山莨菪碱的反式异构体及其分离和检测方法

技术领域

本发明属于药物分离和分析领域，具体的涉及山莨菪碱的反式异构体及其分离和检测方法。

背景技术

山莨菪碱可与乙酰胆碱竞争拮抗M受体，用于治疗平滑肌痉挛、神经痛、暴发型脑膜炎、球菌性脑膜炎、中毒性痢疾及血管痉挛引起的循环障碍等。消旋山莨菪碱为山莨菪碱的合成品(654-2)，包含四种光学异构体，分别为6R,2'S、6S,2'R、6R,2'R、6S,2'S构型。已有相关动物实验证明，对于离体大鼠气管的舒张效应强弱上，6S,2'S异构体表现出最强的药理活性。而在离体大鼠小肠平滑肌舒张效应上，6R,2'S异构体表现出最强的药理活性。因此，通过手性拆分的方法将消旋山莨菪碱分离为四种光学异构体，以单一光学异构体进行用药，可以极大地提高药物的安全性和有效性。

现有的拆分方法有采用毛细管电泳法或者HPLC实现山莨菪碱四种光学异构体的拆分。

但由于现有的分离方法存在分离后的光学异构体纯度低等缺陷，无法适用于工业化规模生产和上市的要求。

发明内容

本发明为了解决上述背景技术中现有的分离方法存在分离后的光学异构体纯度低等缺陷的技术问题，提供山莨菪碱的反式异构体及其分离和检测方法。

本发明采用的技术方案如下：

消旋山莨菪碱为山莨菪碱的合成品(654-2)，包含四种光学异构体，分别为6R,2'S、6S,2'R、6R,2'R、6S,2'S构型。本发明将6R,2’R和6S,2’S构型定义为反式山莨菪碱，将6R,2’S和6S,2’R构型定义为顺式山莨菪碱。

本发明一方面提供了一种山莨菪碱的反式异构体的分离方法，包括以下步骤：

S1、取消旋山莨菪碱，采用动态制备型HPLC进行分离，得到含有6R,2’S和6S,2’R的顺式山莨菪碱以及含有6R,2’R和6S,2’S的反式山莨菪碱；

S2、将步骤S1得到的所述顺式山莨菪碱和所述反式山莨菪碱的pH调至8.5～10后，用氯仿等比例萃取至少1次，合并萃取液旋干，得到纯化后的顺式山莨菪碱和反式山莨菪碱；

S3、将步骤S2中得到的反式山莨菪碱用溶剂溶解后采用超临界色谱法进行拆分，接着旋干后分别得到6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱，所述超临界色谱法的具体参数如下：

色谱柱：30*250mm 10μm；

流动相：超临界CO

助溶剂：甲醇和0.2％的7mol的NH

循环时间：10～20min；

运行时间：20～30min；

波长：200～240nm；

背压：90～110bar；

柱温：30～40℃；

流动相流速：30～40ml/min；

总流速：40～50ml/min。

本发明的有益效果是：通过HPLC和超临界色谱法的结合，能够顺利的实现山莨菪碱中反式异构体的拆分和提取，提取后的反式异构体的单体的纯度均高于99％，成盐后得到的氢溴酸山莨菪碱的纯度依旧高于99％，能够达到并且远远高于《中国药典》的纯度要求，相比于市面上消旋山莨菪碱的异构分离后得到的反式异构体的单体的纯度有了极大的提升，直接提高了产品的质量和安全性，解决了背景技术中的技术问题。以单一光学异构体进行用药，可以极大地提高药物的安全性和有效性。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在步骤S3中，所述流动相为超临界CO

