制备胰腺前体细胞的方法

技术领域

本发明涉及干细胞分化调控领域技术，尤其是指一种制备胰腺前体细胞的方法。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，长期存在的高血糖会导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。截止于2022年末，全球已检出的成年糖尿病患者人数高达5.5亿，中国有超1.4亿患者，相较于10年前增长了约5千万人。传统治疗糖尿病的手段主要有药物治疗、手术治疗，药物治疗包括服用降糖药和注射胰岛素，但长期地使用药物会增加肾脏负担进而引起一系列的心血管疾病以及产生耐药，严重影响着患者的生活质量。手术治疗包括胰岛移植和代谢手术，胰岛移植存在着供体来源受限以及免疫排斥的风险，而代谢手术也存在手术创面较大，恢复过程缓慢等风险。近十几年来，细胞治疗为糖尿病治疗提供了新的方案，其中干细胞作为具有多种分化潜能且具有无限复制、增殖的能力的种子细胞进入人们视野。由干细胞来源的胰岛β细胞可以较好地解决胰岛移植过程中供体来源不足的问题，同时可以实现自体移植治疗。

研究报道，通过在体外添加化学小分子和生长因子可以激活或者抑制某些信号通路从而模拟胰岛在体内的发育过程。在体外，多能干细胞分化为胰岛β细胞大致需要经历的6个阶段如下：定型内胚层细胞阶段，原始肠管细胞阶段，后前肠细胞阶段，胰腺前体细胞阶段，胰腺内分泌祖细胞阶段，胰腺β细胞阶段。其中定型内胚层细胞阶段、胰腺前体细胞阶段、胰岛β细胞阶段由于其对最终能否产生具有功能的胰岛β细胞至关重要且有明确的检测标志物，因此被列为由人多能干细胞向胰岛β细胞分化过程中的重要阶段。

申请号为201910190210.4的发明提供了一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞以及胰岛β细胞的方法；现有技术中由后前肠细胞分化形成胰腺前体细胞阶段，现行方案大部分存在着分化效率低、不同细胞系分化效率不稳定的问题；因此针对现状，迫切需要开发一种制备胰腺前体细胞的方法，以满足实际使用需要。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种制备胰腺前体细胞的方法，其通过采用本申请提供的制备胰腺前体细胞的方法可稳定高效地制备胰腺前体细胞；本申请提供的制备胰腺前体细胞的方法得到的胰腺前体细胞纯度好、活率高。

为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：

一种制备胰腺前体细胞的方法，包括如下步骤：

S1：干细胞扩增培养；

S2：诱导干细胞分化为定型内胚层细胞；

S3：诱导定型内胚层细胞分化为原始肠管细胞；

S4：诱导原始肠管细胞分化为后前肠细胞；

S5：诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞；

该步骤S5中诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞具体包括如下阶段：

阶段一：将后前肠阶段细胞使用胰腺前体细胞阶段一培养基进行培养；该胰腺前体细胞阶段一培养基的组成为：以DMEM-basic为基础培养基，还包括下述浓度成分：1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、100ng/mL EGF、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nMSANT1、250μM维生素C、BET溴结构域泛抑制剂、m6A去甲基化酶ALKBH5的辅因子；作用时间为24小时；

阶段二：将阶段一培养后的细胞使用胰腺前体细胞阶段二培养基进行培养；该胰腺前体细胞阶段二培养基的组成为：以DMEM-basic为基础培养基，还包括下述浓度成分：1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、100ng/mL EGF、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nM SANT1、250μM维生素C、BET溴结构域泛抑制剂；作用时间为3天；

阶段三：将阶段二培养后的细胞使用胰腺前体细胞阶段三培养基进行培养；该胰腺前体细胞阶段三培养基的组成为：以DMEM-basic为基础培养基，还包括下述浓度成分：1％青-链霉素双抗、1％B27、50ng/mL EGF、BET溴结构域泛抑制剂、10ng/mLbFGF、10μMRepsox；作用时间为2-3天。

