结合分子

引言

蛋白质和肽的药代动力学受吸收、生物分布、代谢和消除的参数控制。蛋白质和肽的最常见清除途径包括肝脏肝细胞对较大蛋白质的内吞作用和膜转运介导的清除，以及肾脏对较小蛋白质和肽的肾小球过滤。

许多具有可用于治疗和/或诊断目的的活性的药物价值有限，原因在于它们在施用时会迅速从体内清除。例如，许多具有治疗有用活性的多肽通过肾脏从循环中迅速清除。

因此，必须施用大剂量以达到所需的治疗效果。需要具有改进的药代动力学特性的改进的治疗剂和诊断剂。

因此，已采用不同的策略来改善较小蛋白质和肽的药代动力学，包括增加蛋白质或肽的大小和流体动力学半径、增加靶标蛋白质或肽的负电荷或通过结合至白蛋白增加肽或蛋白质的血清蛋白质结合水平。这包括生物活性蛋白或肽与人血清白蛋白(HSA)的融合、与人免疫球蛋白(Ig)G的恒定片段(Fc)结构域的融合或与非结构化多肽如XTEN(综述于Stroh“Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy toMake Biobetters BioDrugs”.2015；29(4):215–239)的融合。

不同的应用需要不同的半寿期，并且仍然需要提供定制的半寿期延长分子。本发明旨在解决这种需要。

发明概述

本发明涉及结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域抗体，特别是人免疫球蛋白单可变重链结构域抗体，例如，特别是从表达未重排人V、D、J基因区段的转基因小鼠获得或可获得的人免疫球蛋白单可变重链结构域抗体。

一方面，本发明涉及结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域抗体，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％或95％同源性的序列，SEQ IDNO:30或与SEQ ID NO:30具有至少80％、90％或95％同源性的序列，或SEQ ID NO:5或与SEQID NO:5具有至少80％、90％或95％同源性的序列。本发明还涉及结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域，其是SEQ ID NO:1的变体并且相比于SEQ ID NO:1具有1至20个氨基酸置换。本发明还涉及结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域，其是SEQ ID NO:5的变体并且相比于SEQID NO:5具有1至20个氨基酸置换。

在另一方面，本发明还涉及用于延长蛋白质半寿期的方法，包括将所述蛋白质连接至如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域。

本发明还涉及当所述免疫球蛋白单可变结构域抗体与融合蛋白中的所述治疗部分连接时，如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域延长治疗部分的半寿期的用途。

在另一方面，本发明涉及包含如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域抗体或如本文所述的蛋白质或构建体的药物组合物。

本发明还涉及编码如本文所述的氨基酸序列的核酸序列。

本发明进一步涉及包含如本文所述的核酸序列的载体。

本发明还涉及包含本文所述的核酸序列或本文所述的载体的宿主细胞。

本发明还涉及包含如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域抗体或如本文所述的蛋白质或构建体或如本文所述的药物组合物的试剂盒。

此外，本发明涉及用于产生仅具有重链的抗体或包含至少一个如本文所述的能够结合人HSA的人免疫球蛋白单结构域抗体的结合分子的方法，其中所述结构域是人V

a)用HSA抗原免疫转基因小鼠，其中所述小鼠表达包含人重链V基因的核酸构建体并且不能产生功能性内源轻链或重链，b)生成包含来自所述小鼠的V

c)从所述文库分离包含V

附图说明

在以下非限制性附图中进一步说明了本发明。

图1：在食蟹猴中以3mg/kg单次静脉内施用TPP-1246之后的血清水平。

详细说明

现在将进一步描述本发明的实施方案。在以下段落中，描述了不同的实施方案。如此定义的每个方面可以与任何其他一个或多个方面组合，除非明确地相反地指出。

通常，与本文所述的细胞和组织培养、病理学、肿瘤学、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交相关使用的术语以及技术是本领域众所周知和常用的。除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Green和Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)；Therapeutic MonoclonalAntibodies:From Bench to Clinic,Zhiqiang An(主编),Wiley,(2009)；和AntibodyEngineering,第二版,卷1和2,Ontermann和Dubel编,Springer-Verlag,Heidelberg(2010)。

根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如本领域通常完成的或如本文所述。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药物和药剂化学相关使用的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

本发明涉及与人血清白蛋白(HSA)结合的氨基酸序列和包含此类氨基酸序列的结合分子，例如蛋白质。特别地，本发明涉及单结构域抗体或免疫球蛋白单可变结构域，其具有如本文所述的氨基酸并且可用于治疗方法和用途以及如本文所述的药物制剂。

本文所述的单结构域抗体特异性结合至野生型人血清白蛋白(UniProt登记号Q56G89)。野生型人血清白蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:9中。

人血清白蛋白(HSA，2BXN)包含约60％的血浆蛋白。HSA由单链组成，长度为585个氨基酸，包含三个同源结构域(I、II和III)。结构域I由残基5-197组成，结构域II包括残基198-382，并且结构域III由残基383-569形成。每个结构域包含称为A和B的两个子结构域(IA；残基5-107，IIA；残基108-197，IIA；残基198-296，IIB；残基297-382，IIIA；残基383-494，IIIB；残基495-569)。

本发明的“结合”或“能够结合”目标抗原(例如，人血清白蛋白)的单结构域抗体(sdAb)、免疫球蛋白单可变结构域或蛋白质是一种以足够亲和力结合抗原的抗体，使得单结构域抗体可用作靶向表达如本文所述抗原人血清白蛋白的细胞或组织的治疗剂。

本文所述的单结构域抗体、免疫球蛋白单可变结构域或蛋白质与人血清白蛋白特异性结合。换言之，与人血清白蛋白抗原的结合明显不同于非特异性相互作用。如实施例所示，单结构域抗体不与小鼠人血清白蛋白交叉反应。优选地，单结构域抗体结合人血清白蛋白并且还结合猴血清白蛋白，如实施例中所示。

