT基因测序,对其发现的SNP位点与牛血清及乳中褪黑素做性状关联性分析,找到与牛褪黑素水平相关的SNP,为早期鉴定高褪黑素牛的分子标记辅助选择提供一种方案,为褪黑素功能乳开发的高褪黑素牛群选择奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供牛褪黑素合成酶AANAT、ASMT基因中与血清及乳中褪黑素性状相关的SNP标记及应用。
第一方面,本发明提供与褪黑素性状相关的SNP标记,所述SNP标记的序列如SEQID NO.1所示;所述SEQ ID NO.1所示的序列自5’端起第926位、第1710位、第1727位、第1754位、第1761位、第1816位、第1818位和/或第1820位碱基存在多态性。
作为本发明的实施方案,所述第926位碱基是C或T,第1710位碱基是T或C,第1727位碱基是T或C,第1754位碱基是C或T,第1761位碱基是T或C,第1816位碱基是A或G,第1818位碱基为G或A,和/或第1820位碱基为A或G。
作为本发明的实施方案,所述SNP标记位于牛褪黑素合成酶AANAT基因的部分编码区,其中所述第926位、第1710位、第1754位、第1761位和/或第1818位碱基的多态性与牛血清褪黑素相关,所述第1727位、第1816位和/或第1820位碱基的多态性与牛乳褪黑素相关。
作为本发明的实施方案,与牛血清褪黑素相关的5个SNP位点优势基因型分别为CC、CT、CC、TT和GG。
作为本发明的实施方案,与牛乳褪黑素相关的3个SNP位点优势基因型分别为TT、AA和AA。
第二方面,本发明提供与褪黑素性状相关的SNP标记,所述SNP标记的序列如SEQID NO.2所示;所述SEQ ID NO.2所示的序列自5’端起第1714位、第3942位、第10121位、第10383位、第10417位、第13734位、第19616位、第22438位和/或第23667位碱基存在多态性。
作为本发明的实施方案,所述第1714位碱基是T或C,第3942位碱基是T或C,第10121位碱基是T或C,第10383位碱基是G或A,第10417位碱基是G或A,第13734位碱基是T或C,第19616位碱基为C或T,第22438位碱基为T或C,和/或第23667位碱基为G或A。
作为本发明的实施方案,所述SNP标记位于牛褪黑素合成酶ASMT基因的非编码区,其中所述第1714位、第3942位、第19616位和/或第22438位碱基的多态性与牛血清褪黑素相关,所述第10121位、第13734位、第10383位、第10417位和/或第23667位碱基的多态性与牛乳褪黑素相关。
作为本发明的实施方案,与牛血清褪黑素相关的4个SNP位点优势基因型分别为TT、CC、GG和AG。
作为本发明的实施方案,与牛乳褪黑素相关的5个SNP位点优势基因型分别为CC、AA、AA、TT和GG。
第三方面,本发明提供用于检测所述SNP标记的试剂盒,所述试剂盒包括引物对。
优选地,所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-34所示。
第四方面,本发明提供所述SNP标记或所述试剂盒在奶牛选育中的用途。
优选地,所述用途包括选育与褪黑素性状相关的奶牛,更优选地,所述用途为选育产褪黑素乳的奶牛。
本发明通过对荷斯坦奶牛褪黑素合成酶AANAT、ASMT基因进行Sanger测序,根据NCBI数据库公布的牛AANAT基因序列(登录号Gene ID:NC_037346.1)和牛ASMT基因序列(登录号Gene ID:NC_037328.1)设计引物对,通过检测发现牛褪黑素合成酶AANAT、ASMT基因中与血清及乳中褪黑素性状相关的SNP标记。
本发明的优点在于:
本发明为天然高褪黑素牛早期高褪黑素性状的标记辅助选育提供了一种新的分子育种标记,可作为选择辅助方案,筛选方法简单快速,为褪黑素功能乳研发的早期奶牛选育阶段奠定基础。
附图说明
图1为不同基因型碱基信号图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明,但不能用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的试剂和材料均为市售商品。
实施例:
1.牛基因组DNA提取
血液样品未加抗凝剂,解冻后取血块和组织液的混合物先消化预处理,使用动物/血液DNA提取试剂盒(通用型),具体步骤如下:
1.1将Spin Column置于Collection Tube中,加入250μl Buffer BL,12,000×g离心1min,活化硅胶膜。
1.2样品消化:取20μl Proteinase K至1.5ml离心管底部,然后加入200μl高纯水稀释后的组织碎片,涡旋振荡10s;再加入200μl Buffer gA1,旋涡振荡10s,56℃孵育1~3h或过夜,期间震荡3~5次。
1.3孵育结束后加入200μl无水乙醇,涡旋振荡混匀。
V无水乙醇≈(V样品+V Buffer gA1)/2
1.4将步骤3所得溶液全部转入Spin Column中,12,000×g离心1min,弃废液。
1.5向Spin Column中加入500μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000×g离心30s,弃废液。
1.6重复步骤1.5一次。
1.7向Spin Column中加入500μl Wash Buffer(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000×g离心30s,弃废液。
1.8将Spin Column放回Collection Tube中,12,000×g离心2min,开盖晾干1min。
1.9取出Spin Column,放入一个干净的1.5ml离心管中,在吸附膜的中央处加50~100μl TE Buffer(65℃预热5min洗脱效果更佳),20~25℃放置2min,12,000×g离心2min。如果需要较多量DNA,可将得到的溶液重新加入Spin Column中,离心2min。
注意:洗脱体积越大,洗脱得率越高。若需得到较高浓度的DNA,可以适当减少洗脱体积,但最小体积应不少于50μl,体积过小会降低DNA洗脱得率,降低产量。
2.引物设计原则
2.1外围引物设计原则
引物长度在15bp-30bp,其有效长度一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度,从而降低产物的特异性。GC含量应在40%-60%之间,最适Tm值在58℃-60℃。引物自身不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠。
3.引物设计合成
AANAT、ASMT基因序列设计SNP位点引物名称以RS登录号/基因名称/位点所在位置命名,外围扩增引物合成PAGE引物。
AANAT基因引物序列如下:
ASMT基因引物序列如下:
4.PCR扩增
提取的DNA样品稀释至20ng/μl后作为PCR模板,以1.1×T3 Super PCR Mix进行扩增,每个位点进行单一扩增,每对引物均按以下扩增体系和程序进行扩增,扩增体系及各组分如表1所示:
表1.扩增体系及各组分
以上扩增体系按照表2扩增程序扩增:
表2.扩增程序
5.电泳检测
将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μl样品+6μl溴酚蓝),300V电压下12分钟,获取鉴定胶图,通过胶图确定目的条带大小。
条带符合且单一的送到测序部门进行Sanger测序。
6.SNP位点与性状关联性分析
采用R语言软件进行SNP位点与表型之间的关联性分析,所用模型如下:
Y
7.实验结果
7.1牛血清褪黑素与AANAT基因SNP关联性分析
7.1.1如表3所示,牛AANAT基因中的第926位、第1710位和第1818位碱基的SNP与血清褪黑素浓度有相关性(p<0.1);牛AANAT基因中的第1754位、第1761位碱基的SNP与血清褪黑素浓度具有显著相关性(p<0.05)。
表3.AANAT基因SNP与血清褪黑素相关性
7.1.2牛AANAT基因SNP位点基因型频率和等位基因频率如表4所示。从表4中可以得出,检测到与血清褪黑素有相关性的5个SNP位点均检测到3种基因型,这5个SNP位点优势基因型分别为CC、CT、CC、TT和GG,优势基因为C、C、C、T和G。(见图1)