作为一种优选方案：所述BET溴结构域泛抑制剂为I-BET282E，作用浓度为1μM。

作为一种优选方案：所述m6A去甲基化酶ALKBH5的辅因子为dm-αKG，作用浓度为8mM。

作为一种优选方案：所述步骤S5中诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞的阶段一、阶段二和阶段三均在37℃条件下的二氧化碳培养箱内培养。

作为一种优选方案：所述步骤S1中的干细胞为人多能干细胞，该人多能干细胞为人诱导多能干细胞或者是不经过人体内发育的人类胚胎获取的胚胎干细胞。

作为一种优选方案：所述步骤S1中干细胞扩增培养包括：步骤S11：将人多能干细胞用mTeSR1培养基于37℃二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；以及步骤S12：使用Accutase消化人多能干细胞至单细胞，接种于铺有稀释比例为1：100的GrowthFactorReduced-Matrigel 24孔板中，采用mTeSR1培养基培养24h。

作为一种优选方案：所述步骤S1中干细胞扩增培养具体步骤为：人多能干细胞用mTeSR1培养基于二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；用Accutase消化人多能干细胞至单细胞，将人多能干细胞接种于1％Growth Factor Reduced-Matrigel包被的24孔培养板；采用含有10μM Y27632的mTeSR1培养基培养24h。

作为一种优选方案：所述步骤S2中诱导人多能干细胞分化为定型内胚层细胞包括如下具体步骤：

S21：采用定型内胚层阶段一培养基培养，其中定型内胚层阶段一培养基的组成为：以MCDB131为基础培养基，还包括下述浓度成分：9mM Glucose、1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、250μM维生素C、115ng/mLActivin A、4.5μM CHIR99021、50nM PI103、10μMY27632、1μM JNK-IN-8；作用时间为24小时；

S22：采用定型内胚层阶段二培养基培养，其中定型内胚层阶段二培养基的组成为：以MCDB131为基础培养基，还包括下述浓度成分：9mM Glucose、1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、250μM维生素C、110ng/mLActivin A、0.45μM CHIR99021；作用时间为24小时；

S23：采用定型内胚层阶段三培养基培养，其中定型内胚层阶段三培养基的组成为：以MCDB131为基础培养基，还包括下述浓度成分：9mM Glucose、1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、250μM维生素C、105ng/mLActivin A、0.45μM CHIR99021；作用时间为24小时。

作为一种优选方案：所述步骤S3中诱导定型内胚层细胞分化为原始肠管细胞所采用的培养基包括以下成分：以MCDB131为基础培养基，还包括下述浓度成分：4.5mMGlucose、1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、50ng/mLKGF、250μM维生素C、5μMSB431542、100nM Wnt-C59。

作为一种优选方案：所述步骤S4中诱导原始肠管细胞分化为后前肠细胞所采用的培养基包括以下成分：以DMEM-basic为基础培养基，还包括下述浓度成分：1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、2μM Retinoic acid、100nM LDN193189、250nM SANT1、250μM维生素C、100nMWnt-C59。

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，通过采用本申请提供的制备胰腺前体细胞的方法可稳定高效地制备胰腺前体细胞，为有效获取胰腺前体细胞或胰岛β细胞提供了新的途径，同时为胰岛β细胞替代疗法治疗糖尿病奠定了基础；本申请提供的制备胰腺前体细胞的方法得到的胰腺前体细胞纯度好、活率高，有望用于糖尿病的治疗。