如本文所使用的，术语“抗体”广泛地指包含四个多肽链(两个重链(H)和两个轻链(L))的任何免疫球蛋白(Ig)分子或其抗原结合部分，或其任何功能片段、突变体、变体或衍生物(其保留了Ig分子的基本表位结合特征)。

在全长抗体中，每个重链包含重链可变区或结构域(本文缩写为HCVR)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域C

重链和轻链可变区能够进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布于称为构架区(FR)的更保守的区域。每个重链和轻链可变区含有三个CDR和四个FR，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

免疫球蛋白分子能够是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。术语“CDR”指抗体可变序列内的互补决定区。重链和轻链的每个可变区中都有三个CDR，针对每个可变区，分别称为CDR1、CDR2和CDR3。术语“CDR组”指出现在能够结合抗原的单可变区中的一组三个CDR。能够根据本领域已知的不同的系统对这些CDR的确切边界进行不同的定义。

Kabat互补决定区(CDR)基于序列可变性，是最常用的(Kabat等,(1971)Ann.NYAcad.Sci.190:382-391和Kabat等,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。Chothia指的是结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当提及可变结构域中的残基时(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)，通常使用Kabat编号系统。另一个系统是ImMunoGeneTics(IMGT)编号方案。IMGT编号方案描述于Lefranc等,Dev.Comp.Immunol.,29,185-203(2005)。

本文使用由Kabat描述的系统。术语“Kabat编号”，“Kabat定义”和“Kabat标记”在此可互换使用。这些术语在本领域中是公认的，是指对氨基酸残基进行编号的系统，该氨基酸残基比抗体或抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即，高变)。

术语“抗原结合位点”是指抗体或抗体片段中包含特异性结合至抗原的区域的部分。抗原结合位点可以由一个或更多个抗体可变结构域提供。抗原结合位点通常包含在抗体或抗体片段的相关V

抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、重链、轻链、可变重(V

scFv片段(～25kDa)由两个可变结构域V

最小的抗原结合片段是单可变片段，即可变重链(V

术语“单结构域抗体、单可变结构域或免疫球蛋白单可变结构域(ISV)”都是本领域公知的，并且描述结合至靶抗原的抗体的单可变片段。这些术语在本文中可互换使用。“单重链结构域抗体、单可变重链结构域、免疫球蛋白单重链可变结构域(ISV)、人V

一方面，本发明涉及结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变结构域。如下所述，实施方案涉及结合HSA抗原的单可变重链结构域抗体/免疫球蛋白单可变重链结构域。因此，单可变重链结构域抗体能够在不存在轻链的情况下结合HSA。人单可变重链结构域抗体(“V

因此，在一些实施方案中，分离的结合剂/分子包含至少一个单结构域抗体或由至少一个单结构域抗体组成，其中所述结构域是人免疫球蛋白可变重链结构域；它们没有V

术语“分离的”是指从其天然环境分离的部分。例如，术语“分离的”是指基本上不含其他单结构域抗体、抗体或抗体片段的单结构域抗体。此外，分离的单结构域抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

每个V

可以对本发明的单结构域抗体进行C或N末端V

在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体包含1至50个残基，例如1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、、9或10、1-20、1-30或1-40个额外的氨基酸的C末端延伸。在一个实施方案中，本发明的单结构域抗体包含人C

如本文所用的，术语“同源性”或“同一性”通常是指在比对序列后，在一些实施方案中，在引入缺口(如果需要)以获得最大百分比同源性，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分之后，序列中与其比较的参比多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比。因此，两个氨基酸序列之间的百分比同源性等同于两个序列之间的百分比同一性。N-或C-末端延伸、标签或插入都不应被解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是众所周知的。可以使用众所周知的数学算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。

如本文所述的单结构域抗体的可变结构域是完全人的或基本上完全人的。如本文所用，术语V

然而，如本文所使用的，术语“人V

本发明的分子是有优势的，因为它们是完全人的，并且因此不具有免疫原性。它们不需要人化(humanisation)。

在第一方面，提供了免疫球蛋白单可变结构域抗体，其包含

a)CDR1，其具有SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有1、2、3、4、5或5个差异的氨基酸序列

b)CDR2，其具有SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个差异的氨基酸序列，和/或

c)CDR3，其具有SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个差异的氨基酸序列。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域具有上文限定的CDR之一，例如，CDR1、CDR2或CDR3。在一个实施方案中，CDR分别选自SEQ ID NO:2、3或4。在另一个实施方案中，CDR是变体并且具有如上限定的置换。在另一个实施方案中，一个或两个CDR序列是如从SEQ ID NO:2、3或4中定义的，并且剩余的CDR是各自CDR序列2、3或所适用的变体。

在一个实施方案中，单可变结构域抗体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％或95％同源性的序列。

SEQ ID NO:1如下所示：

(SEQ ID NO:1，在本文中也称为

CDR1、CDR2和CDR3的序列分别以以上粗体显示。CDR具有以下序列：

NYNMN CDR1:(SEQ ID NO:2)

SISSAGTHIYSADSVKG CDR2:(SEQ ID NO:3)

DPHSTGWYKDFDY CDR3:(SEQ ID NO:4)

在一个实施方案中，提供了单可变结构域抗体，其能够与人血清白蛋白结合并具有4个构架区(分别为FR1至FR4)以及3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)，其中：

(i)CDR1包含或者是SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；CDR2包含或者是氨基酸序列SEQ ID NO:3；和CDR3包含或者是氨基酸序列SEQ ID NO:4，并且其中

(ii)氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％的序列同一性。

在另一方面，提供了免疫球蛋白单可变结构域抗体，其包含

a)CDR1，其具有SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6具有1、2、3、4、5或5个差异的氨基酸序列

b)CDR2，其具有SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7具有1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个差异的氨基酸序列，和/或

c)CDR3，其具有SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个差异的氨基酸序列。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域具有上文限定的CDR之一，例如，CDR1、CDR2或CDR3。在一个实施方案中，CDR分别选自SEQ ID NO:6、7或8。在另一个实施方案中，CDR是变体并且具有如上限定的置换。在另一个实施方案中，一个或两个CDR序列是如从SEQ ID NO:6、7或8中定义的，并且剩余的CDR是各自CDR序列6、7、8或如适用的变体。

