一种外生菌根真菌分离培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及真菌培养技术领域，具体涉及一种外生菌根真菌分离培养基及其制备方法。

背景技术

外生菌根真菌是一类与宿主植物根系共生并有益于植物生长发育的高等真菌，具有较强的生态适应性和可塑性，可以提高宿主植物的抗病性和抗逆性。外生菌根菌是真菌与高等植物的根部形成的菌根合体，宿主和菌根菌的代谢产物经过哈氏网的网络作双向运转。我国有外生菌根的主要树木有栎、松、柳、椴、枫、胡桃及桦科等；外生菌根真菌中有许多是珍贵的食用菌，如：牛肝菌、松茸(松口蘑)、松乳菇等经常出现于松林及栎林。这种具有共生共栖作用的菌根菌，具有明显的经济效益和环境效益。不仅木材的产量提高40％，而且还能提供大量美味可口的蘑菇。

有些外生菌根真菌有药用价值，且难分离，如有硬皮地星，花脸香蘑，小笠原须腹菌等；目前外生菌根真菌最常用的分离培养基为MMN培养基，但是对少数外生菌根真菌分离有难度，菌丝生长慢，生物量小，分离难度大。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种外生菌根真菌分离培养基及其制备方法，制备得到的分离培养基能够促进外生菌根真菌的菌丝体生长，提高了分离效率。

本发明的第一个目的是提供一种外生菌根真菌分离培养基，每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁300-500mL、葡萄糖10-20g、酵母粉3-5g、蛋白胨3-5g、氯化铁0.01-0.03g、维生素B

进一步地，每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁400mL、葡萄糖18g、酵母粉4g、蛋白胨4g、氯化铁0.02g、维生素B

进一步地，每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁300mL、葡萄糖20g、酵母粉5g、蛋白胨5g、氯化铁0.01g、维生素B

进一步地，每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁500mL、葡萄糖10g、酵母粉3g、蛋白胨3g、氯化铁0.03g、维生素B

进一步地，每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁450mL、葡萄糖15g、酵母粉3.5g、蛋白胨3.5g、氯化铁0.02g、维生素B

进一步地，所述马铃薯汁的制备过程为：将马铃薯削皮切成块加蒸馏水，马铃薯蒸馏水的用量比为200-300g:800-900mL，煮至马铃薯将烂时过滤，获得滤液即为马铃薯汁。

本发明的第二个目的是提供上述外生菌根真菌分离培养基的制备方法，包括如下步骤：

S1，马铃薯汁的制备：将马铃薯削皮切成块加蒸馏水，马铃薯和蒸馏水的用量比为200-300g:800-900mL，煮至马铃薯将烂时过滤，获得滤液即为马铃薯汁；

S2，在100mL蒸馏水中按量加入葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、氯化铁和维生素B

进一步地，S1中，所述马铃薯和蒸馏水的用量比为300g:900mL。

进一步地，S1中，利用两层纱布过滤。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明制备得到的外生菌根真菌分离培养基能够从黄山松共生的柳氏硬皮地星(Astraeus ryoocheoninii)S01，日本冷杉共生的花脸香蘑(Lepista sordida)S02和马尾松共生的小笠原须腹菌(Rhizopogon boninensis)S2021021分离出外生菌根真菌，且分离能力强，能够有效抑制杂菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1表示本发明中从柳氏硬皮地星S01子实体分离到的菌株情况；

其中，图A为柳氏硬皮地星S01的子实体；

图B为从柳氏硬皮地星S01子实体分离到的真菌菌落；

图2表示本发明中从花脸香蘑S02子实体分离到的菌株情况；

其中，图A为花脸香蘑S02的子实体；

图B为从花脸香蘑S02的子实体分离到的真菌菌落；

图3表示本发明中从小笠原须腹菌S2021021子实体分离到的菌株情况；

其中，图A为小笠原须腹菌S2021021子实体；

图B为从小笠原须腹菌S2021021子实体分离获得的真菌菌落；

图4表示本发明中从彩色豆马勃S2021202子实体分离到的菌株情况；

其中，图A为彩色豆马勃S2021202子实体；

图B为从彩色豆马勃S2021202子实体分离到的菌株菌落。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1：

本实施例提供了一种外生菌根真菌分离培养基及其制备方法

一、材料和方法

1、供试菌株

2020年6月采集自庐山国家级自然保护区黄山松共生的柳氏硬皮地星(Astraeusryoocheoninii)S01；

2020年9月采集自庐山国家级自然保护区日本冷杉共生的花脸香蘑(Lepistasordida)S02；

2021年7月采集自庐山市白鹿镇观音桥马尾松共生的小笠原须腹菌(Rhizopogonboninensis)S2021021；

2021年9月采集自庐山西海彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)S2021202；

2、培养基

(1)PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、加蒸馏水定容至1000ml；

(2)MMN培养基：氯化钠0.025g，葡萄糖10.0g，磷酸二氢钾0.5g，麦芽浸粉3.0g，维生素B1 0.1mg，氯化钙0.05g，磷酸氢二铵0.25g，氯化铁0.012g，七水硫酸镁0.15g；

