一种快速杂交捕获试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种快速杂交捕获试剂盒。

背景技术

高通量测序技术(NGS)凭借其高通量、精确度高和信息量丰富等优势，在基础研究、产前诊断、遗传病诊断、肿瘤诊断与精准医疗等领域应用广泛。然而，进行全基因组测序不仅耗费时间和精力，还会产生很多冗余且无临床价值的数据，因此捕获特定区域进行检测是目前临床应用的主流处理方案。

与全基因组测序相比，靶向杂交捕获测序可对特定区域进行分离和富集，不仅检测灵敏度高，而且大大降低后续数据分析工作。因此，高效的捕获试剂盒至关重要。

目前市场上有多种杂交捕获试剂盒，其基本流程类似，以IDT公司的xGenHybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒为例。该试剂盒的组分主要包括：Human CotDNA、2x Hybridization Buffer、Hybridazation Buffer Enhancer、2xBeads WashBuffer、10xWash Buffer I、10xWash Buffer II、10xWash Buffer III、10xStringentWash Buffer、链霉亲和素磁珠M-270，还需要另外购买AMPure XP beads(Beckman公司)、IDTE(IDT公司)、Universal Blockers-TS Mix(IDT公司)、KAPA HiFi Hotstart Readymix(Roche公司)、Library Amplification Primer P5+P7(Life公司合成)、捕获探针(IDT公司定制)、Nuclease-free water(无核酸酶水，简称NFW，Life公司)等试剂。

上述现有的杂交捕获试剂盒组分较多，且需要现配现用，操作较繁琐，同时杂交时间长达16～72小时。此外，链霉亲和素磁珠经过65℃热洗之后，磁珠变得干燥，再使用洗液清洗时，磁珠粘壁现象严重，导致磁珠损失，进而使捕获效率和捕获文库均一性均有所降低，因此，目前市面上急缺杂交时间短且捕获性能好的试剂盒。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种快速杂交捕获试剂盒。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

一种杂交反应液，其特征在于，所述杂交反应液包括：海藻糖、吐温和甘油。

进一步地，所述杂交反应液还包括xGen Hybridization Buffer Enhancer、xGen2X Hybridization Buffer、捕获探针和NFW。

进一步地，所述杂交反应液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer的体积百分比为10～20％、所述xGen 2X Hybridization Buffer的体积百分比为40～60％、所述捕获探针的体积百分比为8～16％、所述海藻糖的质量百分比为1～20％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％、所述甘油的体积百分比为5～30％、所述NFW的体积百分比为2～10％。

进一步地，所述杂交反应液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer、所述xGen 2X Hybridization Buffer、所述捕获探针、所述吐温、所述甘油、和所述NFW的体积配比优选为270:850:200:5:200:75；所述海藻糖的质量百分比优选为5.88％。

本发明还涉及一种工作清洗液组合，其特征在于，所述清洗液组合包括洗液2和洗液3，且所述洗液2和洗液3其中至少一种包括吐温。

进一步地，所述清洗液组合还包括磁珠清洗液、洗液1和增强洗液。

进一步地，所述洗液2还包括xGen 10X wash buffer II、NFW。

进一步地，所述洗液2中，所述xGen 10X wash buffer II的体积百分比为5～15％、所述NFW的体积百分比为85～95％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％。

进一步地，所述洗液2中，所述xGen 10X wash buffer II、所述NFW和所述吐温的体积配比优选为160:1440:4。

进一步地，所述洗液3还包括xGen 10X wash buffer III、NFW。

进一步地，所述洗液3中，所述xGen 10X wash buffer III的体积百分比为5～15％、所述NFW的体积百分比为85～95％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％。

