一种双特异性抗体的纯化方法
文献发布时间:2024-04-18 19:58:30
本申请要求申请日为2021年04月23日的中国专利申请202110442397X、申请日为2022年4月13日的中国专利申请2022103882003的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
本发明涉及抗体纯化技术领域,特别涉及一种双特异性抗体尤其是BCMA×CD3双特异性抗体的纯化方法。
双特异性抗体(简称双抗)是指可以同时结合两个不同的表位或抗原的抗体,能够发挥两种单抗的协同作用,在临床前研究和临床治疗上可能比混合使用两个单抗更有优势。由于拥有独特的生物学机理,双特异性抗体已经成为抗体药物研发领域的一个重要分支,也是当下制药行业最热门的研发和投资方向之一。
然而在其飞速发展的同时,也面临着一系列难题,其中就包括制备工艺。本发明涉及的BCMA×CD3双抗是由三条多肽链组成的不对称结构,为了将具有错配的重链的副产物(例如抗CD3抗体的两条重链错配)形成最小化,使用了突变的异源二聚体Fc区,其携带“knob-hole”突变和改造的二硫键,如WO2009080251和WO2009080252中所述。然而,所有分子设计策略都只能尽量降低某类副产物的产生,而不能完全消除全部副产物。不仅如此,在双抗的重组表达过程中,还不可避免的会产生不完整的片段抗体以及聚集体。这一结论在工艺开发过程中也得到了应证,亲和层析捕获的蛋白在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测时,发现了十余种副产物条带。且这些副产物的生化特性与目标双抗极为相似,因此从中分离出目标双抗难度极大。
因此,本发明开发出一种目标双抗纯度高、收率高的适用于工艺放大的纯化方法具有重要意义。
发明内容
为了解决双特异性抗体的纯化工艺中副产物条带过多,副产物生化特性与目标双抗极为相似,导致从中分离出目标双抗难度极大,纯化过程中目标双抗损失严重,收率较低的难题,本发明提供了一种目标蛋白收率高、纯度高的双特异性抗体分离纯化方法,既能获得高纯度的目标双抗,又能极大的降低纯化过程中目标双抗的损失。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案之一为:提供一种利用两步层析来纯化蛋白的方法,所述方法包括亲和层析和复合模式阴离子交换层析;所述蛋白为双特异性抗体,其包括Fab结构的第一蛋白功能区和包含两个重链可变区VH结构的第二蛋白功能区;较佳地,两个重链可变区之间以(G
在一具体实施例中,所述双特异性抗体包括多肽链1、多肽链2和多肽链3,其中,所述多肽链1从N末端至C末端依次包括VL1-CL,所述多肽链2从N末端至C末端依次包括VH1-CH1-CH2-CH3,所述多肽链3从N末端至C末端依次包括VH2-VH2-CH2-CH3。
在一具体实施例中,所述VH1包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5、6和7所示;所述VL1包含LCDR1、LCDR2和LCDR3,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示;所述VH2包含HCDR1、HCDR2和HCDR3,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15、16和17所示,或如SEQ ID NO:20、21和22所示。
在一具体实施例中,所述VH1、VL1和VH2的氨基酸序列分别如SEQID NO:2、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14所示;
或,所述VH1、VL1和VH2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:19所示。
在一具体实施例中,所述多肽链1、多肽链2和多肽链3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:13所示;
或,所述多肽链1、多肽链2和多肽链3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:18所示。
在一具体实施例中,所述的亲和层析包括以下步骤:预平衡、上样、平衡和洗脱;所述预平衡以PBS为预平衡缓冲液,所述平衡以PBS为平衡缓冲液,所述洗脱以甘氨酸-盐酸为洗脱缓冲液。
优选地,所述亲和层析中,填料为Mabselect sure LX,和/或,层析柱为XK16/20。