(3)本发明制备的培养基(外生菌根真菌分离培养基)；

3、实验方法

每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁400mL、葡萄糖18g、酵母粉4g、蛋白胨4g、氯化铁0.02g、维生素B

具体制备步骤为：

S1，马铃薯汁的制备：将马铃薯削皮切成块加蒸馏水，马铃薯和蒸馏水的用量比为300g:700mL，煮至马铃薯将烂时过滤，获得滤液即为马铃薯汁；

S2，在100mL蒸馏水中按量加入葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、氯化铁和维生素B

实施例2：

本实施例提供一种外生菌根真菌分离培养基及其制备方法

每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁300mL、葡萄糖20g、酵母粉5g、蛋白胨5g、氯化铁0.01g、维生素B

具体制备步骤为：

S1，马铃薯汁的制备：将马铃薯削皮切成块加蒸馏水，马铃薯和蒸馏水的用量比为200g:800mL，煮至马铃薯将烂时过滤，获得滤液即为马铃薯汁；

S2，在100mL蒸馏水中按量加入葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、氯化铁和维生素B

实施例3

本实施例提供一种外生菌根真菌分离培养基及其制备方法，具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：

每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁500mL、葡萄糖10g、酵母粉3g、蛋白胨3g、氯化铁0.03g、维生素B

实施例4

本实施例提供一种外生菌根真菌分离培养基及其制备方法，具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：

每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁500mL、葡萄糖13g、酵母粉3g、蛋白胨5g、氯化铁0.02g、维生素B

实施例5

本实施例提供一种外生菌根真菌分离培养基及其制备方法，具体步骤与实施例1基本相同，区别在于：

每1000mL所述外生菌根真菌分离培养基由以下组分制成：

马铃薯汁500mL、葡萄糖16g、酵母粉5g、蛋白胨4g、氯化铁0.03g、维生素B

以上实施例1-5为本发明的具体实施例，用以上实施例1-6对本发明采集的菌进行外生菌根真菌，记录分离过程。

表1本发明从S01分离的外生菌根真菌数量和杂菌数量(株)

表2本发明从S02分离的外生菌根真菌数量和杂菌数量(株)

表3本发明从S2021021分离的外生菌根真菌数量和杂菌数量(株)

表4本发明从S2021202分离的外生菌根真菌数量和杂菌数量(株)

表5不同培养基从不同分离对象分出的真菌情况

由表1-表5可知，本发明制备的外生菌根真菌分离培养基能够从柳氏硬皮地星S01子实体分离获得菌株，菌丝团直径4.41cm，菌丝绒毛状，呈赭褐色，生长较快(图1)，而从PDA和MMN上没有分离出菌株；

本发明制备的外生菌根真菌分离培养基能够从花脸香蘑S02子实体分离获得菌株，菌丝团直径5.59cm，菌丝致密，初期呈淡紫色，赭褐色，菌落不规则、放射状(图2)；从PDA上虽然也分离出了菌株，但是菌丝团直径为3.22cm，且菌丝疏松；利用MMN培养基没有在柳氏硬皮地星S01子实体上分离出菌株；

本发明制备的外生菌根真菌分离培养基能够从小笠原须腹菌S2021021子实体分离获得菌株，菌丝团直径4.70cm，菌丝疏松，呈白色，菌落圆形，较为规则(图3)，但是用PDA和MMN没有分离出菌株；

本发明制备的外生菌根真菌分离培养基能够从彩色豆马勃S2021202上子实体分离获得菌株，菌丝团直径4.86cm，菌丝致密，呈黄褐色，菌落圆形，较为规则(图4)，在PDA和MMN上也可以分离出菌株，但是菌丝团直径只有3.93-4.06cm，且菌丝疏松，菌株长势远远低于本发明的培养基。

综上所述，本发明制备的外生菌根真菌分离培养基能够特异性的从小笠原须腹菌S2021021子实体和柳氏硬皮地星S01子实体上分离获得菌株，且菌丝长势好；本发明制备的外生菌根真菌分离培养基上从花脸香蘑S02子实体和彩色豆马勃S2021202上分离的菌株长势远远优于PDA培养基，无法利用MMN培养基从花脸香蘑S02子实体上分离菌株。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。