为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。

附图说明

图1为本发明之制备胰腺前体细胞的方法流程示意图；

图2为本发明之验证实施例1-1流式细胞术检测PDX1、NKX6.1阳性胰腺前体细胞比例图；

图3为本发明之验证实施例2-1流式细胞术检测PDX1、NKX6.1阳性胰腺前体细胞比例图；

图4为本发明之验证实施例3-1流式细胞术检测PDX1、NKX6.1阳性胰腺前体细胞比例图；

图5为本发明之验证实施例1-2中荧光定量PCR分析胰腺前体细胞PDX1、NKX6.1的mRNA相对表达量结果示意图；

图6为本发明之验证实施例2-2实施荧光定量PCR分析胰腺前体细胞PDX1、NKX6.1的mRNA相对表达量结果示意图；

图7为本发明之验证实施例3-2实施荧光定量PCR分析胰腺前体细胞PDX1、NKX6.1的mRNA相对表达量结果示意图；

图8为本发明之实施例1分化形成胰腺前体细胞前后阶段细胞形态显微镜照片示意图；

图9为本发明之实施例2分化形成胰腺前体细胞前后阶段细胞形态显微镜照片示意图；

图10为本发明之实施例3分化形成胰腺前体细胞前后阶段细胞形态显微镜照片示意图。

具体实施方式

本申请所使用的试剂来源如下表：

本发明如图1至图10所示，一种制备胰腺前体细胞的方法，包括如下步骤：

S1：干细胞扩增培养；

该步骤S1中的干细胞为人多能干细胞，该人多能干细胞为人诱导多能干细胞或者是不经过人体内发育的人类胚胎获取的胚胎干细胞。

该步骤S1中干细胞扩增培养包括：步骤S11：将人多能干细胞用mTeSR1培养基于37℃二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；以及步骤S12：使用Accutase消化人多能干细胞至单细胞，接种于铺有稀释比例为1：100的Growth Factor Reduced-Matrigel 24孔板中，采用mTeSR1培养基培养24h。

该步骤S1中干细胞扩增培养具体步骤为：人多能干细胞用mTeSR1培养基于二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；用Accutase消化人多能干细胞至单细胞，将人多能干细胞接种于1％GrowthFactor Reduced-Matrigel包被的24孔培养板；采用含有10μMY27632的mTeSR1培养基培养24h。

S2：诱导干细胞分化为定型内胚层细胞；

该步骤S2中诱导干细胞分化为定型内胚层细胞包括如下具体步骤：

S21：采用定型内胚层阶段一培养基培养，其中定型内胚层阶段一培养基的组成为：以MCDB131为基础培养基，还包括下述浓度成分：9mM Glucose、1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、250μM维生素C、115ng/mLActivin A、4.5μM CHIR99021、50nM PI103、10μMY27632、1μM JNK-IN-8；作用时间为24小时；

S22：采用定型内胚层阶段二培养基培养，其中定型内胚层阶段二培养基的组成为：以MCDB131为基础培养基，还包括下述浓度成分：9mM Glucose、1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、250μM维生素C、110ng/mLActivin A、0.45μM CHIR99021；作用时间为24小时；

S23：采用定型内胚层阶段三培养基培养，其中定型内胚层阶段三培养基的组成为：以MCDB131为基础培养基，还包括下述浓度成分：9mM Glucose、1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、250μM维生素C、105ng/mLActivin A、0.45μM CHIR99021；作用时间为24小时。

S3：诱导定型内胚层细胞分化为原始肠管细胞；

该步骤S3中诱导定型内胚层细胞分化为原始肠管细胞所采用的培养基包括以下成分：以MCDB131为基础培养基，还包括下述浓度成分：4.5mM Glucose、1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、50ng/mL KGF、250μM维生素C、5μM SB431542、100nM Wnt-C59。

S4：诱导原始肠管细胞分化为后前肠细胞；

该步骤S4中诱导原始肠管细胞分化为后前肠细胞所采用的培养基包括以下成分：以DMEM-basic为基础培养基，还包括下述浓度成分：1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、2μM Retinoic acid、100nM LDN193189、250nM SANT1、250μM维生素C、100nMWnt-C59。