在一具体实施例中,所述双特异性抗体的培养上清液在上样时载量为0.1~50mg/ml例如40mg/ml,流速例如为4.5ml/min;和/或,所述预平衡缓冲液使用2~10个柱体积例如5个柱体积,流速例如为10ml/min;和/或,所述平衡缓冲液的使用2~10个柱体积例如5个柱体积,流速例如为10ml/min;和/或,所述洗脱缓冲液为50~200mM例如100mM甘氨酸-盐酸,pH3.5,流速例如为5ml/min。
优选地,还包括使用醋酸灭活病毒的步骤;更优选灭活后中和样品pH至6.5~7.5例如7.0;进一步更优选地,所述中和样品使用1M Tris-HCl缓冲液、pH8.0进行。
在一具体实施例中,所述的复合模式阴离子交换层析包含以下步骤:预平衡、上样、平衡、淋洗和洗脱;其中,所述预平衡使用的预平衡缓冲液为PBS或Tris-HCl;和/或,所述平衡使用的平衡缓冲液为PBS或Tris-HCl;和/或,所述淋洗使用的淋洗缓冲液包括包含PBS或Tris-HCl的A液、包含精氨酸-盐酸的B液;和/或,所述洗脱使用的洗脱缓冲液包括组氨酸和天冬氨 酸。
优选地,所述的阴离子交换层析中,使用的填料为Capto adhere ImpRes;层析空柱为Tricorn 5/100;和/或,所述亲和层析捕获的双特异性抗体上样至层析柱,蛋白上样载量7mg/ml;和/或,所述A液包括20mM PBS、pH7.0,或20mM Tris-HCl、pH7.2;所述B液包括20mM PBS、pH7.0,1M精氨酸-盐酸,或20mM Tris-HCl、pH7.2,1M精氨酸-盐酸;和/或,所述淋洗和/或洗脱的流速为0.4ml/min。
在一具体实施例中,所述预平衡使用2~10个柱体积例如5个柱体积的预平衡缓冲液,所述的预平衡缓冲液为20mM PBS、pH7.0;和/或,所述平衡使用2~10个柱体积例如10个柱体积的平衡缓冲液,所述平衡缓冲液为20mM PBS、pH7.0;和/或,所述淋洗用A液和0~100%B液进行梯度淋洗,20个柱体积,所述A液包括20mM PBS、pH7.0,所述B液包括20mM PBS、pH7.0,1M精氨酸-盐酸;和/或,所述洗脱使用的洗脱缓冲液为10mM组氨酸和10mM天冬氨酸、pH5.0。
在一具体实施例中,所述的预平衡使用2~10个柱体积例如5个柱体积的预平衡缓冲液,所述预平衡缓冲液为20mM Tris-HCl、pH7.2;和/或,所述的平衡使用2~10个柱体积例如10个柱体积的平衡缓冲液,所述平衡缓冲液为20mM Tris-HCl、pH7.2;所述淋洗用30%~40%B液进行等度淋洗,淋洗20个柱体积,其中所述A液包括20mM Tris-HCl、pH7.2,所述B液包括20mM Tris-HCl、pH7.2,1M精氨酸-盐酸;和/或,所述洗脱使用的洗脱缓冲液为10mM组氨酸和10mM天冬氨酸、pH5.0。
在一具体实施例中,所述纯化方法还包括对所述亲和层析和/或所述复合模式阴离子交换层析获得的产物纯度进行分析的过程,所述分析过程包括分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC),其中流动相为包含15%乙腈的磷酸盐缓冲液;优选地,pH为7.4。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发 明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
1.复合模式阴离子层析淋洗步骤可一步清除约10种杂质,且不会淋洗出目的蛋白,目的蛋白几乎没有损失,在优选的技术方案中,经过0.4M精氨酸(40%的B液)或0.3M精氨酸(30%的B液)淋洗,样品由分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测的纯度由87%左右(复合模式阳离子层析)提升至95%以上;在优选的方案中,检测的纯度可达97%以上。
2.采用的Capto adhere ImpRes填料,基架同时兼具Capto介质的高流量高刚性特征和ImpRes的小粒度特征,能够在较高流速和较高柱床高度下运行并保持高分辨率,易放大生产。
3.通过在流动相中加入15%乙腈的方式对SEC-HPLC的方法进行优化,解决了优化前SEC-HPLC不能真实反应产品纯度的问题,优化后的方法峰形更对称,分辨率也有明显提高。
图1为亲和层析实验色谱图。
图2为阳离子层析色谱图。
图3为阳离子层析实验非还原SDS-PAGE结果图;其中,M:蛋白马克;L:亲和低PH孵育回调后的样品(阳离子上样样品),1:阳离子层析洗脱峰收集1,2:阳离子层析洗脱峰收集2,3:阳离子层析洗脱峰收集3,4:阳离子层析洗脱峰收集4,5:阳离子层析洗脱峰收集5,6:阳离子层析洗脱峰收集6;