在一个实施方案中，单可变结构域抗体包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5具有至少80％、90％或95％同源性的序列。

SEQ ID NO:5如下所示：

(SEQ ID NO:5，在本文中也称为

CDR1、CDR2和CDR3的序列分别以以上粗体显示。CDR具有以下序列：

SYTMN CDR1:(SEQ ID NO:6)

SISSSGRYIYYADSVKG CDR2:(SEQ ID NO:7)

DPRMVGNPHEFDI CDR3:(SEQ ID NO:8)

在一个实施方案中，提供了单可变结构域抗体，其能够与人血清白蛋白结合并具有4个构架区(分别为FR1至FR4)以及3个互补决定区(分别为CDR1至CDR3)，其中：

(i)CDR1包含或者是SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列；CDR2包含或者是氨基酸序列SEQ ID NO:7；和CDR3包含或者是氨基酸序列SEQ ID NO:8，并且其中

(ii)氨基酸序列与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少85％、90％或95％的序列同一性。

如上使用的序列同源性/同一性可以是至少80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％，例如至少95％,96％,97％,98％或99％序列同源性/同一性。

免疫球蛋白单可变结构域抗体可以是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的变体，所述变体具有一个或多个氨基酸置换、缺失、插入或其他修饰，并且保留了单结构域抗体的生物学功能，即与HSA结合。因此，变体V

因此，通常可以在不改变多肽的生物学活性、功能或其他所需性质例如其对抗原的亲和力或特异性的情况下进行这些氨基酸改变。通常，多肽非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不会改变生物学活性。此外，在结构或功能上相似的氨基酸的置换不太可能破坏多肽的生物活性。包含本文描述的多肽和肽的氨基酸残基的缩写，以及这些氨基酸残基的保守置换显示在下表1中。

表1.氨基酸残基和保守氨基酸置换实例

在一些实施方案中，本发明提供V

技术人员将知道，有不同的方式来鉴定、获得和优化如本文所述的抗原结合分子，包括体外和体内表达文库。这在实施例中进一步描述。能够使用本领域已知的优化技术，例如展示(例如，核糖体和/或噬菌体展示)和/或诱变(例如易错诱变)。因此本发明还包含本文所述的单结构域抗体的序列优化的变体。

在一个实施方案中，能够进行修饰以降低单结构域抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或更多个构架残基恢复到相应的人种系序列。更具体而言，已经历体细胞突变的单结构域抗体可含有不同于单结构域抗体所源自的种系序列的构架残基。这些残基能够通过将单结构域抗体构架序列与单结构域抗体所源自的种系序列进行比较来鉴定。在一个实施方案中，所有构架序列均为种系序列。

为了使构架区序列中的一个或更多个氨基酸残基返回到其种系构型，体细胞突变能够通过例如定点诱变或PCR介导的诱变被“回复突变”为种系序列。

另一种类型的构架修饰包括使构架区内或甚至一个或更多个CDR区内的一个或更多个残基突变，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。

在另一个实施方案中，糖基化被修饰。例如，能够制备非糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。能够改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰能够通过例如改变抗体序列内的一个或更多个糖基化位点来完成。例如，能够进行一个或更多个氨基酸置换，其导致一个或更多个可变区构架糖基化位点的消除，从而消除该位点的糖基化。这种糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。

在一个实施方案中，一个或更多个置换在CDR1、2或3区域中。例如，CDR1、2或3中可有1、2、3、4、5或更多个氨基酸置换。在另一个实例中，可有1或2个氨基酸缺失。在一个实施方案中，一个或更多个置换在构架区中。例如，在构架区中可有1至10个或更多个氨基酸置换。

在一个实施方案中，变体包含关于SEQ ID NO.1的在以下一个或多个位置处的置换或一个或更多个以下置换或其组合：E1,V5,G44,Y60,92A,28T→A N31,N33,A54,G55,H57,I58和/或Y106。位置是根据Kabat。

在一个实施方案中，变体包含关于SEQ ID NO.1的在以下一个或多个位置处的置换或一个或更多个以下置换或其组合，例如在以下位置：E1→Q；5V-L；G44→R；Y60→S；92A→G；28T→A；N31→S；N33→T；A54→G；G55→S；H57→Y；I58→K和/或Y106→F。位置是根据Kabat。

在一个实施方案中，变体包括1,2,3,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或13个上述所列的修饰。因此具体设想了修饰的组合。

在一个实施方案中，变体包含关于SEQ ID NO.5的一个或更多个以下置换或其组合，例如在以下位置：V5,T28,N84,S50,S54,G55,R56,Y60,L103,E108和/或I111。位置是根据Kabat。

根据本发明的SEQ ID NO:1的一种变体显示在下面的SEQ ID NO:30中。

相应的核酸如下所示(SEQ ID NO:31)。

在一个实施方案中，变体包含关于SEQ ID NO.5的一个或更多个以下置换或其组合，例如在以下位置：V5→L；T28→N或A；N84→H；S50→A；S54→N；G55→S；R56→T；Y60→H；L103→V；E108→A和/或I111→V。位置是根据Kabat。

如所描述的，本发明提供的氨基酸序列是能够结合特别是能够特异性(如本文所述)结合人血清白蛋白的蛋白质。因此，它们能够用作用于与人血清白蛋白结合的结合单元或结合结构域，例如以便赋予治疗化合物、部分(moiety)或实体半寿期(如本文所定义)的增加。

所用的术语“半寿期”通常可以指例如由于通过自然机制序列或化合物的降解和/或序列或化合物的清除或螯合(sequestration)而在体内使氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度降低50％所花费的时间。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半寿期可以以本身已知的任何方式，例如通过药代动力学分析确定。合适的技术对于本领域技术人员将是清楚的。半寿期可以使用诸如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)的参数表示。半寿期(tα和tβ)和AUC可以从缀合物或融合物的血清浓度随时间变化的曲线确定。因此，本文所用的术语“半寿期”特别是指tl/2-β或终末半寿期(其中tl/2-α和/或AUC或者两者都可以不考虑).