采用上述进一步方案的有益效果是，CO

进一步，在步骤S3中，所述流动相的流速为33.75ml/min,助溶剂的质量为流动相的25％。

采用上述进一步方案的有益效果是，适当的流速和助溶剂的质量配比能够缩短出峰时间和让消旋山莨菪碱能够顺利实现异构体的分离。

进一步，在步骤S3中，所述溶剂为甲醇，所述波长为215nm。

采用上述进一步方案的有益效果是，采用甲醇为溶剂能够有效提升分离度，有利于消旋山莨菪碱拆分。

进一步，在步骤S3中，所述柱温为35℃，所述色谱柱为CHIRALCEL OX(30*250mm 10μm)(Daicel)，所述循环时间为13.5min,所述运行时间为25min,所述背压为100bar，所述总流速为45ml/min。

采用上述进一步方案的有益效果是，上述最佳参数的实施，能够保证消旋山莨菪碱中的反式异构体顺利进行拆分，拆分效果好，直接提升了后续以两个反式异构体单体作为原料进行药物合成后得到产品的质量。

进一步，在步骤S1中，所述制备型HPLC进行分离的色谱参数如下：

色谱柱：DAC80动态制备分离柱；

色谱柱填料：华谱LD-2-C18；

流速：150～220ml/min；

波长：200～220nm；

洗脱时间在0～45min时，流动相为0.1％甲酸和甲醇按照95:5的质量比例混合的混合物，洗脱时间在45～60min时，流动相为0.1％甲酸和甲醇按照30:70的质量比例混合的混合物。

采用上述进一步方案的有益效果是，能够对拆分过程更好的进行质量控制，提升了拆分后得到产品的质量。

进一步，在步骤S1中，流速为200ml/min，波长为210nm。

本发明的有益效果是，通过HPLC和超临界色谱的结合，能够将消旋山莨菪碱的反式异构体进行有效的分离，接着通过HPLC和超临界色谱中具有创造性的色谱参数选择，提升了分离度，使得最后得到的山莨菪碱的两种反式异构体单体的纯度高，为大规模工业化应用奠定了基础。

另一方面，本发明还提供了一种山莨菪碱的一对反式异构体的检测方法，包括以下步骤：

取6R,2’R的山莨菪碱或6S,2’S的山莨菪碱，采用LCMS进行检测，LCMS的参数如下：

色谱柱：Waters X Bridge C18柱(50mm*4.6mm*3.5um)；

流动相：流动相A为0.01mol/L的NH

流速为2mL/min，柱温40℃，洗脱时间在0～1.6min时，流动相B为5％～95％，洗脱时间在1.6～3min时，流动相B为95％。

本发明的有益效果是:通过LCMS的检测，可以顺利的将分离出来的反式异构体进行有效的检测，出峰顺利，峰型好。

另一方面，本发明还提供了一种6R,2’R山莨菪碱单体，采用如上所述的山莨菪碱的反式异构体的分离方法进行制备。

本发明的有益效果是，能够顺利得到高纯度的6R,2’R山莨菪碱单体。

另一方面,本发明还提供了一种6S,2’S山莨菪碱单体，采用如上所述的山莨菪碱的反式异构体的分离方法进行制备。

本发明的有益效果是，能够顺利得到高纯度的6S,2’S山莨菪碱单体。

附图说明

图1为本发明顺式山莨菪碱和反式山莨菪碱的拆分图；

图2为本发明反式山莨菪碱手性拆分前的色谱图；

图3为本发明的反式-前峰色谱图；

图4为本发明的反式-后峰色谱图；

图5为本发明6R,2’R的山莨菪碱的LCMS色谱图；

图6为本发明6S,2’S的山莨菪碱的LCMS色谱图；

图7为本发明6R,2’R的氢溴酸山莨菪碱色谱图；

图8为本发明6S,2’S的氢溴酸山莨菪碱色谱图；

图9为本发明6R,2’R的山莨菪碱紫外光谱图；

图10为本发明6S,2’S的山莨菪碱紫外光谱图；

图11为本发明实施例1中6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图；

图12为本发明实施例7中6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图；

图13为本发明实施例8中6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图；

图14为本发明实施例9中6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图；

图15为本发明实施例10中6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图；

图16为本发明实施例11中6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图；

图17为本发明实施例12中6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图；

图18为本发明6R,2'S、6S,2'R、6R,2'R、6S,2'S构型的结构式。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