图4为亲和洗脱峰以及阳离子层析洗脱主峰SEC-HPLC图。
图5为亲和洗脱峰以及阳离子层析洗脱主峰CE-SDS(NR)图。
图6为阴离子层析预实验层析图;(0-1M精氨酸线性梯度淋洗)。
图7为阴离子层析预实验非还原SDS-PAGE结果图;其中,M:蛋白马克,1:亲和低pH孵育回调后的样品(阴离子上样样品),2:阴离子层析线性梯度淋洗峰,3:阴离子层析洗脱峰。
图8为阴离子层析优化实验层析图-0.4M精氨酸淋洗。
图9为阴离子层析优化实验层析图-0.3M精氨酸淋洗。
图10为阴离子层析优化实验非还原SDS-PAGE结果图;其中,M:蛋白马克,1:亲和低pH孵育回调后的样品(阴离子上样样品),2:0.4M精氨酸淋洗峰,3:阴离子层析洗脱峰(0.4M精氨酸淋洗),4:0.3M精氨酸淋洗峰,5:阴离子洗脱峰(0.3M精氨酸淋洗)。
图11为阴离子层析前SEC-HPLC图。
图12为阴离子层析后SEC-HPLC图(0.4M精氨酸淋洗)。
图13为阴离子层析后SEC-HPLC图(0.3M精氨酸淋洗)。
图14为阴离子层析前后SDS-PAGE图。
图15为SEC-HPLC方法优化前后对比图。
图16为CD3-BCMA双特异性抗体的结构。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1 纯化对象
本发明的纯化对象为BCMA×CD3双特异性抗体,BCMA×CD3双特异性抗体可以同时结合两个靶点,其中一端可以识别肿瘤细胞表面特异表达的BCMA,而另一端可以结合T细胞上的CD3分子。当BCMA×CD3双抗分子结合到肿瘤细胞表面后,可以招募并激活肿瘤细胞附近的T细胞,从而杀死肿瘤细胞。
BCMA×CD3双特异性抗体的结构如图16所示。
对于每一个双特异性抗体,涉及三条蛋白链,其分别包含相应抗BCMA抗体的重链,以及上述抗CD3抗体的重链和轻链。为了将具有错配的重链(例如抗CD3抗体的两条重链错配)的副产物形成最小化,使用了突变的异源二聚体Fc区,其携带“knob-hole”突变和改造的二硫键,如WO2009080251和WO2009080252中所述。BCMA×CD3双特异性抗体为IgG1,具有Fc突变L234A和L235A(根据EU索引编号)。
通过同时共转染三个不同的哺乳动物表达载体产生每一个双特异性抗体,分别编码:1)相应的BCMA抗体的重链,其在Fc区携带“Hole”突变以产生异源二聚体抗体,Fc的CH3携带L234A、L235A突变。2)相应的CD3抗体的重链,其在Fc区携带“knob”突变以产生异源二聚体抗体,Fc的CH3携带L234A、L235A突变。3)相应的CD3抗体的轻链。人IgG1Fc区的“knob”突变由以下组成:T366W,“Hole”突变由以下组成:T366S、L368A、Y407V。此外,可以包括“knob”Fc区的S354C和“Hole”Y349C形成一对二硫键以增加稳定性和异源二聚体抗体产量。
表1-表3分别是本发明的双特异性抗体PR003178和PR002299的序列信息。
CD3抗体的重链、重链可变区分别在双特异性抗体中简称HC1、VH1,BCMA抗体的重链、重链可变区分别在双特异性抗体中简称HC2、VH2。
表1
表2
表3
实施例2 层析方法及填料的选择优化
2.1层析填料的筛选
填料的筛选如表4所示
表4
在PR003178培养液的纯化过程中,对不同的填料进行了筛选(如表4),单一层析纯化方法未获得理想的收率和纯度,收率低于40%。
2.2亲和层析、阳离子层析工艺
2.2.1亲和层析
(1)样品:CHO细胞表达的PR003178双抗培养液(表达量1.73mg/ml)。
(2)主要试剂及仪器:10×PBS缓冲液,1M Tris-HCl溶液(pH 8.0)和甘氨酸购自生工生物工程(上海)股份有限公司;盐酸购自上海泰坦科技股份有限公司;醋酸购自美国艾万拓公司;蛋白A填料Mabselect SuRe、层析柱XK16/20(直径1.6厘米,长度20厘米)、蛋白质层析纯化系统AKTA pure 150和蛋白质层析纯化系统AKTA avant 150购自美国思拓凡公司;超微量分光光度计Nanodrop One购自赛默飞世尔科技公司;SevenExcellence
(3)蛋白A亲和层析方法