例如，在第一相(α相)中，药物组合物(例如，药物缀合物、非共价药物缀合物、药物融合物)主要在患者体内分布，并伴有一些消除。当药物组合物(例如药物缀合物、非共价药物、药物融合物)已经分布并且随着药物组合物从患者中清除血清浓度降低时，第二相(β相)是终末相。Tα半寿期是第一相的半寿期，并且tβ半寿期是第二相的半寿期。

本发明的结合HSA的免疫球蛋白可变结构域：

-在人体内能够具有1至72小时，例如10小时或更长，例如长达20小时或12、24、36或48小时的血清半寿期(表示为t1/2)，和/或

-当与治疗部分连接时，赋予所得蛋白质1-72小时，例如10小时或更长，例如长达20小时或12、24、36或48小时的人体内血清半寿期。

在一个实施方案中，结合HSA的免疫球蛋白可变结构域在

在一个实施方案中，结合HSA的免疫球蛋白可变结构域在食蟹猴中赋予分子约84小时的半寿期。这可以如实施例中所示，例如对于SEQ ID NO:30的HSA结合物(binder)。

如实施例9所示，本发明的结合HSA的免疫球蛋白可变结构域还具有优异的储存稳定性。它们特别适合于延长V

本发明还涉及包含本文所述的免疫球蛋白单可变结构域抗体的结合分子，例如包含SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:5或和第二部分，或由其组成。在一个实施方案中，该部分是治疗部分。结合分子可以是多肽、蛋白质或构建体。因此还提供了包含本文所述的单可变结构域抗体的融合蛋白、多价和多特异性蛋白或构建体。本文所述的免疫球蛋白单可变结构域抗体(例如包含SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:5，或由其组成)用于与结合另一靶标例如治疗靶标的部分一起使用。

在一个实施方案中，所述治疗部分是结合分子，例如选自抗体或抗体片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段(scFv)或单结构域抗体，例如V

在一个实施方案中，包含如本文所述的结合HSA的免疫球蛋白单可变结构域和第二部分的蛋白质或多肽是融合蛋白。在一个实施方案中，包含结合如本文所述的HSA的免疫球蛋白单可变结构域和第二部分的蛋白质或多肽是药物缀合物。

如本文所用，“缀合物”是指包含抗体的抗原结合片段的组合物，其中所述抗体与结合至药物的血清白蛋白结合。

此类缀合物包括“药物缀合物”和“非共价药物缀合物”，其中所述“药物缀合物”包含与血清白蛋白(药物与之共价结合)结合的抗体的抗原结合片段，所述“非共价药物缀合物”包含与血清白蛋白(药物与之非共价结合)结合的抗体的抗原结合片段。

如本文所用，“药物缀合物”是指包含抗体的抗原结合片段的组合物，所述抗体与药物与之共价键合的血清白蛋白结合。药物能够通过合适的接头或间隔区部分直接或间接共价结合至抗原结合片段。药物能够在任何合适的位置与抗原结合片段结合，例如氨基端、羧基端或通过合适的氨基酸侧链。

在一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域通过肽接头或其他合适的接头连接到第二部分以连接两个部分。

术语“肽接头”是指包含一个或更多个氨基酸的肽。肽接头包含1至50个氨基酸，例如1至20个氨基酸。肽接头是本领域已知的并且非限制性实例描述于本文中。合适的非免疫原性接头肽是，例如，包括G和/或S残基、(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头的接头，其中“n”通常为1和10之间的数字，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一个实施方案中，该肽例如选自由GGGGS(SEQ ID NO:12),GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13),SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:14),GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:15),GSGSGSGS(SEQ ID NO:16),GGSGSGSG(SEQ ID NO:17),GGSGSG(SEQ ID NO:18)和GGSG(SEQ ID NO:19)组成的组。

结合剂可以是多特异性的，例如双特异性的。在一个实施方案中，所述结合分子包含如本文所述的结合至HSA的第一V

每个V

单V

在一个实施方案中，结合分子是双特异性的。因此，在一个方面，本发明涉及双特异性分子，其包含本文所述的单结构域抗体，所述单结构域抗体与具有不同于所述单结构域抗体的结合特异性的第二功能部分连接。

在一个实施方案中，结合分子例如蛋白质或构建体是多特异性的并且包含另外的即第三、第四、第五等部分。

在多特异性蛋白质的一个实施方案中，结合HSA的V

第二或另外的治疗部分可以选自结合例如肿瘤抗原或免疫肿瘤学靶标的部分，但技术人员会知道本发明不限于此。

本发明还涉及根据任一项权利要求的所述免疫球蛋白单可变结构域在融合蛋白中与所述治疗部分连接时，如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域延长治疗部分的半寿期的用途。

本发明还涉及根据任一项权利要求的所述免疫球蛋白单可变结构域在融合蛋白中与所述治疗部分连接时，如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域延长治疗部分的半寿期的用途。例如，它可用于延长包含结合CD137的sdAb和结合PSMA或PD-1的sdAb的蛋白质的半寿期，例如如本文所述。

如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域例如分子可以是V

在一个实施方案中，单可变重链结构域抗体获自或可获自表达包含未重排人V、D和J区的转基因的转基因啮齿动物，特别是产生仅具有人重链的抗体的啮齿动物。在一个实施方案中，所述啮齿动物不产生功能性内源轻链和重链。

通常，除非本文另有说明，本文提及的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、蛋白质和其他化合物和构建体旨在用于预防或治疗人(和/或任选地也用于温血动物，特别是哺乳动物)疾病或病症。因此，通常，本文描述的免疫球蛋白单可变结构域、多肽、蛋白质和其他化合物和构建体优选使得它们可以被用作(生物)药物或其他药学或治疗活性化合物和/或药物产品或组合物，和/或可以适当地作为其一部分。