进一步地，所述洗液3中，所述xGen 10X wash buffer III、所述NFW和所述吐温的体积配比优选为160:1440:4。

进一步地，所述磁珠清洗液包括xGen 2X Beads wash buffer和NFW。

进一步地，所述磁珠清洗液中，所述xGen 2X Beads wash buffer的体积百分比为40～60％，所述NFW的体积百分比为40～60％。

进一步地，所述磁珠清洗液中，所述xGen 2X Beads wash buffer和所述NFW的体积配比优选为160:160。

进一步地，所述洗液1包括xGen 10X wash buffer I和NFW。

进一步地，所述洗液1中，所述xGen 10X wash buffer I的体积百分比为5～15％，所述NFW的体积百分比为85～95％。

进一步地，所述洗液1中，所述xGen 10X wash buffer I和所述NFW的体积配比优选为28:252。

进一步地，所述增强洗液包括xGen 10X stringent wash buffer和NFW。

进一步地，所述增强洗液中，所述xGen 10X stringent wash buffer的体积百分比为5～15％，所述NFW的体积百分比为85～95％。

进一步地，所述增强洗液中，所述xGen 10X stringent wash buffer和所述NFW的体积配比优选为32:288。

本发明还涉及一种快速杂交捕获试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如上所述的杂交反应液和/或如上所述的清洗液组合。

进一步地，所述试剂盒还包括一种封闭液，所述封闭液包括Human Cot DNA、Universal Blockers-TS Mix、甘油。

进一步地，所述封闭液中，所述Human Cot DNA的体积百分比为45～55％、所述Universal Blockers-TS Mix的体积百分比为15～25％、所述甘油的体积百分比为5～30％。

进一步地，所述封闭液中，所述Human Cot DNA、所述Universal Blockers-TS Mix和所述甘油的体积配比优选为5:2:3。

进一步地，所述试剂盒还包括一种PCR引物混合液，所述引物混合液包括LibraryAmplification Primer P5+P7和NFW。

进一步地，所述试剂盒还包括一种磁珠重悬液，所述磁珠重悬液包括：xGenHybridization Buffer Enhancer、xGen 2X Hybridization Buffer、吐温、甘油、NFW。

进一步地，所述磁珠重悬液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer的体积百分比为10～20％、所述xGen 2X Hybridization Buffer的体积百分比为40～60％、所述NFW的体积百分比为18～28％、所述甘油的体积百分比为5～30％、所述吐温的体积百分比为0.1～0.5％。

进一步地，所述磁珠重悬液中，所述xGen Hybridization Buffer Enhancer、所述xGen 2X Hybridization Buffer、所述NFW、所述甘油和所述吐温的体积配比优选为270:850:375:200:5。

本发明还涉及一种采用如上所述的试剂盒捕获文库方法包括以下步骤：

S1、文库封闭与浓缩；

S2、文库杂交；

S3、洗涤富集。

进一步地，所述步骤S1包括在待捕获文库中加入所述封闭液，混匀后用真空浓缩仪抽干。

进一步地，所述步骤S2包括将所述杂交反应液加入到抽干管中，混匀后静置10min，置于PCR仪上进行杂交反应。

进一步地，所述杂交反应包括：

在95℃条件下，反应5min，循环一次；

在95℃条件下，反应1min，循环30次，每个循环温度降低1℃；

在65℃条件下，反应30min，循环一次；

在65℃条件下，保温反应，循环一次。

进一步地，所述步骤S3包括以下子步骤：

S31、采用所述磁珠清洗液清洗链霉亲和素磁珠；

S32、采用所述磁珠重悬液重悬所述磁珠，并将所述重悬磁珠置于所述步骤S2杂交反应后得到的杂交液中孵育；

S33、分别采用所述洗液1、所述增强洗液、所述洗液2、所述洗液3清洗所述磁珠；

S34、采用所述PCR引物混合液重悬所述磁珠，并进行PCR反应；

S35、将所述PCR产物进行纯化，对捕获文库进行分析。

本发明的有益效果为：

采用本发明所述一种快速杂交捕获试剂盒，通过改进试剂盒的组分，简化了试剂盒的实验流程，且通过对杂交方式的改进，使杂交捕获时间缩短了约14h；同时采用优化的洗液2和洗液3的配方，有效改善了链霉亲和素磁珠粘壁现象，减少了链霉亲和素磁珠清洗过程中因粘壁而造成的损失，提高了捕获文库的浓度，并有效改善了杂交捕获效率和文库的均一性；此外试剂盒组分中稳定剂和保护剂的添加，使试剂盒可以长期室温稳定保存，使用方便。