表4.AANAT基因SNP位点基因型频率和等位基因频率
7.1.3牛AANAT基因5个SNP不同基因型与牛血清褪黑素浓度关联性分析,统计分析结果如表5所示。AANAT-926bp、AANAT-1761bp和AANAT-1818bp纯和突变牛血清褪黑素显著提高(p<0.05);AANAT-1754bp杂合和纯和突变牛血清褪黑素显著提高(p<0.05);AANAT-1710bp杂合和纯和突变牛血清褪黑素显著降低(p<0.05)。
表5.AANAT基因SNP与血清褪黑素浓度关联性分析
注:表中相同字母表示差异不显著,字母a、b表示差异显著,n为该种基因型的个体数量。
7.2牛生鲜乳褪黑素与AANAT基因SNP关联性分析
7.2.1如表6所示,牛AANAT基因中的第1816位和第1820位碱基的SNP与生鲜乳褪黑素浓度有相关性(p<0.1);牛AANAT基因中的第1727位碱基的SNP与生鲜乳褪黑素浓度具有显著相关性(p<0.05)。
表6.AANAT基因SNP与生鲜乳褪黑素相关性
7.2.2牛AANAT基因SNP位点基因型频率和等位基因频率如表7所示。从表7中可以得出,检测到与生鲜乳褪黑素有相关性的3个SNP位点均检测到3种基因型,这3个SNP位点优势基因型分别为TT、AA和AA,优势基因为T、A和A。(见图1)
表7.AANAT基因SNP位点基因型频率和等位基因频率
7.2.3牛AANAT基因3个SNP不同基因型与牛生鲜乳褪黑素浓度关联性分析,统计分析结果如表8所示。AANAT-1727bp和AANAT-1820bp纯和突变牛生鲜乳褪黑素显著提高(p<0.05)。
表8.AANAT基因SNP与生鲜乳褪黑素浓度关联性分析
注:表中相同字母表示差异不显著,字母a、b表示差异显著,n为该种基因型的个体数量。
7.3牛血清褪黑素与ASMT基因SNP关联性分析
7.3.1如表9所示,牛ASMT基因中的第1714位、第3942位和第19616位碱基的SNP与血清褪黑素浓度有相关性(p<0.1);牛ASMT基因中的第22438位碱基的SNP与血清褪黑素浓度具有显著相关性(p<0.05)。
表9.ASMT基因SNP与血清褪黑素相关性
7.3.2牛ASMT基因SNP位点基因型频率和等位基因频率如表10所示。从表10中可以得出,检测到与血清褪黑素有相关性的4个SNP位点中有3个SNP检测到3种基因型,1个SNP检测到2种基因型。这4个SNP位点优势基因型分别为TT、CC、GG和AG,优势基因为T、C、G和G。(见图1)
表10.AANAT基因SNP位点基因型频率和等位基因频率
7.3.3牛ASMT基因4个SNP不同基因型与牛血清褪黑素浓度关联性分析,统计分析结果如表11所示。ASMT-22438bp纯和基因型牛血清褪黑素显著提高(p<0.05)。
表11.ASMT基因SNP与血清褪黑素浓度关联性分析
注:表中相同字母表示差异不显著,字母a、b表示差异显著,n为该种基因型的个体数量。
7.4牛生鲜乳褪黑素与ASMT基因SNP关联性分析
7.4.1如表12所示,牛ASMT基因中的第10121位和第13734位碱基的SNP与生鲜乳褪黑素浓度有相关性(p<0.1);牛ASMT基因中的第10383位、第10417位和第23667位碱基的SNP与生鲜乳褪黑素浓度具有显著相关性(p<0.05)。
表12.ASMT基因SNP与生鲜乳褪黑素相关性
7.4.2牛ASMT基因SNP位点基因型频率和等位基因频率如表13所示。从表13中可以得出,检测到与生鲜乳褪黑素有相关性的5个SNP位点均检测到3种基因型,这5个SNP位点优势基因型分别为CC、AA、AA、TT和GG,优势基因为C、A、A、T和G。(见图1)
表13.ASMT基因SNP位点基因型频率和等位基因频率
7.4.3牛ASMT基因5个SNP不同基因型与生鲜乳褪黑素浓度关联性分析,统计分析结果如表14所示。ASMT-10383bp和ASMT-10417bpGG基因型生鲜乳褪黑素浓度显著高于AA基因型(p<0.05),ASMT-13734bp、ASMT-23667bp纯和突变生鲜乳褪黑素浓度显著提高(p<0.05)。
表14.ASMT基因SNP与生鲜乳褪黑素浓度关联性分析
注:表中相同字母表示差异不显著,字母a、b表示差异显著,n为该种基因型的个体数量。
结论:
综合上述实验结果,在本实施例的实验群体中褪黑素合成酶AANAT上具有与牛血褪黑素含量相关的SNP位点5个,其优势基因型分别为CC、CT、CC、TT和GG;与牛乳褪黑素含量相关的SNP位点3个,其优势基因型分别为TT、AA和AA。褪黑素合成酶ASMT上具有与牛血褪黑素含量相关的SNP位点,其优势基因型分别为TT、CC、GG和AG;与牛乳褪黑素相关的5个SNP位点,其优势基因型分别为CC、AA、AA、TT和GG。本发明的褪黑素合成酶SNP位点可以作为牛褪黑素性状的潜在遗传标记,以用于高褪黑素奶牛的标记辅助选择。
以上所述,仅是对本发明的一般性说明及具体实施方案的描述而已,并非是对本发明作其它形式的限制。任何熟悉本领域的技术人员均可以基于本申请公开的技术内容加以更改或变型为其等同实施例。在不背离本发明的构思和精神的前提下,对本发明进行的任何修改或变型均属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 牛AANAT和ASMT基因的SNP标记及应用
<130> CP11377ND
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1842
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacattaga gctcctgcaa cacaggagtc ctggtaagtg gaaccctgga ccctgggctc 60
ctagaatttg agagcaggag tcccctgccc agggcttggg gacgggggag agaaggaggc 120
agagggcggg aaggggaatg tgcggctcac aggctttgta agggatggac ggccgcccct 180
aagaactgca caccaacagg acatcagcga gtgagaaagg ggcccaggga gccagagcag 240
gcacagggca ggaggaatcg atgctctagc ccctagactc cccgctccag gtcccctaca 300
agagaggcaa gaggcgccat cgccctggac ggccccctgg gagatgagga ccagccccct 360
gaccatcgcc cctctccagc aggtgtggag ggaccctcct tgtcacacag gccctttctg 420
aagttgggga ccccttgggt ggcagccgca cccaggatgt ccacgccgag catccactgc 480
ctgaaaccct cgcctctgca cctgccgtct gggatcccag ggtccccagg ccgccagcgg 540
cgccacacac tccccgccaa cgagttccgc tgcctcaccc cagaggacgc tgccggcgtg 600
tttgagattg agcgagaggg tgagcagctc cctggccccc cagggtcaag gattctgggg 660
aactctgctg ctgttgccct tgggggaaga ccttggagtc ctctgtcctt ggcagatggg 720
cccccagagt gtctgatggt atgttttgtg tgtgtacagg agcacactca tgtttcagga 780
gagtgggggg aagagcagcc ctgaatccca tgctttccca ggggaggcct ggggacccgg 840
ggagcccacc cagcatccac acagatgctc agtggactgg gggtcaccca ctcgtgcttc 900
ctgacacagc cttcatctct gtctccggca actgccccct gaatctggac gaggtccggc 960