使用蛋白A填料Mabselect SuRe装填层析空柱XK16/20(直径1.6cm),装填高度9cm,柱体积18ml。平衡缓冲液(PBS)平衡层析柱5个柱体积,流速10ml/min;培养上清液上样至层析柱,流速4.5ml/min,蛋白上样载量40mg/ml resin;平衡缓冲液(PBS)平衡层析柱5个柱体积,流速10ml/min;洗脱缓冲液(100mM甘氨酸-盐酸,pH3.5)洗脱层析柱,流速5ml/min,紫外280上升至50mAU时开始收集峰,紫外降至50mAU时停止收集。使用非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-reduced SDS-PAGE)和分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测样品的纯度。
2.2.2阳离子交换层析工艺开发
(1)样品:蛋白A亲和层析捕获的双抗蛋白。
(2)主要试剂及仪器:磷酸氢二钠、氯化钠购自美国默克公司;二水合磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司;L-精氨酸美国艾万拓公司;复合模式阳离子填料Capto SP ImpRes、层析柱Tricorn 5/100(直径0.5cm,长度10cm)、蛋白质层析纯化系统AKTA pure 150和蛋白质层析纯化系统AKTA avant 150购自美国思拓凡公司;超微量分光光度计Nanodrop One购自赛默飞世尔科技公司;SevenExcellence
(3)复合模式阳离子层析实验
使用复合模式阳离子填料Capto SP ImpRes装填层析空柱Tricorn 5/100(直径1.6cm),装填高度10cm,柱体积2ml。平衡缓冲液(20mM PBS,pH7.0)平衡层析柱5个柱体积,流速0.4ml/min;蛋白A亲和层析捕获的双抗蛋白上样至层析柱,流速0.4ml/min,蛋白上样载量7mg/ml resin;平衡缓冲液(20mM PBS,pH7.0)平衡层析柱10个柱体积,流速0.4ml/min。
氯化钠线性梯度洗脱:平衡缓冲液(20mM PBS,pH7.0)为A液,洗脱缓冲液(20mM PBS,1M氯化钠,pH7.0)为B液,使用“0-100%B,20个柱体积,0.4ml/min”进行洗脱。
紫外280上升至50mAU时开始收集峰,紫外降至50mAU时停止收集。收集的洗脱峰使用非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-reduced SDS-PAGE)和分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测样品的纯度。
(4)结果
亲和层析洗脱色谱如图1所示,图2的A显示复合模式阳离子层析色谱图,图2的B为阳离子层析洗脱峰的放大图,对洗脱峰分6个阶段进行样品收集;对阳离子上样样品、收集的洗脱峰样品进行SDS-PAGE检测,结果如图3所示,样品洗脱集中在阶段3-5;使用NR-CE-SDS和SEC-HPLC检测亲和层析、阳离子层析洗脱主峰的样品纯度,检测结果如图4-5以及表5所示。采用亲和层析捕获目的蛋白后,采用阳离子层析方法除去产品相关杂 质,CE-SDS纯度仅约为87%。N-SDS-PAGE检测纯度最高仅达85%以内,收率最高仅达86%以内。
表5 纯化数据及结果汇总
实施例3 还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-reduced SDS-PAGE)和分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析方法的优化
3.1还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-reduced SDS-PAGE)
(1)主要试剂及仪器:标准分子量马克PageRuler Unstained Protein Ladder购自赛默飞世尔科技公司;蛋白预制胶SurePAGE(Bis-Tris,10×8,4-20%BT)、上样缓冲液LDS Sample buffer(4×)、电泳缓冲液Tris-MOPS-SDS、蛋白胶染色液eStain L1 Stain solution、蛋白胶脱色液eStain L1 Destain solution和蛋白染色仪eStain L1购自南京金斯瑞生物科技有限公司;电泳仪基础电源Powerpac Basic和胶槽Mini-protean Tetra system购自美国伯乐公司。
(2)方法:需要分析的样品浓缩或稀释至0.33mg/ml,然后与上样缓冲 液(4×LDS Sample buffer)按照3比1的比例制样。使用金斯瑞的蛋白预制胶SurePAGE(Bis-Tris,10×8,4-20%BT)和电泳缓冲液Tris-MOPS-SDS进行电泳实验操作。电泳条件:180V恒压30min。电泳结束后,使用蛋白染色仪eStain L1对蛋白胶进行染色和脱色;染色液和脱色液分别为eStain L1 Stain solution、eStain L1 Destain solution。