因此，本发明还涉及包含如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域多肽、蛋白质或构建体的药物组合物或制剂，例如，包含如本文所述的HSA结合单结构域的结合分子或融合蛋白。药物组合物可任选地包含药学上可接受的载体。免疫球蛋白单可变结构域多肽、蛋白质或构建体或药物组合物可以通过任何方便的途径施用，包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼、鼻内、肺、皮内、玻璃体内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、脑内、透皮、经粘膜(transmucosal)、通过吸入或局部施用，尤其是耳、鼻、眼或皮肤或通过吸入。

肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、鼻内、直肠、膀胱内、皮内、局部或皮下施用。优选地，所述组合物肠胃外施用。

药学上可接受的载体或媒介物(vehicle)可以是颗粒状的，使得该组合物为例如片剂或粉末形式。术语“载体”是指与本发明的药物抗体缀合物一起施用的稀释剂、佐剂或赋形剂。这样的药物载体可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水，阿拉伯胶，明胶，淀粉糊，滑石粉，角蛋白，胶体二氧化硅，尿素等。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用于动物时，本发明的单结构域抗体或组合物和药学上可接受的载体是无菌的。当本发明的药物抗体缀合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物载体还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。

本发明的组合物能够是液体形式，例如溶液，乳液或悬浮液。该液体能够用于通过注射，输注(例如IV输注)或皮下递送。当打算口服施用时，该组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文认为是固体或液体的形式中。

作为用于口服施用的固体组合物，可以将所述组合物配制成粉剂、颗粒剂、压制片剂、丸剂、胶囊剂、口香糖、薄片(wafer)等形式。这样的固体组合物通常包含一种或更多种惰性稀释剂。此外，可以存在以下一种或更多种：粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，例如海藻酸、海藻酸钠、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橘子调味剂；和着色剂。当该组合物为胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除上述类型的材料外，它还可包含液体载体，例如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。

该组合物可以是液体的形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。该液体可用于口服施用或通过注射递送。当打算用于口服施用时，组合物可包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于注射施用的组合物中，还可以包括表面活性剂，防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或更多种。

组合物能够采取一个或更多个剂量单位的形式。在具体的实施方案中，期望的是将组合物局部施用于需要治疗的区域，或通过静脉内注射或输注。

本发明进一步扩展到用于治疗疾病例如癌症的方法，包括施用本文所述的药物组合物或制剂或包含本文所述的结合HSA的单结构域的结合分子或融合蛋白。还设想了本文所述的药物组合物或制剂或包含本文所述的结合HSA的单结构域的结合分子或融合蛋白，其用于治疗疾病；例如用于治疗癌症。还设想了本文所述的药物组合物或制剂或包含本文所述的结合HSA的单结构域的结合分子或融合蛋白在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在治疗特定病症或病况中有效/有活性的治疗剂的量将取决于病症或病况的性质，并且能够通过标准临床技术来确定。此外，能够任选地采用体外或体内测定来帮助确定最佳剂量范围。组合物中使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的严重程度，并应根据医师的判断和每位患者的情况来决定。应考虑年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主病况、药物组合、反应敏感性和疾病严重程度等因素。

通常，该量为组合物重量的至少约0.01％的本发明的单结构域抗体。当打算口服施用时，该量可以在组合物重量的约0.1％至约80％的范围内变化。优选的口服组合物可以包含组合物重量的约4％至约50％的本发明的单结构域抗体。

制备本发明的优选组合物，使得肠胃外剂量单位含有约0.01％至约2％重量的本发明的单结构域抗体。

对于注射施用，组合物能够包含约通常约0.1mg/kg至约250mg/kg受试者体重，优选约0.1mg/kg至约20mg/kg动物体重，以及更多优选约1mg/kg至约10mg/kg动物体重。在一个实施方案中，组合物以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg，约10至20mg/kg，约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。给药时间表可以从例如每周一次到每2、3或4周一次变化。

如本文所用，“治疗(treat)”，“正在治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指抑制或缓解疾病或病症。例如，治疗可以包括推迟与疾病或病症有关的症状的发展，和/或降低将或预期将随所述疾病发展的这类症状的严重性。这些术语包括改善现有症状，预防额外症状以及改善或预防此类症状的根本原因。因此，该术语表示对至少一些被治疗的哺乳动物，例如人类患者，给予了有益的结果。许多药物治疗对一些但并非全部接受治疗的患者有效。

术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅作为实例，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，例如非人类灵长动物、鼠、牛、马、犬、羊或猫。

本发明的分子或药物组合物，可以作为唯一的活性成分或与一种或更多种其他治疗剂组合施用。治疗剂是可用于治疗疾病的化合物或分子。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、促凋亡剂(pro-apoptotic agents)、抗血管生成剂、硼化合物、光敏剂或染料和放射性同位素。

本发明还涉及用于延长蛋白质半寿期的方法，包括将所述蛋白质连接至如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域。

本发明还涉及编码本文所述的氨基酸序列的核酸序列。在一个实施方案中，所述核酸是SEQ ID NO:20或与SEQ ID NO:20具有至少90％序列同源性的核酸。在一个实施方案中，所述核酸是SEQ ID NO:21或与SEQ ID NO:21具有至少90％序列同源性的核酸。在一个实施方案中，所述核酸序列通过接头连接至第二核酸序列。在一个实施方案中，所述第二核酸编码治疗部分。在一个实施方案中，所述接头是核酸接头。

SEQ ID NO.20

SEQ ID NO.21

本发明还涉及包含如本文所述的核酸序列的载体。本发明还涉及包含本文所述的核酸序列或如本文所述的载体的宿主细胞。宿主细胞可以是哺乳动物、细菌或酵母细胞。

本发明还涉及包含如本文所述的免疫球蛋白单可变结构域或药物组合物、如本文所述的蛋白质或构建体或如本文所述的药物组合物以及任选的使用说明书的试剂盒。

本文所述的单结构域抗体可获自转基因哺乳动物例如啮齿动物，所述动物在用HSA抗原刺激后表达仅具有重链的抗体。转基因啮齿动物，例如小鼠，优选具有降低的表达内源性抗体基因的能力。因此，在一个实施方案中，啮齿动物具有降低的表达内源性轻链和/或重链抗体基因的能力。啮齿动物因此可以包含修饰以破坏内源性κ和λ轻链和/或重链抗体基因的表达，从而不产生功能性轻链和/或重链，例如如下文进一步解释的。