acttcctgac cctgtgtccc gagctgtccc tgggctggtt cgtggagggc cgcctcgtgg 1020
ccttcatcat tggctccctg tgggacgagg agagacttac tcaggtgagg atggaggtga 1080
cctgcccagt cccgggaagg cctcaggaaa ggaggccacc acctcccgtg gaggcagaat 1140
gtgggggagg agcgggagcc tgggatccaa cacaggagct cacggtgagt cctctcccgg 1200
caagagagcc cagtcctctg gggctcaagg ctctgatgaa ggggaccaca gaggggcggg 1260
gtcatagctc ctaacctggg tagaaggggg ctgactgggg actcacgggg cagctgctct 1320
tggcccagcg ggggtggttt tggggtgcac agaggcgacc ctgactcgtg tccgcctctc 1380
gccccaggag tcgctgacac tgcacaggcc cgggggccgc acggcccacc tgcatgcgct 1440
ggccgtgcac cacagcttcc ggcagcaggg caagggctcc gtgctgctgt ggcgctacct 1500
gcagcacgcg ggcggccagc cggccgtgcg ccgggccgtg ctcatgtgcg aggacgcgct 1560
ggtgcccttc taccagaggt tcggcttcca tcccgcgggc ccgtgtgccg tcgtcgtggg 1620
ctcactgacc ttcacggaga tgcactgctc cctgcggggc cacgccgccc tgcgccggaa 1680
cagtgaccgc tgaccccctg gggagcccat ggtcgggagc tcctactcaa tccccggccg 1740
tccccttctc tgccctgcca tcccccctgc tctgcttggt ctgaagggag acggtgattc 1800
ccaggggatt gtggaatgga gagaatgggt gaaataaaga ga 1842
<210> 2
<211> 25769
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcgtccag cttacagggt cagtagtgac atgctggcca tctgcccagg ttgctcatag 60
actggtgaag cccaaagcta agatagccgg ggtccctcca agccagaccg gcccagaagg 120
aagatgtgct cccaggaggg tgagggctac agtctcctga aggaatacgc caacggcttc 180
atggtctccc aggtaggaag aggctccacc ggctgaggtt ctgttgccgg aggtgaggag 240
gacaacaggc actcagtgct gagcgaggac gcggtctcct ccggggggcg cgagggtgcg 300
ctgggactct gggcgagtcc acgggcagaa gcttggccat cggggcctgg gggcccttct 360
agggatgtgt tggccctcac ggagtgggcg tctcagaacg acagttgtag gggcttccct 420
ggtagctcat ttggtaaaga tctgcctgca acgcaggagg tccaggttcc acacctgggt 480
cgggaagacc ccccggagga ggaaatggca acccgctcca ggattcttgc ctggagaatc 540
ctgtgggcag agaggcctgg ggggctacag cccatggggt caaaaatgag tcagacatga 600
cttactaacc cttttttcac tgtgttagtg aaacaggagt gcatacaatc ttattagaat 660
aaaacttaat ataaaccgag tattaagaaa taacatctca atagaaaaaa ggtgaatccg 720
gcgttgagga taaaactgaa taggacctca gcagaacaaa cagacttaat aaaatcgtgg 780
gtgggttggg aggctgggat tgagacatat acacacactg ttgatcgtgt gtataaaaca 840
ggacggatga gaacctgctg tacagctcag gaactctact cagacttctg tgctgacctg 900
ctgctgctaa gtcgcttcag tcgtgtccga ctctgtgcga ccccacagac ggcagcccat 960
caggctcccc cgtccctggg attctccagg caagaacact ggagtggggt gccatcgcct 1020
tctccactgt gctgacctac atgggaagga aattccaaaa taagagggga tatatgtata 1080
aacgatggct gattcccttt gctgcccagc agagactaat acaacattgt aaagctactg 1140
ctgtaaaatt aactttaaat atttcaatag aacgagagtg aatccagtgt taagagaata 1200
aatgtaaata caacctgagt ggaatgggag actgagtaaa actcagtaga aggacgtccc 1260
tgagggctca gtgactaaga ctcttgagtt cccaacgcag gggccccggg ttcgaccccc 1320
ggtcagggag ctagacccca cgtgccacga ctaagacctg gtggagacta agaaatataa 1380
gtaaaaataa tttaaaaaac tcaatagaat aaaatatgaa tacgacctta gtaggatggg 1440
ttcaaaacat ctcagacaag agggattgca actttactat aattagagtt aatacaacct 1500
cagtagaaag cgaacgctat attaattgga taaaacttaa tgcaacctca ggaggaaatt 1560
gataaaacct cgatagaacg agagcgcacc caactttcag agaataaaac gtcctccagc 1620
cttacagaat gagagtcaat accccgttaa cagaacaaga gctgaaacca tcttaataga 1680
atgtgactga agacaacctg cgtacgagga gagttaatga aatatgaatg gaaaaaaacc 1740
tgagtgcaac ctcgatggag tgagcgttta taatatctca atagaataag actgcaccca 1800
acgttaaggc aagaaaatgt actacgacca cttggaatag gagttcatga aatgttttta 1860
catagagagt gaacgagacc cgagcacagc gcttatacaa tcactgcagg gtaagtgtca 1920
gtcacttagt cgtgtccgac tctgcaaccc catggactgc agcccgccag gctcctctgc 1980
ccatgggatt ctccaggcaa gaatgctgga gtgagttgcc attttctcct ccaggggatc 2040
ttcccgaccc agggatcaaa ctcgggtctc cggcattgtc aggcagactc tttcctgtct 2100
