一种产生内源性脑源性营养生长因子的产品和方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产生内源性脑源性营养生长因子的产品和方法。

背景技术

阿尔兹海默症又叫老年痴呆症，是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为进行性认知功能下降，随着全世界老龄化人群的快速增加，阿尔兹海默症患者数量逐年剧增，传统治疗理论是清除β淀粉样蛋白，但是目前这种清除β淀粉样蛋白的方法在临床上一直失败，因此，迫切寻求寻一种新的治疗方法。脑源性营养生长因子(BDNF)在治疗阿尔兹海默症有显著的效果，但是现有使用的脑源性营养生长因子通过外源性给药的方法或者通过基因编辑在脑内产生脑源性营养生长因子的有很多缺点。外源性给与脑源性营养生长因子存在半衰期短，在血液和脑脊液里被快速代谢，比较困难达到目标脑区，同时由于亲和性较高，很难在脑区内扩散。通过基因编辑在脑内产生脑源性营养生长因子的方法存在蛋白表达量不受控制，作用时间长且不受控制，空间特异性差等缺点。

发明内容

针对现有技术中脑源性营养生长因子半衰期短，脑区扩散困难，表达量不易控制，时空特异性差等问题。本发明提供了一种产生内源性脑源性营养生长因子的方法，可即时产生且发挥效果，在任何时间都可进行操控释放，时间控制精度可达毫秒级别，同时可操控目标脑区，空间精度高，时空特异性高，产生的内源性脑源性营养生长因子亲和性高，作用效果更好。

本发明一个方面提供了一种携带化学敏感蛋白或光敏感蛋白基因的病毒载体在制备控制内源性脑源性营养生长因子在脑区内释放或提高内源性脑源性营养生长因子在脑区内浓度的试剂中的用途。

进一步地，光敏感蛋白基因选自ChR2；化学敏感蛋白基因选自hM3dq。

进一步地，病毒载体选自腺相关病毒。

在一个具体的实施例中，所述的携带光敏感蛋白基因的病毒载体为腺相关病毒AAV-Camk2-ChR2-mCherry,携带化学敏感蛋白基因的病毒载体为腺相关病毒AAV-Camk2-hM3dq-mCherry。

进一步地，所述脑区选自能够释放内源性脑源性营养生长因子的上游脑区相对应的下游脑区。

进一步地，所述上游脑区选自丘脑室旁核，其相对应的下游脑区选自外侧内嗅皮层。

进一步地，所述上游脑区和下游脑区之间存在功能上和解剖学上的映射连接关系。

本发明另一个方面提供了制备控制内源性脑源性营养生长因子在脑区内释放的工具组，所述工具组中包含上述携带化学敏感蛋白或光敏感蛋白基因的病毒载体和刺激激活工具。

所述刺激激活工具选自用于植入脑部的光纤、用于激活化学敏感蛋白的化学物质，或者用于刺激神经元产生活动度的电极。

进一步地，所述工具组中还包含能够刺激光敏感基因对应光敏蛋白的激发光源。

进一步地，化学敏感蛋白基因选自hM3dq时，激活化学敏感蛋白的化学物质选自氧化氯氮平。

进一步地，所述激发光源能够发射473nm的蓝色激光。

本发明再一个方面提供了上述工具组在制备控制内源性脑源性营养生长因子在脑区内释放或提高内源性脑源性营养生长因子在脑区内浓度的医疗器械中的用途。

本发明再一个方面提供了一种产生内源性脑源性营养生长因子的方法，所述方法包括以下步骤：

S11)在上游脑区布置光纤；

S12)在上游脑区内注射包含携带光敏感蛋白基因的病毒载体的制剂；

S13)采用激发光源发射激光以启动下游脑区内源性脑源性营养生长因子的释放。

进一步地，所述的上游脑区选自丘脑室旁核。

进一步地，所述的下游脑区选自外侧内嗅皮层。

进一步地，激发光源发射激光为473nm的蓝色激光。

进一步地，携带光敏感蛋白基因的病毒载体中光敏感蛋白基因选自ChR2。

进一步地，携带光敏感蛋白基因的病毒载体中的病毒载体选自腺相关病毒。

本发明再一个方面提供了一种产生内源性脑源性营养生长因子的方法，所述方法包括以下步骤：

S21)在上游脑区内注射包含携带化学敏感蛋白基因的病毒载体的制剂；

S22)在上游脑区布置电极或释放激活化学敏感蛋白的化学物质，以启动下游脑区内源性脑源性营养生长因子的释放；

进一步地，所述的上游脑区选自丘脑室旁核。

进一步地，所述的下游脑区选自外侧内嗅皮层。

进一步地，病毒载体中化学敏感基因选自hM3dq。

上述方法为非诊断或治疗目的的。

本发明提供了一种产生内源性脑源性营养生长因子的方案，主要通过给机体大脑一定波长的光照特异性操控基因编辑的神经元细胞的方式，释放内源性脑源性营养生长因子，整体方案能即时发挥效果，可在任何时间进行操控，时间控制精度可达毫秒级别，同时可操控任何空间的目标脑区，空间精度高，具有时空特异性。

有益效果

本方法可在任何时间进行操控产生内源性脑源性营养生长因子，产生内源性脑源性营养生长因子具有即时性，不会被快速代谢，可控制作用时间，同时可在空间上精准操控产生内源性脑源性营养生长因子，且可控制表达量，作用效果好。