一个方面还涉及一种用于产生仅具有人重链的抗体或具有如本文所述的能够结合HSA的V

a)用HSA抗原免疫转基因啮齿动物，例如小鼠，其中所述啮齿动物表达包含未重排的人重链V基因的核酸构建体，并且不能产生功能性内源轻链或重链，

b)分离仅具有重链的人抗体。

进一步的步骤可以包括例如通过从所述啮齿动物(例如小鼠)生成包含V

另一方面还涉及用于产生能够结合人HSA的单V

a)用HSA抗原免疫转基因啮齿动物，例如小鼠，其中所述啮齿动物表达包含未重排的人重链V基因的核酸构建体，并且不能产生功能性内源轻链或重链，

b)生成包含来自所述啮齿动物(例如小鼠)的V

c)从所述文库分离包含V

进一步的步骤可以包括鉴定结合至HSA的单V

使用体外表达文库制备或生成本文所述的多肽，核酸，宿主细胞，产物和组合物的方法可包括以下步骤：

a)提供编码氨基酸序列的核酸序列的组、集合或文库；和

b)在所述组、集合或文库中筛选能够结合至HSA/对HSA具有亲和力的氨基酸序列，和

c)分离能够结合至HSA/对HSA具有亲和力的氨基酸序列。

还提供了用于制备本文所述的单V

在上述方法中，氨基酸序列的组、集合或文库可展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体或合适的微生物(例如酵母)上，例如以便于筛选。用于展示和筛选氨基酸序列(的组、集合或文库)的合适方法、技术和宿主生物对于本领域技术人员而言是清楚的(参见例如PhageDisplay of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press；第一版(1996年10月28日)Brian K.Kay,Jill Winter,John McCafferty)。文库，例如噬菌体文库，是通过分离表达抗原特异性的、仅具有重链的抗体的细胞或组织，从源自分离的细胞或组织的mRNA克隆编码V

在本文的各个方面和实施方案中，术语啮齿动物可以涉及小鼠或大鼠。在一个实施方案中，啮齿动物是小鼠。小鼠可以包含非功能性内源λ轻链基因座。因此，小鼠不会产生功能性内源λ轻链。在一个实施方案中，通过插入、倒位、重组事件、基因编辑或基因沉默，部分或完全缺失λ轻链基因座或使其变得无功能。例如，如上所述，至少恒定区基因C1、C2和C3可以通过插入或其他修饰而缺失或变得无功能。在一个实施方案中，所述基因座功能性沉默，使得所述小鼠不产生功能性λ轻链。

此外，小鼠可以包含非功能性内源κ轻链基因座。因此，小鼠不产生功能性内源κ轻链。在一个实施方案中，通过插入，倒位，重组事件，基因编辑或基因沉默，使κ轻链基因座部分或完全缺失或使其变得无功能。在一个实施方案中，将所述基因座功能性沉默，使得所述小鼠不产生功能性κ轻链。

例如，可以如WO 2003/000737(其在此通过引用整体并入)中所公开的那样制备具有功能沉默的内源λ和κL-链基因座的小鼠。

此外，小鼠可包含非功能性内源重链基因座，例如如WO2004/076618(在此通过引用整体并入)中所述。因此，小鼠不产生功能性内源重链。在一个实施方案中，通过插入，倒位，重组事件，基因编辑或基因沉默，使重链基因座部分或完全缺失或使其变得无功能。在一个实施方案中，将所述基因座功能性沉默，使得所述小鼠不产生功能性重链。

在一个实施方案中，小鼠包含非功能性内源重链基因座、非功能性内源λ轻链基因座和非功能性内源κ轻链基因座。因此小鼠不产生任何功能性内源轻链或重链。因此，该小鼠是三重敲除(TKO)小鼠。

转基因小鼠可包含载体，例如用于表达异源(优选人)重链基因座的酵母人工染色体(YAC)。YAC是能够用于在酵母中克隆非常大的DNA插入片段的载体。除了包含对像天然酵母染色体的行为所必需的所有三种顺式作用结构元件(自主复制序列(ARS)，着丝粒(CEN)和两个端粒(TEL))外，它们接受大DNA插入片段的能力使它们达到酵母细胞中染色体样稳定性以及传递的保真度所需的最小尺寸(150kb)。YAC的构建和使用在本领域是公知的(例如，Bruschi,C.V.和Gjuracic,K.Yeast Artificial Chromosomes,Encyclopaedia ofLife Sciences,2002 Macmillan Publishers Ltd,Nature Publishing Group)。

例如，YAC可以包含与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的过量的未重排的人VH、D和J基因。人VH、D和J基因是人VH、D和J基因座，并且它们是完全人的未重排基因。YAC可以如WO2016/062990中所述。

本领域已知的备选方法可用于内源小鼠或大鼠免疫球蛋白基因的缺失或失活以及与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的人V、D和J基因的引入。

可以根据实施例中所示的标准技术来产生转基因小鼠。用于产生转基因小鼠的两种最具特征的途径是通过将遗传物质原核显微注射到新近受精的卵母细胞中或通过将稳定转染的胚胎干细胞引入桑椹胚或囊胚期胚胎。不管如何引入遗传物质，被操纵的胚胎都会转移到假妊娠的雌性接受者体内，在那里继续妊娠并生出候选的转基因幼仔。

这些广泛的方法之间的主要区别在于ES克隆可以在用于产生转基因动物之前被广泛筛选。相反，原核显微注射依赖于在引入遗传物质后整合到宿主基因组的遗传物质，并且一般而言，转基因的成功整合直到幼仔出生后才能被证实。