附图说明

图1为本发明实施例提供的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒采用不同杂交方式的捕获效率示意图。

图2为本发明实施例提供的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒采用不同杂交方式的捕获文库均一性示意图。

图3为本发明实施例提供的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒洗液配方优化前后的捕获文库浓度示意图。

图4为本发明实施例提供的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒洗液配方优化前后的捕获效率示意图。

图5为本发明实施例提供的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒洗液配方优化前后的捕获文库均一性示意图。

图6为本发明实施例提供的快速杂交捕获试剂盒加速试验中捕获文库浓度示意图。

图7为本发明实施例提供的快速杂交捕获试剂盒加速试验中捕获效率示意图。

图8为本发明实施例提供的快速杂交捕获试剂盒加速试验中捕获文库均一性示意图。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。

杂交捕获效率和文库均一性都是测序结果分析的重要指标。

杂交捕获效率表示测序数据中有效数据的比例，捕获效率越高意味着有效数据越多，有效数据越多意味着达到变异检测需要的总的测序数据量越少。

文库均一性是指覆盖均一性，指的是测序数据在基因组或目标区域内的分布均一程度。二代测序要求位点有足够高的绝对深度才可以判断检测的准确性，如果均一性好的话，不同区域的测序深度就越均匀，那么获得预期测序深度的数据量就会越小，会减少测序费用；反之，如果均一性不好，会极大的加大测序费用。

杂交捕获效率和捕获文库均一性受多种因素的影响。杂交捕获试剂盒中封闭试剂、杂交温度、清洗操作、捕获磁珠、Panel大小、PCR循环数等都对这两个指标有影响。本发明主要通过改进杂交温度和清洗操作来改善试剂盒杂交捕获效率和捕获文库均一性。

为了方便区分，本发明实施例中将使用建库试剂盒(如IDT xGen Prism DNAlibrary prep Kit)构建的未经捕获的文库称为“基因组DNA文库”；将“基因组DNA文库”进行捕获后获得的文库称为“捕获文库”。

对比例1使用IDT xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒捕获文库

以IDT公司的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒为本发明的对比例。该试剂盒的组分主要包括：Human Cot DNA、2x Hybridization Buffer、Hybridazation Buffer Enhancer、2xBeads Wash Buffer、10xWash Buffer I、10xWashBuffer II、10xWash Buffer III、10xStringent Wash Buffer、链霉亲和素磁珠M-270，另外购买AMPure XP beads(Beckman公司)、IDTE(IDT公司)、Universal Blockers-TS Mix(IDT公司)、KAPA HiFi Hotstart Readymix(Roche公司)、Library Amplification PrimerP5+P7(Life公司合成)、Probe(IDT公司定制)、Nuclease-free water(简称NFW，Life公司)。

其捕获文库流程如下：

1.文库封闭与浓缩

在400ng待捕获文库中加入7μL表1所示的封闭液，混匀后用真空浓缩仪抽干。

表1 封闭液

2.文库杂交

取17μL表2所示的杂交组分加入到上述抽干管中，混匀后静置10min。

表2 杂交组分

置于PCR仪上运行如表3所示的杂交程序：

表3 杂交程序

3.洗涤富集

按照表4配置1X工作液：

表4 1X工作液

将链霉亲和素磁珠平衡至室温，按照表5配置链霉亲和素磁珠磁珠重悬液：

表5 链霉亲和素磁珠磁珠重悬液

(1)取50μL平衡至室温的链霉亲和素磁珠，加入100μL1x Beads Wash Buffer，混匀后置于磁力架，磁珠完全分离后，去掉上清，同样的方式再清洗所述磁珠两次。

(2)用17μL表5所示的磁珠重悬液重悬磁珠，待杂交程序结束后，将重悬磁珠全部加入杂交结束后的杂交液中，涡旋震荡混匀然后放回PCR仪上在65℃条件下继续孵育45分钟，期间每15min涡旋混匀一次。

