一株贝莱斯芽孢杆菌CMC-3及其应用和生防菌剂

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株贝莱斯芽孢杆菌CMC-3及其应用和生防菌剂。

背景技术

农作物收获后残留在田间的秸秆中含有丰富的有机质成分，以及植物生长所需的中微量元素。通过秸秆还田技术实现其资源化利用，不仅可以有效提高土壤肥力和结构质量，降低化肥依赖度，也实现了秸秆资源的循环利用。然而，由于秸秆本身具有复杂的细胞结构特征，其降解速度通常较慢，且秸秆中常携带各种植物病原真菌，秸秆还田后病原真菌随之繁殖引起重要的病害，这成为秸秆还田技术应用中的一个主要限制因素。解决秸秆还田问题的关键就是有效地破坏植物木质纤维素结构，释放有价值的化学物质并且抑制病原真菌的生长。在自然条件下，微生物在秸秆分解中起着至关重要的作用，微生物数量及其种类会直接影响秸秆分解率的高低。自然界中的秸秆能够在多种微生物的协同作用下发生降解，降解作用主要来源于微生物分泌的木质素降解酶和纤维素降解酶，利用微生物降解木质素具有环保、高效及成本低等优势。所以筛选能够兼具产木质素降解酶和对植物病原真菌有抑制效果的有益微生物，用于加快秸秆还田，防治土传病害具有较好应用前景。

近年来，有关利用微生物降解秸秆的研究较多。宋雨等人从老陈醋里筛选出由灿烂类芽胞杆菌(Paenibacillus lautus)、千叶类芽胞杆菌(Paenibacillus chibensis)和窖泥类芽胞杆菌(Paenibacillus vini)构建的复合菌系，对小麦秸秆的降解率最高达27.63％。王文凡等人从堆积牛粪中筛选出解淀粉芽孢杆菌，该菌株有较好的pH适应范围以及盐度耐受性，能有效促进水稻秸秆降解。虽然目前有关秸秆降解菌的报道较多，但尚缺乏能够高效降解木质素并且对多种植物土传真菌病害具有广谱性抑制效果的多功能微生物。因此，筛选出同时兼具降解木质素且具有广谱性抑菌能力的多功能微生物，对于秸秆还田绿色农业发展具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌CMC-3及其应用和生防菌剂，本发明通过在常年秸秆还田的土壤中分离筛选出了一种具高效降解木质素且对多种植物土传真菌病害具有广谱性抑制效果的菌株CMC-3，经分子生物学鉴定菌株CMC-3为贝莱斯芽孢杆菌，经试验证明菌株CMC-3能够高效降解木质素且对多种土传病害的病原真菌的生长具有较强的抑制能力。因此本发明能够为更好地解决秸秆还田带来的降解利用率低及真菌病害等问题提供有力手段和理论基础。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CMC-3，所述贝莱斯芽孢杆菌CMC-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.28051。

本发明还提供了上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌CMC-3在生产木质素酶中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌CMC-3在降解秸秆中的应用。

优选的，所述秸秆包括玉米秸秆。

本发明还提供了上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌CMC-3在防治植物病害中的应用。

优选的，导致植物病害的病原菌包括尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和大丽轮枝菌中的一种或几种。

本发明还提供了上述技术方案所述的莱斯芽孢杆菌CMC-3在降解无机磷中的应用。

优选的，所述无机磷包括磷酸钙。

本发明还提供了一种生防菌剂，包括上述技术方案所述贝莱斯芽孢杆菌CMC-3。

优选的，所述生防菌剂中贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的有效活菌数为1×10

本发明的有益效果为：

采用本发明提供的贝莱斯芽胞杆菌CMC-3能够产生木质素酶，对玉米秸秆有较好的降解效果，并对多种土传病害的病原菌具有抑制作用，且具有一定的降解无机磷功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为贝莱斯芽孢杆菌CMC-3菌落形态；