本领域已知许多方法可协助并确定是否发生转基因的成功整合。转基因动物能够通过多种手段生成，包括将构建体随机整合到基因组中，位点特异性整合或同源重组。有多种工具和技术可用于驱动和选择转基因整合和后续修饰，包括使用药物抗性标记(阳性选择)，重组酶，重组介导的盒式交换，阴性选择技术和核酸酶来改善重组效率。大多数这些方法通常用于修饰ES细胞。然而，一些技术可用于增强通过原核注射介导的转基因。

能够使用进一步的改进来在所需背景下更有效地生成转基因系。如上所述，在优选的实施方案中，内源性小鼠免疫球蛋白表达被沉默以允许仅使用引入的转基因来表达能够被开发用于药物发现的仅具有重链的所有组成成分(repertoire)。如上所述，能够使用遗传操作的小鼠，例如针对所有内源性免疫球蛋白基因座(小鼠重链，小鼠κ链和小鼠λ链)沉默的TKO小鼠。任何引入的转基因转移到这种TKO背景能够通过育种(常规的或包含IVF步骤)来实现以提供该过程的有效缩放。但是，也可以在转基因过程中包括TKO背景。例如，对于显微注射，卵母细胞可以源自TKO供体。类似地，可衍生来自TKO胚胎的ES细胞用于转基因。

引入转基因以表达免疫球蛋白基因座的三重敲除小鼠在本文中称为TKO/Tg。

在一个实施方案中，小鼠如WO2016/062990中所述。本发明还涉及表达人重链基因座并且已用HSA抗原免疫的啮齿动物，优选小鼠。本发明还涉及如上所述的表达仅有重链的抗体的啮齿动物，优选小鼠，所述抗体包含结合人HSA的人VH结构域。优选地，所述啮齿动物不能产生功能性内源κ和λ轻链和/或重链。人重链基因座位于可以如上所述的转基因上。

本发明还涉及抗人HSA单V

除非在此另外定义，否则与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。虽然前述公开内容提供涵盖在本发明的范围内的主题的一般描述，包括制造和使用本公开的方法及其最佳模式，提供以下实施例以进一步使得本领域技术人员能够实施本公开。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，其范围应该从本公开所附的权利要求书及其等同物中理解。鉴于本公开，本公开的各种其他方面和实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

本说明书中提及的所有文件均通过引用以其全文并入本文，包括对基因登录号的参考，科学出版物和对专利公开的参考。

本文中使用的术语“和/或”被认为是在具有或不具有另一个的情况下两个特定特征或部件中每一个的具体公开。例如，“A和/或B”应被认为是(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开，就像每个在本文中单独地列出一样。除非上下文另外指出，以上陈述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且等同地应用于所描述的所有方面和实施方案。

在以下非限制性实施例中进一步说明了本发明。

实施例

实施例1 Tg/TKO小鼠的构建

在沉默内源重链和轻链抗体表达的背景中携带种系构型的重链抗体转基因基因座的小鼠(三重敲除，或TKO)如先前所述产生(WO2004/076618和WO2003/000737,Ren等人Genomics,84,686,2004；Zou等人,J.Immunol.,170,1354,2003)。简言之，用酵母人工染色体(YAC)原核显微注射新近受精的卵母细胞之后取得转基因小鼠，所述酵母人工染色体包含与缺乏CH1结构域的小鼠免疫球蛋白恒定区基因、小鼠增强子和调控区组合的过量的人V

使用的YAC大约340kb，包含10个天然构型的人重链V基因、人重链D和J基因、鼠Cγ1基因和鼠3’增强子基因。它缺少C

将转基因建立者小鼠与缺乏内源性免疫球蛋白表达的动物回交，以产生用于所述免疫研究的Tg/TKO系。

实施例2用于免疫的抗原

免疫使用血清纯化的人和食蟹猴血清白蛋白。血清纯化的人(HSA)和食蟹猴(CSA)血清白蛋白购自Sigma(目录号A4327)和Abcam(目录号ab184894)。

实施例3免疫方案

三只8–12周龄的Crescendo小鼠每只接受50μg CSA的初次免疫，在完全弗氏佐剂中乳化并皮下递送，随后3次加强10μg HSA，在不完全弗氏佐剂中乳化，同样皮下施用，在初次启动后每周一次间隔。在不存在佐剂的情况下，在磷酸盐缓冲盐水中腹膜内施用最后剂量的HSA。在初次免疫后49天，终止小鼠，并将臂和腹股沟淋巴结和脾收集到RNAlater(Qiagen目录号76104)中。收集并储存血清用于测试应答。

实施例4血清ELISA

将Nunc Maxisorp板在4℃下用PBS溶液中的1μg/ml HSA包被过夜。然后使用补充有0.05％吐温20的PBS洗涤板，然后用不添加吐温的PBS洗涤，并在室温下用3％脱脂奶粉(Marvel)的PBS溶液封闭至少一小时。在聚丙烯管或板中制备3％Marvel/PBS中的血清稀释液，并在室温下孵育至少一小时，然后转移到封闭的ELISA板，在那里进行至少一小时的进一步孵育。在PBS/吐温和PBS中洗涤后，加入生物素缀合的山羊抗小鼠IgG、Fcγ亚类1特异性抗体(Jackson 115-065-205)的溶液，所述溶液在PBS/3％Marvel中以1:10000稀释制备，然后将板在室温下孵育至少一小时，然后使用PBS/吐温和PBS洗涤。将在3％Marvel/PBS中以1:1000稀释的Neutravidin-HRP溶液(Pierce 31030)加入到ELISA板中并孵育至少30分钟。进一步洗涤后，使用TMB底物(Sigma目录号T0440)使ELISA显色，并在10分钟后通过添加0.5M H