gagccaccag ggaaacccca gatgcgcttg tctgctgaaa cccaggaata gggagtgaat 2160
aaaacctgaa tataggcgct ggtataatca tagcagggta agagatcatg ccaacttcac 2220
tgaacaagaa tcaacacaac tttaacaggg tgagaactga ttccgcgtta atagaatacg 2280
gctgaatacg accttcgtac aaggagagtc aataaaatcc taatagaaaa aaatctgaat 2340
gcactcttaa tggactgttc atgacatctc aatagaacaa gagtcattac aacttaatat 2400
aattagagtt aatattgagc tcactgcaag agctgatacc atcttaagag gataaagctt 2460
aatacaatct taatatagta ggacttggag cgacctatta aggataacaa ctaataaaac 2520
cttaagaaga gtagatacaa tctttacaga ataagagtta ataccgtctt aacagaacag 2580
gaatggatat ggccatttta atgtaaacat ttaattttat actggggtat agccaatgaa 2640
ccggagaagg caatggcacc ccactccagt gttcttgcct ggagaatccc agggacaggg 2700
gagcctggta ggctaccgtc tatggggtca cacagagtca gacacgactg aagtgactta 2760
gcatagcata gtcaatgaac aatgctgtga tggtttctgg tggacagcaa agggactcag 2820
ccagacatgt acatgtatcc attctccccc agctcccctc ccacccaggc tgccacacga 2880
cactgagcag aactccctgt gctgtccagc aggtccttgc tggttctcca tgttaaatac 2940
agcagtgtgt ccatgtccat cccagactcc ctgaccatcc tttctgccac caaccataag 3000
ttcattttct aagtctgtga gtctttctat tctgtaagtt gggttgtgtc atttctttac 3060
agatcccaca tgtaagggat gtcggatgat attttccctt ctctgtctga ctcaccctcc 3120
tgaagagtgt gagtcctcgg agaactaaag ctgactctgt cttcattgcc ccgaggttct 3180
ctttgctgcc tgtgagctgg gggtgtttga gctcctggca gaggccctgg agcccctgga 3240
ctcagcagca gtgtcttcac atctgggctc cagcccccag gggacagagc tgctactgaa 3300
cacctgtgtg tccctgaagc tgctgcaagc cgatgtgagg ggaggaaaag gtaagcaccc 3360
tggctgtttg gaagaaggcg ttttaaaggt gcactctcag cacagttttc tgttttattt 3420
ttctggaaag agccacagag taagtcttct cagcctggaa ggccggccac gaggtctctg 3480
cagatgacac tcatctctgc ctttggagca tcagagctgc tggagacaga cagatgggcg 3540
gggctgatcc taataaaact ttattggcca gacaggtggt ggaacaaaga tccaataaag 3600
gtttattgac taaacaggtg ttggaacagg gttccaataa agctttattg atcaaacagg 3660
tggtggaaca gggttccagt aaagctttat gggccaggca gggggtagaa catggtacca 3720
ataaagcttt attagccaga caggtggtgg aacaaggttc caataaagct ttattgacca 3780
aacagatgct ggaacaaggt tccaataaag ctttattgtc aacacaggtg gtggaacagg 3840
gtgacaataa agctttattg tcaacacagg tggtggaaca gggttccagt aaagctttat 3900
agaacagaca ggcggtgaaa cagagttaca ataaagctct ttagcagaac aggttgacgg 3960
aacaaggttc caataaagct ttattggcaa aaacagatgg ccaaaaccgg gtaccaaatt 4020
cgggttgtca tttgctgact gtggatcagg aagtttccag aggctggtgt ttgcactgaa 4080
accctgatga aatatccaag caacgagaca gaaatgtgac cgaaaagtta cacgggagta 4140
atttttccat catgctcaac tgcttctttt caagggttgc cctttgtgtt aagatcatat 4200
tcttgttttg gtattgaagc tgctttcctc ttacagaaga tggtccttgc cagtttttac 4260
ttttaatgcc ccttctttgc aaaattaaaa attgtaagcc ctatatcagt cacttagatt 4320
tttttttttt tagaatcttg agaatctgtg aaattgcaaa gtgtagggac cactgcctgg 4380
cagaataggg gtgggtggga gggcagtggt agaggtgggt gatgggcttt ctccttgaag 4440
caaggacttg cgtccccgtt ggatttatgg ggtgcaaaca gagaaagtga gttaacttga 4500
acaggaggac gttgtttggg ggttgacggt actcagatgg ctgtgggctt gggaatcaag 4560
cagtcacacc ctgtgagtaa gctttgcagc cccctccctt tcccccactg gcacccccag 4620
cgcgggctgc ggtccagcca ggacacacct gcggaggatg gcggacgttc aaggggaagc 4680
tcctgggggc gggaggagcc tgctgtacct gcagaccctc gggtaggcac atcaggatgt 4740
gggctaacct gccgggctgg agacgctggg atgctcggct cagagaccag gttacaggac 4800
ctccggctgc aacgctgttg ccctggggac cccttggagc cccgcaagca ttcggcaggt 4860
acagattggg cagaaacagt gagcgcattc agtgcagtcc agtcgctccg tcgtgtccca 4920
ctctttgcga ccccatagac agcagcacgc caggcttccc tgtcctcctc catctagaat 4980
ttgctccaac tcatgtccat cgagtccgtg atgccatcca accatctcac cctctgtcgt 5040
ccccttctcc tcccaccctt aatctttccc agcatcaggg tcttttccaa ggagtcagtt 5100
ctttgcagca ggtaaggcca aaggattgga gccccacgga catgtatcac gtgtcgtcta 5160