3.2分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析方法的优化
在纯化及分析检测过程中发现原有SEC-HPLC方法不能真实反映产品纯度,分析原因可能为目的蛋白具有较强的疏水性,与SEC柱子产生非特异性吸附,通过在流动相中加入15%乙腈的方式进行方法优化,意外的发现优化后的方法峰形更对称,分辨率也有明显提高(图15)。
(1)主要试剂及仪器:10×PBS缓冲液购自(上海)股份有限公司;乙腈购自美国默克公司;液相色谱柱Welch Xtimate SEC-300(7.8×300mm)购自月旭科技(上海)股份有限公司;高效液相色谱系统1260Infinity II购自安捷伦。
(2)优化前方法:分子排阻色谱-高效液相色谱法使用安捷伦高效液相色谱系统1260Infinity II和液相色谱柱Welch Xtimate SEC-300(7.8×300mm)。使用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)为流动相进行等度洗脱,流速1.0ml/min,运行时间20min。使用280nm进行紫外检测,根据聚合体、单体和低分子量碎片对应的峰面积,计算各类物质的百分比。
(3)优化后方法:分子排阻色谱-高效液相色谱法使用安捷伦高效液相色谱系统1260Infinity II和液相色谱柱Welch Xtimate SEC-300(7.8×300mm)。使用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4,15%乙腈)为流动相进行等度洗脱,流速1.0ml/min,运行时间20min。使用280nm进行紫外检测,根据聚合体、单体和低分子量碎片对应的峰面积,计算各类物质的百分比。
实施例4 亲和层析、阴离子层析工艺开发
4.1亲和层析
(1)样品:CHO细胞表达的PR003178双抗培养液(表达量1.73mg/ml)。
(2)主要试剂及仪器:10×PBS缓冲液,“1M Tris-HCl溶液,pH 8.0”和甘氨酸购自生工生物工程(上海)股份有限公司;盐酸购自上海泰坦科技股份有限公司;醋酸购自美国艾万拓公司;蛋白A填料Mabselect sure LX、层析柱XK16/20(直径1.6厘米,长度20厘米)、蛋白质层析纯化系统AKTA pure 150和蛋白质层析纯化系统AKTA avant 150购自美国思拓凡公司;超微量分光光度计Nanodrop One购自赛默飞世尔科技公司;SevenExcellence
(3)蛋白A亲和层析方法
使用蛋白A填料Mabselect sure LX装填层析空柱XK16/20(直径1.6cm),装填高度9cm,柱体积18ml。平衡缓冲液(PBS)平衡层析柱5个柱体积,流速10ml/min;培养上清液上样至层析柱,流速4.5ml/min,蛋白上样载量40mg/ml resin;平衡缓冲液(PBS)平衡层析柱5个柱体积,流速10ml/min;洗脱缓冲液(100mM甘氨酸-盐酸,pH3.5)洗脱层析柱,流速5ml/min,紫外280上升至50mAU时开始收集峰,紫外降至50mAU时停止收集。收集的洗脱峰使用5M醋酸调节pH至3.6,室温孵育1小时,然后使用中和缓冲液(1M Tris-HCl,pH 8.0)中和样品pH至7.0。使用非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-reduced SDS-PAGE)和分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测样品的纯度。
4.2阴离子交换层析工艺开发
(1)样品:蛋白A亲和层析捕获的双抗蛋白。
(2)主要试剂及仪器:磷酸氢二钠、三羟基氨基甲烷(Tris)和L-组氨酸购自美国默克公司;二水合磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司;L-精氨酸美国艾万拓公司;天冬氨酸购自PanReac AppliChem公司。复合模式阴离子填料Capto adhere ImpRes、层析柱Tricorn 5/100(直径0.5cm,长度10cm)、蛋白质层析纯化系统AKTA pure 150和蛋白质层析纯化系统AKTAavant 150购自美国思拓凡公司;超微量分光光度计Nanodrop One购自赛默飞世尔科技公司;SevenExcellence
(3)复合模式阴离子层析预实验:精氨酸线性梯度淋洗