S5：诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞；

该步骤S5中诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞具体包括如下阶段：

阶段一：将后前肠阶段细胞使用胰腺前体细胞阶段一培养基进行培养；该胰腺前体细胞阶段一培养基的组成为：以DMEM-basic为基础培养基，还包括下述浓度成分：1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、100ng/mL EGF、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nMSANT1、250μM维生素C、BET溴结构域泛抑制剂、m6A去甲基化酶ALKBH5的辅因子；作用时间为24小时；

阶段二：将阶段一培养后的细胞使用胰腺前体细胞阶段二培养基进行培养；该胰腺前体细胞阶段二培养基的组成为：以DMEM-basic为基础培养基，还包括下述浓度成分：1％青-链霉素双抗、1％谷氨酸盐、1％B27、100ng/mL EGF、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nM SANT1、250μM维生素C、BET溴结构域泛抑制剂；作用时间为3天；

阶段三：将阶段二培养后的细胞使用胰腺前体细胞阶段三培养基进行培养；该胰腺前体细胞阶段三培养基的组成为：以DMEM-basic为基础培养基，还包括下述浓度成分：1％青-链霉素双抗、1％B27、50ng/mL EGF、BET溴结构域泛抑制剂、10ng/mLbFGF、10μMRepsox；作用时间为2-3天。

该BET溴结构域泛抑制剂为I-BET282E，作用浓度为1μM。

该m6A去甲基化酶ALKBH5的辅因子为dm-αKG，作用浓度为8mM。

采用分化诱导剂诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞；分化诱导剂包括BET溴结构域泛抑制剂、m6A去甲基化酶ALKBH5的辅因子；本发明实施例提供的胰腺前体细胞制备方法所获得的细胞，对后续往胰岛β细胞分化至关重要。

该步骤S5中诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞的阶段一、阶段二和阶段三均在37℃条件下的二氧化碳培养箱内培养。

实施例1

一种制备胰腺前体细胞的方法，包括如下步骤：

S1：人胚胎干细胞HUES8扩增培养：

人胚胎干细胞HUES8用mTeSR1培养基于二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；用Accutase消化人胚胎干细胞HUES8至单细胞，按照2.7×10

S2：诱导干细胞分化为定型内胚层细胞；

该步骤S2中诱导干细胞分化为定型内胚层细胞包括如下具体步骤：

S21：采用定型内胚层阶段一培养基培养：配制定型内胚层阶段第一天培养基，将人胚胎干细胞HUES8使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

其中定型内胚层阶段一培养基的组成为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μMVC(维生素C)、115ng/mL激活素A(Activin A)、1μM JNK-IN-8、4.5μM CHIR99021，50nMPI103、10μMY27632，该浓度均为终浓度。

S22：采用定型内胚层阶段二培养基培养：配制定型内胚层阶段第二天培养基，将经过步骤S21培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第二天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；其中定型内胚层阶段二培养基的组成为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、110ng/mL激活素A(ActivinA)、0.45μM CHIR99021，该浓度均为终浓度。

S23：采用定型内胚层阶段三培养基培养：配制定型内胚层阶段第三天培养基，将经过步骤S22培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第三天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

其中定型内胚层阶段三培养基的组成为：以MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、105ng/mL激活素A(Activin A)，该浓度均为终浓度。

S3：诱导定型内胚层细胞分化为原始肠管细胞；

配制原始肠管细胞阶段培养基，将定型内胚层细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养2天，每天换液。

该原始肠管细胞阶段培养基组成成分为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：4.5mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、50ng/mL角质细胞生长因子(KGF)、5μΜSB431542、10μΜWnt-C59。

S4：诱导原始肠管细胞分化为后前肠细胞；

配制后前肠细胞阶段培养基，将原始肠管细胞使用上述的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养4天，每天换液。

该后前肠细胞阶段培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、2μΜ视黄酸(Retinoic Acid)、100nΜLDN193189、250nΜSANT1、100nΜWnt-C59。