cggggtcgca aagagtcgga ggcgactgag ggattgagca acactggggc tcgctggccc 5220
tttccgtttg ctacatcgga tctttccgtg ggatttacga gggctgaaag cggcaggcag 5280
gacacgcagc ccctgcacca caggccagcc ggtccttcgg gacgagggtc cagctgtcgg 5340
ggtgccgacc gtcccaggca agaatcacgt ctgcagtcag gaagttgcca gcataactgt 5400
tggcatcttg gcgatgcctg ggtgtctaac tttattcccc cgccccttct gtttgttttc 5460
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ccagcgggac atgctgctgt acgcgggcag gaccgcttac gtctgctggc gccacctggc 5580
ggaggcagtc aggtgcgtgt cagccgcgcc cgcgagtccc cagggccgcc tgcgggctgg 5640
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ccggatctag gtttcttagc gcgcgggtct ccaaactccc ggatctaatg cctgatggtg 5760
tgaggtggag ctgatggagt aataatagaa atacagggaa gagtcactgc aaggactgat 5820
gctgaagctc caacactttg gccatttgat gtgaaaaact gacccactgg caaagaccgt 5880
gatgctgggc aggactgaag gcgggaggag aagggggcga cagaggatga gctggttgga 5940
tggcatcacc gactccatgg acatgggttt gagcaagctc cgggagttgg tgatggagag 6000
ggaggcctgg cgtgctgcag tccgtggggt cgcaaagagt cggacacgac tgagcgactg 6060
gactgaacgg aactgcaaag tggaaagcga ttcctgagta gtcttgggtt actcgtttcc 6120
cgcagaggcc gtctgtggtg ccagggtaag gtctgtgaat gcaaggccgt atgaacggag 6180
tgcagtgacg tctcggggcc tgagtgacgg tctcctcctc gttttcaggg aagggaggaa 6240
ccagtatctg aaagccttcg ggatcccgtc cgaggagctc ttctctgcca tctacaggtg 6300
acgccgccca cccactccca tagcgtcctg cttgagagtt acatttgtgt atttctcatt 6360
gaaggataat ccctttgcag aattgtgtgg gtttctgcca cacatccgca tgcatcagcc 6420
atcggttggc ctgcgtcccc tccctcttga acctccctcc cacctccctc ccacctccct 6480
cccacctccc acccctctag gttgtcccag agccccggtt tgagctccct gagtcatccc 6540
gcagattccc atgggctatc tgcatcgcac atggtgatgt acgtctctcc gtacctccca 6600
ccttctcctt ctccctacct ccccgggtct gtaagtctgg tatgtctgca tctccactga 6660
tgccctgcaa atgcattcac gagtaccgtc tttctagatt ccatatgtat gtctcagtat 6720
acgatatttg tttttctgac ttgcttccct ctgtgtaaca ggctccaggt tcctccacct 6780
cattagaact gactcaaagg cgttcctttt tgtggcggag taatattcca tcgtatacat 6840
gtaccacaga gtctttattc atttgtctgt cgatgggcat ctaggttgct tgaaatgtga 6900
cagcagtcgt gttgatttac aatgttccat taatttccgc tctacagtga agggattcgg 6960
ttatgcaaat atacacgatt tcattttgta acaactgagt aatatcccac cctatatatg 7020
caccacatct tctttctcca ttcctctgtt gatggacatt gaggttgctt ccatgtcttt 7080
gctgttgaga atagtgttgt gatgaatcct gggggggtgc gtgtcttttc taattatggt 7140
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gtttttaaag aacattcaat accattttcc ataatacctg gacaagtaca cattcccacc 7260
aaaactgcag agggctcctt tttctccacg agctctccaa cacttaatgt ttgcagagtt 7320
tttgataatg gcagttctga ccggtgcgag atgatttacc tgttgtaggt ttgatttgcg 7380
tttccctaat actcagaacc ccactccagt cctcttgcct ggaaaaccgc atggatggag 7440
gagcctggta ggctgcagtc catggggttg ctaagagtca gacgtgactg agcgacttca 7500
ctttcacttt tcactttcat gcactggaga aggaaatggc aacccactcc agtgttcttg 7560
ccaggacaat cccagggacg ggggagcctg gtgggctgcc gtctatgggg tcacacagag 7620
ttggacacga ctgaagcgac ttagcagcag cagcagagtt gagtttccac ctggtggttt 7680
tttttttttt ttttttcagg tattccagag tttgattcag ttatacatag aggtttattc 7740
ttttttaggt ttttgttttt ctcacagagg tagttacatc atgctcagtg acttccgtgt 7800
gcaattcagc acagactttt ggatcatcaa ttctgtatat atgagtgtgt acatgttcat 7860
tcctaaccct tcatttgtca ctttcatata acattttttt tttttttggt agtcataagt 7920
tcctttgagc ttccctggta gctcagctgg taaagaatcc tcctgcaatg ttggagaccc 7980
cggttcgatt cctgggttgg gaagattccc ctggagaacg gataggctac ccactccagg 8040
attcttgggc ttccctggtg gctcagctgg taaagaatcc acctgcaatg ctgggagacc 8100
tgggtttgat ccctgggtca ggaagatccc ctggagaagg gaaaggccac tcactctagt 8160