图2为贝莱斯芽孢杆菌CMC-3木质素降解酶的定性检测效果；

图3为贝莱斯芽孢杆菌CMC-3降解玉米秸秆效果(30d)；

图4为贝莱斯芽孢杆菌CMC-3对3种病原菌的抑制作用；

图5为贝莱斯芽孢杆菌CMC-3对3种病原菌的抑制作用。

生物保藏说明

贝莱斯芽孢杆菌CMC-3，拉丁文为Bacillus velezensis，于2023年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.28051。

具体实施方式

本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CMC-3，所述贝莱斯芽孢杆菌CMC-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.28051。

本发明还提供了上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌CMC-3在生产木质素酶中的应用。在本发明中，所述的定性测定木质素酶方法优选采用苯胺蓝比色法。结果表明：培养3d后，贝莱斯芽孢杆菌CMC-3能够在苯胺蓝平板上生长，且能够使平板褪色，具有较强的产木质素酶能力。

本发明还提供了上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌CMC-3在降解秸秆中的应用。在本发明中，所述秸秆优选包括玉米秸秆。本发明将贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的菌液(有效活菌数为1×10

本发明还提供了上述技术方案所述的贝莱斯芽孢杆菌CMC-3在防治植物病害中的应用。在本发明中，导致植物病害的病原菌优选包括尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和大丽轮枝菌中的一种或几种。在本发明中，所述的贝莱斯芽孢杆菌CMC-3对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌3种植物病原真菌均有较强的抑制作用，形成明显的抑菌带，其中对尖孢镰刀菌抑制率能达到71.22％，对立枯丝核菌抑制率能达到75.44％，对大丽轮枝菌抑制率能达到78.56％。

本发明还提供了上述技术方案所述的莱斯芽孢杆菌CMC-3在降解无机磷中的应用。在本发明中，所述无机磷优选包括磷酸钙。在本发明中，所述的降解无机磷试验方法为将贝莱斯芽孢杆菌CMC-3接种于PKO无机磷培养基平板上，设置3次重复，在28℃恒温培养箱培养5d，观察菌株周围是否有解磷圈的形成，解磷圈越大，解磷效果越好，以此来初步确定菌株的解磷能力。所述的PKO无机磷培养基配方优选为：葡萄糖10g，KCl 0.2g，(NH

本发明还提供了一种生防菌剂，包括上述技术方案1所述贝莱斯芽孢杆菌CMC-3。在本发明中，所述生防菌剂中贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的有效活菌数为优选1×10

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的分离与鉴定：

1.菌株分离：

采用稀释涂布平板法。称取2g采集的富含玉米秸秆的土壤样品，加入20mL无菌水，摇床震荡30min后静置20min制成土壤悬浮液，吸取1mL上清液进行梯度稀释，稀释至10

2.菌株CMC-3的鉴定：

菌株CMC-3在LB固体培养基上，25℃培养24h后，菌落呈圆形，淡黄色，培养数天后表面粗糙，黏稠不易挑起，菌落四周有明显的皱褶隆起。挑取待鉴定菌株的单菌落于1.5mL离心管中，12000rpm离心1min，收集菌体。细菌DNA由购自天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取，详细步骤请参阅产品手册。利用16S通用引物及gyrB基因扩增引物gyrA-F和gyrA-R对菌株16S rDNA和gyrB基因片段采用常规方法进行PCR扩增。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送上海生工有限公司进行测序，获得序列经NCBI在线BLAST分析，并获得登录号：OR668713。结合形态学特征鉴定其为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)。

实施例2

贝莱斯芽孢杆菌CMC-3发酵液的制备：

通过菌株平板活化后，经液体发酵制备，其具体方法如下：

1.平板活化：

培养基配方为Luria-Bertani培养基(LB)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。菌株接种于LB平板上，28℃培养3d。