消旋山莨菪碱为山莨菪碱的合成品(654-2)，包含四种光学异构体，分别为6R,2'S、6S,2'R、6R,2'R、6S,2'S构型。6R,2'S、6S,2'R、6R,2'R、6S,2'S构型的结构式如图18所示。

实施例1、

一种山莨菪碱的反式异构体的分离方法，包括以下步骤：

S1、取14g消旋山莨菪碱采动态制备型HPLC进行分离，得到含有6R,2’S和6S,2’R的顺式山莨菪碱以及含有6R,2’R和6S,2’S的反式山莨菪碱，总共7g；

所述制备型HPLC进行分离的色谱参数如下：

色谱柱：DAC80动态制备分离柱；

色谱柱填料：华谱LD-2-C18；

流速：200ml/min；

波长：210nm；

洗脱时间在0～45min时，流动相为0.1％甲酸和甲醇按照95:5的质量比例混合的混合物，洗脱时间在45～60min时，流动相为0.1％甲酸和甲醇按照30:70的质量比例混合的混合物。得到的顺式山莨菪碱和反式山莨菪碱的拆分图谱如图1所示。

S2、将步骤S1得到的总共7g的所述顺式山莨菪碱和所述反式山莨菪碱混合物调整pH至9.2后，用氯仿等比例萃取5次，合并萃取液旋干，得到纯化后的顺式山莨菪碱5.33g和反式山莨菪碱5.63g；取反式山莨菪碱，采用HPLC进行检测，得到的手性拆分前的色谱图如图2所示，出峰顺序依次为消旋山莨菪碱反式异构体中的6R,2’R和6S,2’S。故从图2中可以知晓，反式山莨菪碱中含有两个反式异构体，HPLC的参数如下：

色谱柱：CHIRALCEL OX-3(4.6*100mm)手性色谱柱；

流动相：0.2％的7molNH

流速为2mL/min，柱温35℃，检测波长215nm。

S3、将步骤S2中得到的5.63g反式山莨菪碱用55mL甲醇溶解后采用超临界色谱法进行拆分，得到图谱如图11所示，从图11中可以得知反式异构体中的两个单体实现了有效的拆分，将反式在35℃下旋干分别得到6R,2’R的山莨菪碱2.11g和6S,2’S的山莨菪碱2.08g，超临界色谱法的具体参数如下：

色谱柱：CHIRALCEL OX(30*250mm 10μm)(Daicel)；

流动相：超临界CO

循环时间：10.3min；

运行时间：20min；

波长：215nm；

背压：100bar；

柱温：35℃；

流动相流速：38.25ml/min；

总流速：45ml/min。

接着，将得到6R,2’R的山莨菪碱单体按照步骤S2中的HPLC相同检测条件进行检测，得到如图3所示，证明了色谱图中的反式-前峰即为6R,2’R的山莨菪碱。

接着，将得到6S,2’S的山莨菪碱单体按照步骤S2中的HPLC相同检测条件进行检测，得到如图4所示，证明了色谱图中的反式-后峰即为6S,2’S的山莨菪碱。

实施例2、

取实施例1中步骤S3得到的6R,2’R的山莨菪碱，采用LCMS进行检测，得到山莨菪碱反式异构体的前峰如图5所示，从图5中可以证明，实施例1顺利的分离出了6R,2’R的山莨菪碱，LCMS的参数如下：

色谱柱：Waters X Bridge C18柱(50mm*4.6mm*3.5um)；

流动相：流动相A为0.01mol/L的NH

流速为2mL/min，柱温40℃，当洗脱时间在0～1.6min时，流动相B为5％～95％；当洗脱时间在1.6～3min时，流动相B为95％。

实施例3、

取实施例1中步骤S3得到的6S,2’S的山莨菪碱，采用LCMS进行检测，得到山莨菪碱反式异构体的后峰如图6所示，从图6中可以证明，实施例1顺利的分离出了6S,2’S的山莨菪碱，LCMS的参数如下：