使用复合模式阴离子填料Capto adhere ImpRes装填层析空柱Tricorn 5/100(直径1.6cm),装填高度10cm,柱体积2ml。预平衡缓冲液(20mM PBS,pH7.0)平衡层析柱5个柱体积,流速0.4ml/min;蛋白A亲和层析捕获的双抗蛋白上样至层析柱,流速0.4ml/min,蛋白上样载量7mg/ml resin;平衡缓冲液(20mM PBS,pH7.0)平衡层析柱10个柱体积,流速0.4ml/min。
精氨酸线性梯度淋洗:平衡缓冲液(20mM PBS,pH7.0)为A液,淋洗缓冲液(20mM PBS,1M精氨酸-盐酸,pH7.0)为B液,使用“0-100%B,20个柱体积,0.4ml/min”的线性梯度进行淋洗。来寻找适合洗杂的精氨酸浓度,以去除杂质提高纯度。
使用洗脱缓冲液(10mM组氨酸,10mM天冬氨酸,pH5.0)洗脱层析柱,流速0.4ml/min,紫外280上升至50mAU时开始收集峰,紫外降至50mAU时停止收集。收集的洗脱峰使用非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳(non-reduced SDS-PAGE)和分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测样品的纯度。
(4)复合模式阴离子层析的优化:精氨酸等度淋洗
根据预实验结果,优化精氨酸线性梯度淋洗为等度淋洗(0.3M精氨酸-盐酸、0.4M精氨酸-盐酸),便于工艺放大及生产;另将层析工艺中使用的PBS缓冲液更换为Tris-HCl缓冲液:平衡缓冲液(20mM Tris-HCl,pH7.2)为A液,淋洗缓冲液(20mM Tris-HCl,1M精氨酸-盐酸,pH7.2)为B液;分别使用30%B(即20mM Tris-HCl,0.3M精氨酸-盐酸,pH7.2)和40%B(即20mM Tris-HCl,0.4M精氨酸-盐酸,pH7.2)进行淋洗。
实验方法如下:使用复合模式阴离子填料Capto adhere ImpRes装填层析空柱Tricorn 5/100(直径1.6cm),装填高度10cm,柱体积2ml。预平衡缓冲 液(20mM Tris-HCl,pH7.2)平衡层析柱5个柱体积,流速0.4ml/min;蛋白A亲和层析捕获的双抗蛋白上样至层析柱,流速0.4ml/min,蛋白上样载量7mg/ml resin;平衡缓冲液(20mM Tris-HCl,pH7.2)平衡层析柱10个柱体积,流速0.4ml/min。
精氨酸等度淋洗:分别使用30%B(即20mM Tris-HCl,0.3M精氨酸-盐酸,pH7.2)和40%B(即20mM Tris-HCl,0.4M精氨酸-盐酸,pH7.2)进行淋洗,流速0.4ml/min,淋洗20个柱体积。
使用洗脱缓冲液(10mM组氨酸,10mM天冬氨酸,pH5.0)洗脱层析柱,流速0.4ml/min,紫外280上升至50mAU时开始收集峰,紫外降至50mAU时停止收集。收集的洗脱峰使用实施例3的方法检测样品的纯度。
(5)结果
复合模式阴离子层析预实验(精氨酸线性梯度淋洗)结果见图7:SDS-PAGE检测,线性梯度淋洗峰中全部为杂质蛋白,无目的蛋白条带;洗脱峰的目的蛋白纯度较高。说明采用Capto adhere ImpRes复合模式阴离子层析,使用精氨酸淋洗可以在不损失目的蛋白的情况下去除杂质。
由预实验的层析图谱(图6)可知,在精氨酸线性梯度淋洗实验中,杂质峰峰顶处对应的精氨酸浓度为0.34M,因此在优化实验时,等度淋洗分别选择了0.3M和0.4M精氨酸。
优化实验层析图谱见图8和图9,从层析图谱中可以看出,0.3M和0.4M精氨酸均可淋洗出蛋白峰。SDS-PAGE检测(图10)淋洗出的蛋白峰全部为杂蛋白,不含目的蛋白,经过淋洗后,洗脱的目的蛋白纯度较高。如表6所示,SEC-HPLC检测经过0.4M精氨酸和0.3M精氨酸淋洗后,洗脱样品的纯度由83.17%提升至97.68%、97.57%。
图11为阴离子层析前SEC-HPLC图,图11的B为其A的放大部分;图12为阴离子层析后SEC-HPLC图(0.4M精氨酸淋洗),图12的B为其A的放大部分;图13为阴离子层析后SEC-HPLC图(0.3M精氨酸淋洗), 图13的B为其A的放大部分。图14为阴离子层析前后SDS-PAGE图。
表6 阴离子层析优化实验SEC-HPLC结果
采用上述相同的纯化方法对PR002299双抗培养液进行纯化,洗脱样品的纯度同样达到了95%以上。
- 用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法
- 用于纯化双特异性抗体的抗体修饰方法