(3)孵育结束后，将100μL预热65℃的表4所示的1x Wash BufferⅠ加入到上述杂交液中，混匀后置于磁力架。磁珠完全分离后，立即去掉上清，然后加入150μL预热65℃的1xStringent Wash Buffer，混匀后置于磁力架，磁珠完全分离，立即去掉上清，同样的方式用150μL预热65℃的1x Stringent Wash Buffer重复清洗一次。

(4)加入室温保存的150μL表4所示的1x Wash Buffer I，涡旋震荡30s，静置30s，2min后短暂离心，然后静置于磁力架上，磁珠完全分离后去掉上清，然后以同样的方式依次用室温保存的150μL 1x Wash Buffer II、150ul 1x Wash Buffer III清洗磁珠。

(5)加入20μL NFW重悬所述磁珠，并加入表6所示的30ul PCR扩增试剂，总体积50ul。

表6 扩增试剂

PCR仪上运行如表7所示的程序：

表7 PCR反应程序

所述PCR产物用75μL AMpure XP Beads(1.5X)进行纯化，对捕获文库进行Qubit定量及片段大小分析。

实施例1使用快速杂交捕获试剂盒进行文库捕获

本发明是一种快速杂交捕获试剂盒，使用IDT公司的xGen Hybridization andWash Kit杂交捕获试剂盒的各试剂组分及其它商业化的试剂组分(如LibraryAmplification Primer P5+P7、NFW等)，选择其中特定的试剂组分预先进行混合，并添加海藻糖、吐温和/或甘油等组分，构成各个预混试剂(如封闭液、杂交反应液、磁珠清洗液、增强洗液、洗液1、洗液2、洗液3、磁珠重悬液、PCR引物混合液等)。具体如表8所示。

表8 试剂盒组分

采用本发明所述试剂盒捕获文库流程如下：

1.文库封闭与浓缩

在400ng待捕获文库中加入10μL所述封闭液，混匀后用真空浓缩仪抽干。

2.文库快速杂交

取17μL表8所示的杂交反应液加入到上述抽干管中，混匀后静置10min，置于PCR仪上运行如表9所示的杂交程序(touchdown循环30次，每个循环温度降低1℃，总杂交时间约1小时15分钟)：

表9 快速杂交程序

3.洗涤富集

(1)取50μL平衡至室温的链霉亲和素磁珠，加入100μL表8所示的磁珠清洗液，混匀后置于磁力架，磁珠完全分离后，去掉上清，同样的方式再清洗所述磁珠两次。

(2)用17μL表8所示的磁珠重悬液重悬所述磁珠，待杂交程序结束后，将重悬磁珠全部加入杂交结束后的杂交液中，涡旋震荡混匀然后放回PCR仪上在65℃条件下继续孵育45分钟，期间每15min涡旋混匀一次。

(3)孵育结束后，将100μL预热65℃的表8所示的洗液1加入到上述杂交液中，混匀后置于磁力架。所述磁珠完全分离后，立即去掉上清，然后加入150μL预热65℃的表8所示的增强洗液，混匀后置于磁力架，所述磁珠完全分离，立即去掉上清，同样的方式用150μL预热65℃的所述增强洗液重复清洗一次。

(4)加入室温保存的150μL所述洗液1，涡旋震荡30s，静置30s，2min后短暂离心，然后静置于磁力架上，所述磁珠完全分离后去掉上清，然后以同样的方式依次用室温保存的150μL表8所示的洗液2、150μL表8所示的洗液3清洗所述磁珠。

(5)加入25μL表8所示的PCR引物混合液重悬所述磁珠，然后加入25μL KAPA HiFiHotstart Readymix，混匀后PCR仪上运行如表10所示的程序：

表10 PCR反应程序

所述PCR产物用75μL AMpure XP Beads(1.5X)进行纯化，对捕获文库进行Qubit定量及片段大小分析。

实施例2杂交方式的优化

根据IDT杂交捕获试剂盒说明，由于选择panel的不同，为了保证捕获效率，杂交时间一般选择16h。常规的实验操作是按照对比例1表3设置的杂交程序，在65℃条件下过夜杂交(16h)，这就导致杂交捕获时间的延长。为了缩短杂交捕获时间，本发明对杂交程序进行了改进，使用实施例1表9所示的touchdown的快速杂交方式，在减少非特异杂交的基础上，保证了杂交捕获效率的同时缩短了杂交时间，仅需要大约1小时15分钟即可完成杂交程序。