附图说明

图1内源性脑源性营养生长因子释放实验方案示意图。

其中，A逆向示踪染料霍乱毒素B亚基(Cholera Toxin Subunit B，CTB)注射到外侧内嗅皮层(LEC)示意图；B示踪病毒(AAV-Camk2-mCherry)注射到外侧内嗅皮层(PVT)示意图；C光遗传学病毒(AAV-Camk2-ChR2-mCherry)注射到丘脑室旁核和记录电极埋置在外侧内嗅皮层(LEC)示意图；D光遗传学病毒(AAV-Camk2-ChR2-mCherry)注射到丘脑室旁核和光纤埋置在丘脑室旁核示意图。

图2为逆向示踪染料霍乱毒素B亚基(Cholera Toxin Subunit B，CTB)注射到外侧内嗅皮层(LEC)和被逆向示踪到的上游脑区神经元的荧光表达图。

图3为示踪病毒(AAV-Camk2-mCherry)注射到外侧内嗅皮层(LEC)荧光表达图。

图4为原位杂交技术研究不同脑区脑源性营养生长因子的表达。

图5为光遗学技术流程图。

其中，A光敏感蛋白ChR2基因序列插入到腺相关病毒载体上；B腺相关病毒注射到丘脑室旁核示意图；C在小鼠丘脑室旁核上光纤埋置示意图；D神经元兴奋时Na

图6为膜片钳技术记录到的电流发放。

图7为光遗传学病毒(AAV-Camk2-ChR2-mCherry)注射到丘脑室旁核荧光表达图。

图8为Western blot检测到外侧内嗅皮层的内源性脑源性营养生长因子表达图。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1确定外侧内嗅皮层和丘脑室旁核神经元的投射关系

通过使用逆行示踪染料霍乱毒素B亚基(Cholera Toxin Subunit B，CTB)注射到小鼠外侧内嗅皮层，实验方案如图1A所示，然后观察上游脑区的示踪染料分布情况。

实验结果见图2，实验结果显示多个上游脑区观察到示踪染料分布，例如丘脑室旁核、丘脑室内侧核、梨状皮层和杏仁核等。其中丘脑室旁核的示踪染料分布最为密集。

然后将顺向示踪病毒(AAV-Camk2-mCherry)注射到小鼠丘脑室旁核，实验方案如图1B所示，然后观察下游脑区的荧光表情分布情况，以确定丘脑室旁核兴奋性神经元是否投射到下游脑区外侧内嗅皮层。实验结果见图3，在注射示踪病毒(AAV-Camk2-mCherry)后，外侧内嗅皮层能够观察到大量与丘脑旁核相同的荧光标签。

上述实验结果证明，丘脑室旁核与外侧内嗅皮层之间存在直接投射关系。

实施例3筛选能够表达脑源性营养生长因子的上游脑区

首先采用原位杂交的方法确定脑源性营养生长因子的表达的情况。

实验结果见图4，丘脑室旁核的原位杂交实验结果说明丘脑室旁核兴奋性神经元有丰富脑源性营养生长因子的表达。

实施例3验证上下游脑区功能连接性实验

如图1C和D所示，随后采用光遗传学和电生理学技术分析上下游脑区在功能上是否存在连接关系。光遗传学的技术流程如图5所示。首先制备携带光敏感基因的病毒，本实施例中采用的是包含光敏感基因Channelrhodopsin-2的腺相关病毒AAV-Camk2-ChR2-mCherry。在小鼠上游脑区丘脑室旁核部位注射携带光敏感基因的病毒AAV-Camk2-ChR2-mCherry，然后在小鼠外侧内嗅皮层部位给予473nm波长的光刺激，并使用膜片钳记录外侧内嗅皮层脑区的神经元电信号。

实验结果见图6，实验结果显示了在外侧内嗅皮层神经元轴突末梢有神经元电信号的变化，这是由于注射在丘脑室旁核部位的带光敏基因的病毒能够在丘脑室旁核兴奋性神经元内表达光敏感蛋白。同时，在丘脑室旁核下游的外侧内嗅皮层神经元轴突末梢也会表达有光敏感蛋白，在轴突末梢给予473nm波长的光刺激，轴突末梢上的离子通道外侧的阳离子Na

实施例4光刺激上游脑区释放脑源性营养生长因子到下游脑区的实验

在丘脑室旁核注射携带光敏感基因Channelrhodopsin-2的病毒载体AAV-Camk2-ChR2-mCherry，然后将光纤植入到丘脑室旁核兴奋性神经元上方，遗传学病毒(AAV-Camk2-ChR2-mCherry)注射到丘脑室旁核荧光表达图见图7，然后以473nm的蓝色激光通过光纤管道传入到丘脑室旁核的表达光敏感蛋白的兴奋性神经元上，以Western blot检测下游脑区外侧内嗅皮层的内源性脑源性营养生长因子表达。实验方法示意图见图1D。

同时设置对照组，实验方法仅在于将AAV-Camk2-ChR2-mCherry替换为AAV-ChR2-mCherry。

实验结果见图8，实验结果显示相对于注射AAV-ChR2-mCherry，但是没有给光的对照组，实验组中外侧内嗅皮层的内源性脑源性营养生长因子释放量大幅提高，是对照组的2倍，具有显著性差异。这说明丘脑室旁核兴奋性神经元被光刺激兴奋时，释放脑源性营养生长因子到下游脑区外侧内嗅皮层。这说明通过本发明的方法，能够将脑源性营养生长因子的表达高的脑区中的脑源性营养生长因子释放到下游脑区外侧内嗅皮层，用于营养和保护外侧内嗅皮层神经元。