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tttctctgac ttccgtcact tggtaccgga gtcactcggt ccatccaggc tgctggcagc 8400
ggccttattc cgttctgctc tgcgggtgag ccgtattctt gcacagagag atctgccttt 8460
gttttcctgt caggggacgt ttcggtggat tcggtgtctt ggccaatgtg cattgtgctg 8520
ccctgaaaac aggaaggcgt gtgttatttt gaaacatgac tttttttctg gatctgagcc 8580
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tttgatcttt ggcatatata tatatatata tttttttttt tttccttctt gggttgtctg 8940
tgtttgtcat attgaaatgc atgagctcct cataagtttt ggagttgaat ttcttgtgag 9000
tgtcttcatt tgcaaatact tttttttttt tgcagtctga acactatctg tttctttcgt 9060
tcagggcttt ctttgttgaa caaatgctct tcaggtagat gaggtcctgt tttctttttg 9120
ttgattattc attatactaa aatatatagt tcagctcagt cactcggtcg tgtccgactc 9180
tgtgacccca cgaactgcag cacaccaagc ctccctgtct atcaccaact cccggagtcc 9240
acccaaaccc atgtccatcc agtcggtgat gccatccagc catctcatcc tctgtcgtcc 9300
ccttctcctc ctgccccgaa tccctcccag catcagggtc ttttccaatg agtcaactct 9360
tcgcatcagg tggccaaagt actggagttt cagctttagc atcagtcctt ccaatgaaca 9420
ctcaggactg atctccttta ggatggactg gttggatctc cttgcagtcc aagggactct 9480
caagagtcta ggctcctctg tccatgggat ttcccaggca agtatactgg agtgggttgc 9540
caatcacttc tccaggggat ctttccatga cccagggatg gaacgcaggt cttctggggt 9600
cttcctgacc ccgggattga gccttgtggg tctccgcacc gcaggcggat cctctaccct 9660
ctgagccgcc ggggaagccc gtgtgttacg gtagagcacg gctgctttcc cgcattgcgt 9720
tagtttcagg ggtgcgggaa cttgattcat ttatacacag acatccgtcc attctgtctc 9780
aggctctctt tcccgtctag gtaattagcg tctgttcagt agagttccct gtggtgttca 9840
gcaggtgttt ttgatcatca catcatatat gggaactgga atatgtccat tccaaactct 9900
gaaataaccc catccccatt acagcttgtg tgtgtgtgtg tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg 9960
tgtgtgacat ttataggtaa tttctctcag tttcagagtc tgtctctgtt gtgtaattag 10020
ttcgtccgct tgaatatcta caatccaggt gtaggaggca tctcaggacc tttgtctccc 10080
cgtctctgac ttccttccct ccccgtgtgt gacggccact tggtcggggc atgctgctct 10140
ccgtggcctt attctgtcct ctgtgtggct gagttgtgct ccaggggaga ggtgggcccc 10200
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caatcacgcc gtcctgaaga caggggtgcg tgtgtcattt cgcatcgtga tgtttctctg 10320
gatctaagcc cacaggtggg actgctgggt cgtacgtttt ctggagggtt agtgttctaa 10380
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ggaggatttc ctttttttct ccgccctttg ttagcacgtg ttcttggtag aatgtctcga 10500
tgatggtcgt gctgaccggt gtgaggagat ccctcattgt ctttgagtac cttctaataa 10560
ttagtgatgc tgagtgactt ttcgtgagtg gaatggccct ctgtatgcct tcttggaagg 10620
aatatgtatt tttatctttg gacccttttt atctctgatg ttttgtggtt ttgatatgag 10680
acgtgtgagc tgtttgtagc aattggaggt gaatttcttg tgtgtatctt ggttagaaaa 10740
aatttctttt ccattctgag agtctctttc tctatcgttt tcgatgtcgt cagttgtcaa 10800
aatgcattta aggtctgtgc ccacatgctc ttttcttatt tttggctcat tgttcatttt 10860
ctgtgtggtg gatccaaatg aacctcttca cgattgttca agagggttgt gaagtaaaag 10920
tcgctctgtc gggtctgact ctgcgacccc atggactgca gcacgccagg cctccgtgtc 10980
caccaccatc tcccagagct tgctcaaatt catgcccatg gagtcggtga tgccatccaa 11040
cggtctcatc ctctgtcgtc cccttctcct cctgccctca atttaatgac agcaagcgca 11100
gcttttatat gtgtcgttac aaagcccagc cacgaggtgg cagaatttct ccagaaactg 11160
ttttttttta accccttttt gtagtagaaa tgttagttta ctttggagaa cgcttcattc 11220
ctccgatatt gtatttgttt caagggtaca ggaacttgga tttccttata catagatgtt 11280
tatctcttct ttatttttcc accatatagg tggttagagt gtgttcagta gacgccgttt 11340
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cccctggagg agggcatggc agcccactcc agtgtccttg cctggggaat cccacggaca 11520
gaggagcctg atgggctaca gtccacgggg tcgcagagag tcggacacga ctgagccact 11580
cagcatgaac aaatgtgtgt gttatcagca aactctaaat ggatccatca tcactaactt 11640
ttctcgtttt tataagcgta agtttctttt ctctgttcca acgtctgttt ctattgggta 11700