实施例5从免疫小鼠生成文库

a.处理组织、RNA提取和cDNA制备

将每只免疫动物的脾脏和淋巴结收集到RNAlater中。对于每只动物，分别处理1/4的脾脏和4个淋巴结。最初，组织被均质化；随后进行RNA沉淀。使用RNeasy 96QIAcube试剂盒和QIAcube HT塑料(plastics)在QIAcube上进行RNA纯化。然后使用Superscript IIIRT-PCR高保真试剂盒将每个RNA样品用于制备cDNA。

b.克隆到噬菌粒载体

使用基于PCR的方法在噬菌粒载体pUCG3中克隆V

将纯化的V

将转化的10倍稀释系列铺板在具有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xTY琼脂培养皿上。这些培养皿上获得的菌落用于评估文库大小。将转化的剩余部分铺板在补充有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的大型2xTY琼脂生物测定皿上。所有琼脂平板均在30℃下孵育过夜。通过将10ml 2xTY液体培养基添加到大型生物测定培养皿中来收获文库。轻轻刮下细菌菌落并记录OD600。加入等体积的50％(v/v)甘油溶液后，将整分试样储存在-80℃的冷冻小瓶中，或直接用于噬菌体选择过程。

实施例6用于分离结合HSA的V

为生成

实施例7用于靶标结合的测定

在以下一种或多种测定中筛选来自不同选择的V

a.用于人和食蟹猴血清白蛋白的基于微球(bead)的FLISA结合测定

对于前导Humabody V

从在深孔板中生长的1ml培养物中制备小规模细菌周质提取物。起始培养物用于在30℃ 250rpm振荡下接种96孔深孔板(Fisher，目录号MPA-600-030X)，所述深孔板含有补充有0.1％(w/v)葡萄糖+100ug/ml氨苄青霉素的2XTY液体培养基(Melford，M2130)。当OD600达到0.5-1时，通过添加100ul补充有IPTG(终浓度5mM)和氨苄青霉素的2XTY来诱导V

微球群：SOL-R4、SOL-R5 Tm羧基微球与重组HSA结构域I-II(目录号9905)、重组HSA结构域II(目录号9902)和CSA偶联。将微球稀释至所需浓度。

b.纯化的V

用pJExpress载体从W3110大肠杆菌上清液中纯化V

用分光光度法估计纯化的V

c.结合动力学。

在Biacore T200上使用单循环动力学在pH 7.4和pH 6.0下对人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白进行了结合研究。使用胺试剂偶联试剂盒GE Healthcare BR-1000-50通过胺偶联将血清白蛋白(HSA、CSA、MSA)偶联至CM5芯片。根据制造商的说明激活芯片表面。通过将10mM醋酸钠(pH5.0)中的血清白蛋白(HSA、CSA、MSA)注入，血清白蛋白(HSA、CSA、MSA)被捕获并交联到传感器芯片表面。随后注射1M乙醇胺以稳定表面上的血清白蛋白。通过这个程序，大约300RU被固定。

对于动力学测量，将在PBST pH7.4或PBST pH6.0中的四倍连续稀释的V

表2:计算的Humabody V

实施例9–V

对纯化的V

在4℃和40℃下孵育7天后，未观察到显著变化。

表3：TPP-712和814的稳定性。这显示了0、1和7天后存在的单体百分比。

实施例10在双转基因人源化FcRn/HSA小鼠中单次静脉给药的半寿期延长构建体的药代动力学分析

简而言之，雄性或雌性GenOway Human HSA/FcRn Tg小鼠经由尾静脉以1或2mg/kg的剂量单次静脉注射表4中所列的化合物(n＝3)进行给药。一些构建体包含纯化/检测标签，例如：多组氨酸或FLAG标签。在给药前和通过隐静脉药物施用后0.083小时、1小时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时收集血样。给药后168小时，对所有动物实施安乐死并收集血液。分离血浆并储存在-80℃直到进行测定。在Gyrolab免疫测定平台上分析血浆样品，使用生物素化人PSMA或人CD137作为捕获物和人CD137Dylight650、人PD-1Dylight650或抗Flag-AF647兔单克隆抗体(NEB，目录号15009S)作为检测物。使用Gyros分析数据以获得血浆中的化合物浓度。数据的药代动力学分析是使用PK Solver 2.0(Excel插件)完成的。研究结果表明，在人HSA/FcRn Tg小鼠中，当以1或2mg/kg静脉内给药时，化合物具有19.9至78.7小时范围内的半寿期。

表4:pK参数汇总表。

实施例8在食蟹猴中的PK研究

在开始食蟹猴PK研究之前，在Crescendo Biologics和合同研究机构对替换、减少和改进考虑因素以及伦理和科学判断(例如靶标表达/同源性与人类、剂量水平等)和风险进行了审查。这项食蟹猴PK研究中的动物研究是在英国内政部项目许可证(UK HomeOffice Project License)下在位于英国的合同研究机构进行的。管理这项研究的内政部许可证严格规定了对动物影响的严重程度限制。方案中的程序没有造成任何超过程序严重性限制的影响。

简而言之，向三只雄性食蟹猴给药表中列出的4mg/kg Humabody构建体(TPP-1246)，该研究在Charles River Study中进行。在给药前(-24小时)、给药后1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、120小时、168小时、216小时、312小时、360小时、408小时和504小时从所有的测试受试者采集血清样品，并在测试前冷冻。使用Crescendo开发的测定法对血清样品进行PK分析。

PK测定法利用Gyrolab Xplore免疫测定平台，使用夹心免疫测定形式；分析物(列于表中)由生物素化的CD137抗原固定，并由dyLight650标记的PD-1检测。优化并建立测定以确认范围和再现性，并且根据建立的测定完成样品分析。对来自以下时间点的PK数据进行PK分析：动物01：1至168小时，动物02：1至120小时和动物03：1至168小时。报告的PK参数是每个结果的3个个体的平均值。食蟹猴血清中TPP-1246的T1/2已被证明为84.5小时±7.58小时。数据如图1所示。

表5.在食蟹猴中单次静脉内给药TPP-1246后的PK参数估计

上述所有实验中使用的分子均基于上述分子。在适当的情况下，测试的分子包括C末端序列，例如纯化标签。