2.液体发酵：

配方为：以重量百分比计，胰蛋白胨1.5％，酵母提取物0.58％，NaCl 0.54％，余下为蒸馏水，pH为6.8。将活化后的菌种接种到250mL三角瓶(每瓶装100mL)液体培养基中，27℃下，摇床转速以150r·min

实施例3

贝莱斯芽孢杆菌CMC-3木质素降解酶的定性检测：

采用苯胺蓝脱色平板进行木质素降解酶的测定，将筛选出来的菌株在无菌操作条件下用点种法将贝莱斯芽孢杆菌CMC-3接种于在苯胺蓝培养基上进行划线，置于27℃恒温培养箱中培养，每天观察，以苯胺蓝培养基中菌落周围是否产生脱色圈判定是否有木质素降解酶的产生。所述的苯胺蓝培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，琼脂粉20g，苯胺蓝0.4g，蒸馏水1L，pH自然。结果表明：2d后，接种贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的培养基褪色，产生明显的透明圈，表明贝莱斯芽孢杆菌CMC-3具有产木质素降解酶能力，其脱色圈直径为2.21±0.04cm。

实施例4

贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的秸秆降解试验：

将贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的菌液(实施例2制备)分别按9％(V/V)的接种量接种到含有10g/L玉米秸秆作为唯一碳源的无机盐培养基中，设立含相同量无菌水的空白对照组。将所有处理组和对照组在28℃、180r/min的条件下进一步培养30d。培养结束后，取出玉米秸秆残渣，用无菌水冲洗除去表面菌落，然后在60℃下烘干至恒质量。根据玉米秸秆初重和终重差值，采用质量损失法计算不同处理组和对照组的玉米秸秆降解率。计算公式：

式中M0为对照组秸秆剩余物干重，M1为处理组秸秆剩余物干重。

结果表明：30d后贝莱斯芽孢杆菌CMC-3经过液态发酵后，玉米秸秆质量明显降低，秸秆剩余量为0.91g，秸秆降解率达到54.50％。

表1贝莱斯芽孢杆菌CMC-3玉米秸秆30d降解率

实施例5

贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的平板对峙试验：

1.供试菌株：

贝莱斯芽孢杆菌CMC-3由实施例1的平板活化步骤培养备用；

尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和大丽轮枝菌由PDA平板培养备用，具体操作：将病原菌接种于马铃薯葡萄糖培养基(PDA)(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL)平板上，25℃培养7d。

2.试验方法：

采用平板对峙法，将活化后的尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，在超净工作台中，用打孔器打取直径为5mm菌饼，分别放置在PDA平板中央，在每个病原菌菌饼四周2.5cm处用接种环点接贝莱斯芽孢杆菌CMC-3，每个病原菌重复3次，设置只接种病原菌的PDA平板作为对照，接种完成后用培养皿封口膜封口，置于28℃培养箱中倒扣培养，逐日观察菌落生长情况，5d后调查抑制率。

抑制率计算公式：抑制率(％)＝[(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径]×100％

3.试验结果：

结果表明：贝莱斯芽孢杆菌CMC-3对尖孢镰刀菌(JBLDJ)、立枯丝核菌(LKSH)和大丽轮枝菌(DLLZ)，均有良好的抑制作用。如表1所示，贝莱斯芽孢杆菌CMC-3对尖孢镰刀菌的抑制率为71.22％，对立枯丝核菌的抑制率为75.44％，对大丽轮枝菌的抑制率为78.56％。

表2贝莱斯芽孢杆菌CMC-3对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和大丽轮枝菌的抑制作用

实施例6

贝莱斯芽孢杆菌CMC-3的解无机磷试验：

将莱斯芽孢杆菌CMC-3接种于PKO无机磷培养基平板上，设置3次重复，在28℃恒温培养箱培养5d，观察菌株周围是否有解磷圈的形成，解磷圈越大，则菌株解磷能力越强，以此来初步确定菌株的解磷能力。所述的PKO无机磷培养基配方为：葡萄糖10g，KCl 0.2g，(NH

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。