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gctgtgatct cccgagtgta cctatgtttt ggaaaccctg gggcttctct ggctctgtgc 12000
ccatggtcgg ggtgagcgtg tcctaagatg cttctctgtt ttcttttctg aaggaccccc 12060
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caagatgggc aaggtgtatg gtgatacctc acgagacttt taagtggcct ctctctaata 12240
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atacccattt caatctatgt cccctttatt tcttgttttt tgtgtgtctg tgtgtgtgtc 12360
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caatggcacc ccactccagt actcttacct ggaaaatccc ctggacggag gagcctggta 12600
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cccagggacg ggggagcctg gtgggctgcc gtccatgggg tcggacagag tcggacacga 12780
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cccttttttt tttttccatg ggttggttgt gtttttgaca ttgaggtgta ggagctgttt 13320
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caattttaag gatttctctt tccttgagga tgtcctggct gtggaaatgc ttttaaggtt 13440
aattaggtcc tgttttcgtt ttgggtttag ttttcattct tctaagtgaa aatcactcag 13500
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ccctagactg ccccatgcta ctcaacagat ccattttcat catctgtgac atatatgttc 16080
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cgtccctgaa tccatcatgc ccagccccct cccccagcct gtgtggacaa cactcaccgg 17280
cctccagcct ccagcctccc gcattgcaca gctgatccgg ttgcctggcg ctccaccccg 17340
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atacctactg gactccacaa ggttctcatg ggctcatctc gtcgtgttcc aggtccgagg 17460
acgaaaggct gcagttcatg cagggtctgc aggacgtgtg gaggctggag ggggcgacgg 17520
tgctggccgc cttcgacctg tcccccttcc cgctcatctg cgacctgggg ggtgagtgtc 17580
cgccccggac cctggagctg cgtttggaac cctctttgta gaccctaggg cttccctggt 17640
gtctcagatg ctaaggaatc tgcctgcatt gcaggactcc tgggttcgat ccctgggtcg 17700
ggaagatccc ctggaggagg gcatggcaac ccactccagg attcttgcct ggagactccc 17760
atggacagag gagcctgggg ggctacggtc cacggggtca cacagagttg aacacagctg 17820
atgtgactta gcacaggcac acatattgag tagaattccc tgcgctgcac actagaaact 17880
tgtcaagtat cagagtgatt catagcagcg tgcccacgtc cgtcccagtc tcctcacgta 17940
tccctccgct cggtcccctt tggtgtgttt ctttcccgtg tctgagactc tgtttctgtt 18000
ttgcgcagaa gttcattagt atcacatttt aggttccacg aatgagtgac gtcacgtggt 18060
atttgtctct ctctctctga cgaacgtcac ttggtccgat cacctctagg tccgtccgca 18120
tcgtggcgat ggcatcgctg tgttcttttt cacggctgcg taatattcca ctgtgtatgt 18180
gtgcgacatc ttctccatcc ataggtctgt tgatggacct ttaggttgag gttattttat 18240
aaaagtggat tccttgactc tgagatgttc acactgctgg catctggagg gaggtctcca 18300
tgtctcaccc gggtgtcccc tggaaatgtc tcccacaggg agacatgggc acgtcttcct 18360
gtggcatctg cccaggggct tcctctgcct ggctgttgtc tgttcttggg cggacgaggg 18420
gaagccgtca ggtcagagtc tacatggaag gtggatgtgt gggttggtgc agccaggaag 18480
ttgccttaga tacagggctt tgtacgtgag cctgtcacca tggagaccag actgtgggta 18540
ccgcccaagt ctgggggctg tcacagccca cattctcttg caggcggttc tggggctctg 18600
gccaaggcgt gcgtgtccct gtacccggga tgtcgggcca ttgtgttcga catcccagga 18660
gtggtgcaga tcgccaagag acatttctca gcctcggagg acgagcgcat cagcttccat 18720
gaaggtgggt gtctggaaca ctgtctgtgt ccgcagggaa acacgtgggt cctggtgggc 18780
tggggagatg gagccagtgg gtgttcagca tggctttctg gaccatccaa atacaccccc 18840
ttaagatgga gcttccaggg ggctcagtgg taaagaatcc gcctgccagg gcagaatacg 18900
caagagatgc aggttcgatc cccgagtcgg gaagatcccc tggagacaga aatggcgacc 18960
cactccagta ttcttgcctg gggaatcccc atggacagag gagcctggcg gggctacagt 19020
ccatggggtc atgaaagagt cggacacgac tgagcacccg ggcatttaaa cctagaactg 19080
tgatgcagga tgggtgggaa atgtgggagg gtattgtttt cttgcagtta attctttcct 19140
gagtgttgta ctgagttcag tgtgtctcct cacccagagt ttgtaaacag gactttagga 19200