色谱柱：Waters X Bridge C18柱(50mm*4.6mm*3.5um)；

流动相：流动相A为0.01mol/L的NH

流速为2mL/min，柱温40℃，当洗脱时间在0～1.6min时，流动相B为5％～95％；当洗脱时间在1.6～3min时，流动相B为95％。

实施例4、

分别取实施例1的6R,2’R的山莨菪碱单体和6S,2’S的山莨菪碱单体，分别溶解于无水乙醇中，分别滴加氢溴酸成盐，利用其在溶剂中不同温度下的溶解度差异，可获得其氢溴酸盐固体。

最终得到的2种异构体氢溴酸盐如下表1：

表1

按照《中国药典》中对氢溴酸山莨菪碱的HPLC检测方法进行检测，得到如图7所示的6R,2’R的氢溴酸山莨菪碱色谱图和如图8所示的6S,2’S的氢溴酸山莨菪碱色谱图，根据图7所示，6R,2’R的氢溴酸山莨菪碱的有关物质统计如下表2：

表2

所以根据表2和图7和可以得出，6R,2’R的山莨菪碱成盐后的纯度高达99.19％，说明本发明的一种山莨菪碱的反式异构体的分离方法的分离效果良好，提纯度高，且适合工业化生产。其分离纯度要远远高于现有分离方法得到的反式山莨菪碱单体。

根据图8所示，6S,2’S的氢溴酸山莨菪碱的有关物质统计如下表3：

表3

所以根据表3和图8和可以得出，6S,2’S的山莨菪碱成盐后的纯度高达99.04％，再次证明本发明的一种山莨菪碱的反式异构体的分离方法的分离效果良好，提纯度高，且适合工业化生产。其分离纯度要远远高于现有分离方法得到的反式山莨菪碱单体。

实施例5、

取6R,2’R的山莨菪碱标准品用甲醇配制成1mg/ml溶液，使用紫外-可见分光光度计进行扫描，记录紫外光谱图如图9所示，通过图9可以得出，6R,2’R的山莨菪碱在210nm附近有较大吸收峰，考虑到溶剂末端吸收的干扰，选择215nm作为本发明的检测波长，可以有效提高本发明分离方法的分离度。

实施例6、

取6S,2’S的山莨菪碱标准品用甲醇配制成1mg/ml溶液，使用紫外-可见分光光度计进行扫描，记录紫外光谱图如图10所示，通过图10可以得出，6S,2’S的山莨菪碱在210nm附近有较大吸收峰，考虑到溶剂末端吸收的干扰，选择215nm作为本发明的检测波长。可以有效提高本发明分离方法的分离度。

实施例7、

与实施例1的区别在于，在步骤S3中，所述流动相为超临界N

实施例8、

与实施例1的区别在于，在步骤S3中，所述流动相为超临界NH

实施例9、

与实施例1的区别在于，在步骤S3中，所述溶剂为乙醇。在步骤S3中得到的6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图如图14所示，在该色谱条件下，6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱能有效分离，但峰型等较差，所以实施例1的溶剂为甲醇时分离效果更优，也反应了实施例1的分离效果更好。

实施例10、

与实施例1的区别在于，在步骤S3中，柱温为40℃。在步骤S3中得到的6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图如图15所示，该色谱条件下，6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱基本能有效分离，但峰形较差。

实施例11、

与实施例1的区别在于，在步骤S3中，所述色谱柱的填料为OZOX，即纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。在步骤S3中得到的6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图如图16所示，在该色谱条件下，6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱不能有效分离。

实施例12、

与实施例1的区别在于，在步骤S3中，所述色谱柱的填料为ODOG，纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)。在步骤S3中得到的6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱拆分色谱图如图17所示，在该色谱条件下，6R,2’R的山莨菪碱和6S,2’S的山莨菪碱不能有效分离。

在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。