使用IDT xGen Prism DNA library prep Kit建库试剂盒构建的基因组DNA文库进行杂交捕获实验，文库信息如下：

以IDT公司的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒为例进行不同杂交方式的测试：采用对比例1所示的文库捕获流程(包含表3所示的杂交程序)，杂交时间分别为16h(65℃-16h)和4h(65℃-4h)；将对比例1所示的文库捕获流程中的杂交程序改变为表9所示的快速杂交程序进行文库杂交捕获，其他条件保持不变，对捕获文库进行测序分析。

从图1所示的捕获效率(上靶率)和图2所示捕获文库均一性(均一性)的测试结果可以看出，在同一文库条件下，使用IDT公司的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒，分别采用65℃-16h杂交方式和表9所示的touchdown的快速杂交两种杂交方式，捕获效率和捕获文库均一性无明显差异，且两者都优于65℃-4h的杂交方式，表明采用表9所示的touchdown的快速杂交的方式，可以在保证更好的捕获效率和捕获文库均一性的情况下，大大缩短了杂交时间。

实施例3洗液配方的优化

采用目前市面上的杂交捕获试剂盒实验过程中发现，链霉亲和素磁珠经过65℃热洗之后，磁珠变得干燥，再通过Wash Buffer II和Wash Buffer III清洗时，磁珠粘壁现象严重，导致了磁珠的损失。

同样使用上述IDT xGen Prism DNA library prep Kit建库试剂盒构建的基因组DNA文库进行杂交捕获实验，并以IDT公司的xGen Hybridization and Wash Kit杂交捕获试剂盒为例进行洗液配方优化前后的测试，采用对比例1的文库捕获流程，将表4所示的Wash Buffer II优化为表8所示的洗液2，将表4所示的Wash Buffer III优化为表8所示的洗液3，其他试剂及文库捕获程序条件保持不变，对捕获文库进行定量并送测序分析。

从图3所示的捕获文库浓度、图4所示的捕获效率及图5所示的捕获文库均一性的测试结果可以看出，通过采用本发明优化的洗液2和洗液3的配方，有效的减少了清洗过程中链霉亲和素磁珠粘壁现象，提高了捕获文库浓度，同时捕获效率和捕获文库均一性也均有一定程度的提高。

实施例4快速杂交捕获试剂盒加速实验

为了考察改进的快速杂交捕获试剂盒的稳定性，将本发明实施例1所示的试剂盒在25℃条件下放置120天后，按照实施例1所示的快速杂交程序进行文库捕获。同时设置-20℃条件下保存的对比例1所示的IDT捕获试剂盒(xGen Hybridization and Wash Kit)为正常对照(Normal)按照对比例1所示的杂交程序进行文库捕获；在-20℃条件下正常保存的本发明实施例1所示的快速杂交捕获试剂盒作为Control按照实施例1的快速杂交程序进行文库捕获。测试本发明试剂盒在25℃条件下保存120天(25T120D)后的实验结果，选择IDTxGen Prism DNA library prep Kit建库试剂盒构建gDNA和FFPE样本文库作为实验用基因组DNA文库，文库信息如下：

对捕获文库进行定量并测序分析，实验结果如图6、图7、图8所示。

从图6所示的捕获文库浓度、图7所示的捕获效率及图8所示的捕获文库均一性的测试结果可以看出，本发明的快速杂交试剂盒在25℃保存120天(25T120D)后，捕获文库浓度、捕获效率以及文库均一性与Control相比无明显差异；且都比正常对照(Normal)试剂盒高，说明本发明快速杂交捕获试剂盒的稳定性较好，同时也再次证明了在有效缩短了杂交时间的情况下，快速杂交捕获试剂盒仍然具有较好的性能。

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。