aataaggtgt ttgcagaggt gatggagtga agggtctgag atgaggatcc tcctggatgg 19260
gggtggccct aaaccccagt gacacggtcc ttataagaca gagaagagga gacacacgga 19320
cacagaggag aagccacgtg gagacggagg aagagatggg agggaggcgg ccaccagccg 19380
cctggagctg gatggacacc tggagccccc agaagctgga agaggcgggg aggaccctcc 19440
cctggagcct ctgcagggag ctcagccctg ggacacctga cctcagacgt ctggtctcca 19500
gggctgggag aggacagatg tcctggtctc tgggcacttc ttacggccgt cccgggaaac 19560
tcacgtaggt atttacaacc agctcgtgtg cgagtggcaa tgagcgacgt gggttgaagg 19620
caaggtgagg ggacagttat cgactgaaaa gacagaagct tctcagatgt cccaaggctc 19680
agaaaccaca gcagctttgc ggaccgctgc gagggacttg tggttgcctt ggaaatgggg 19740
ggcgcggttc ccagctgcgg gccgtcactt aggtaccgag gtctgagctg cagacaccgt 19800
gtacctccat gtgtagacac aactggctgt ttgtgactct ttttctctgc tgtgtcagga 19860
ggaacacagc aggtgggggt atcatttctg tccactctga gatctgccaa gaactcccta 19920
ttattatgat tattgttatt attttggcca ttggatgcag cttgtgggat cttagttccc 19980
tgacctggga ttgaacctat tttcttggta atgaaaccat ggagtcctaa acgctggaca 20040
gcaggggaat taattcctta ttttattttt ttaaaaagtt cacctccaag ttcagggcat 20100
ctcaagggac aggccgccag cattccatcc agggccgtat gcggggggac tctgactgac 20160
ccgggtgaag ggtcagctcc tttccaatga ctctgcgtcc gacaggcaga tttgaaggtg 20220
accagaatgt gccagactgt gttcttaaag gacgggatgc tgcctttatt taaaattctg 20280
aaatgtagac catcaggaag ttttcttttt ttggggggtg cggaacgggg ggctttatgc 20340
tggatttttt taaactgttg aattaaaata tactgaatct gagtgactga gtttggggag 20400
ccccctttga ttttgtgctc agaaggagga cctcggtgtg aagttaacca cctctagggc 20460
atcttcttgg aaatacacac gctgacggtg tcagttctgt gcctcacccg ggaaatgggg 20520
tgaagaagga gcctttgggg gacttccttg atggcccaag tggctaagac tctgagcttc 20580
caggacaggg ggctctggtt ccactcctgg tccaggagct gagttcctgc atgctggaag 20640
acccagtgca agaaagaaag aaaggggtgg gggaaggaag gctgagaaag acaaaagaga 20700
agaaagaaaa agagcagaag gaaaaagaaa gcaggaaaga cactacaggt cccattggtt 20760
tttaaaaaag aaaaagaagc aggctgtgga agctgggaaa accagatgga cgtgaaatga 20820
agtggttagt tgctcggtcg tgttcaactc tttgcaatgc acggactgta gctgccaggc 20880
tcctctgtcc atggggatgc tccagtcaag aatgctggag tgggttgcca ttcccttctc 20940
cagggggaat cttcccaacc cagggatcaa accctggtgt cctgcattgg caggggattc 21000
ttgaccatct gagccccctg ggaagcccag gagggttggg accgctgctt taagggtgct 21060
atttacacga gactttctga aatcaagtaa aaataaaacc gttcgcccag agctgacgcg 21120
gaaagggggc gtaaagggag tattgcatcg ttcagaatcg tctcatcgtc acacggagac 21180
gtcttctgtt tcgggaggtc agcagctggg ggcatctggg gccaggtctg tgtgtatgag 21240
tgacccggcc acacggggcg taggtgtcct cacttggaat tgaggcaggc tgacaagggg 21300
tcccctcgcc tgtgttgcag gggatttctt caaagacgcc ctcccggagg cggacctgta 21360
tatcctggcc agggtcctgc atgactggac cgatgccaag tgctcccacc tgctgcagag 21420
agtctatcgg gcctgcagga caggtaggtg gcggggacgc cgggcgccgg gcccgcgggt 21480
ccactcaggg cagagggacg ggtgtctcga cgcgacgagg gctcgcaaat cccgtcacgg 21540
ggacatagac gcgcctctgc gtgtgaggag gccggagttc cggccggcct ctggaggctg 21600
ccctcctttt cgagacacca ccacgtcacg ggctccctca tatcgtctct tcatcgccac 21660
actcttccat tccccccacc ctgaagttgc ggttctcaaa gtacagtgtc attttcagaa 21720
gtgaagtcgt ttctggaggg ttgtgtctag agcccttccg tgggggagct ctaggaagtg 21780
tgttgagcaa aagtgaatta tttatgtttc aatgcacact gacattactt gatggtgact 21840
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agaaacgaac gcaacattgt caagaagctg taggtccata aaaaattagt taaaagaaaa 22380
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gcccccttct cctcccgcct tcaatctttc ccagcatcag ggtcttttcc aatgagtcag 22740
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<400> 34
ttgatggtag ttcatgacg 19
- 牛AANAT和ASMT基因的SNP标记及应用
- 与抗精神疾病药相关的试剂盒、目标基因及其制备、SNP标记、SNP识别和应用