S5：诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞；

该步骤S5中诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞具体包括如下阶段：

阶段一、配制胰腺前体细胞阶段一培养基，将后前肠阶段细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

阶段二、配制胰腺前体细胞阶段二培养基，将上述阶段一的细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养3天，每天换液。

阶段三、配制胰腺前体细胞阶段三培养基，将上述阶段二的细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养2-3天，每天换液。

该胰腺前体细胞阶段一的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、100ng/mL表皮生长因子(EGF)、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nM SANT1、1μM I-BET282E、8mM dm-αKG。

该胰腺前体细胞阶段二的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、100ng/mL表皮生长因子(EGF)、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nM SANT1、1μM I-BET282E。

该胰腺前体细胞阶段三的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、50ng/mL表皮生长因子(EGF)、1μM I-BET282E、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10μM Repsox。

在40倍显微镜明场下拍摄HUES8进入胰腺前体细胞阶段前后的细胞形态图，结果如图8所示，进入胰腺前体细胞阶段后的细胞排列更加紧密，有成团簇的趋势。

验证实施例1-1

流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1表达情况

将分化后的胰腺前体细胞用1mL DPBS清洗三次，除尽残留液体，然后每孔加入500μLAccutase置于培养箱消化4-5分钟，镜下观察细胞开始脱落后，立即加入1mL DMEM/F12终止消化，然后用将细胞吹散成单细胞。随后将细胞悬液转入流式管中，300g离心5min后去除上清，留下细胞沉淀；添加0.5mL固定通透液(现配现用，注意避光)轻轻吹打，重悬细胞沉淀，避光置于4℃冰箱40min；使用现配0.5mL洗涤液终止固定通透，500g离心3min，去除上清，留下细胞沉淀。向细胞沉淀中加入1mL洗涤液，重悬细胞，500g离心3min后弃去上清；加入荧光一抗，避光置于4℃冰箱，孵育40min；孵育完毕后，用0.5mL洗涤液终止孵育，500g离心3min，去除上清；向细胞沉淀中加入1mL洗涤液，重悬细胞沉淀，500g离心3min，弃上清；最后用0.5mL DPBS重悬细胞沉淀后上机；使用BD FACSAria IIu流式细胞仪进行样品分析。

本申请中用到的荧光一抗如下：Alexa

验证实施例1-2

实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达量

1.细胞总RNA提取

收集24孔板中培养的细胞，用0.5mL DPBS清洗2遍，用RNA提取试剂盒中的350μLRLT溶液裂解细胞，反复吹打直至细胞彻底裂解，将细胞裂解液转移至无RNA酶的离心管中。向离心管中的裂解液加入350μL 70％乙醇，并充分混匀。将700μL的样本加入试剂盒中装有收集管的离心柱中。10000g离心15s，弃去流出液；向离心柱中加入700μL的RW1溶液，10000g离心15s，弃去流出液。向离心柱中加入500μL RPE溶液，10000g离心15s，弃去流出液。向离心柱中加入500μL RPE溶液，10000g离心2min，弃去流出液。将离心柱置于新的收集管中，并向其中心添加30μL无RNA酶的水至离心柱膜中央，10000g离心1min。收集流出液即为提取的RNA，将RNA保存于-80℃超低温冰箱。

2.cDNA的制备

步骤a、上述提取的细胞总RNA测定其浓度和纯度(A260/A280吸光度比值>1.8)，使用Takara厂家的逆转录试剂盒获取cDNA；取出总的RNA置于冰上，根据浓度计算出反转录1μg RNA所需体积，随后加入4μL的5×gDNA Eraserbuffer，2μL的gDNAEraser，其余部分用无RNA酶的水补足，得到20μL总体积的去除基因组DNA的混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离心至PCR管底部，使用Labnet MULTIGENE OPTIMAX进行反应，反应条件为：42℃下反应2min。

步骤b、将由上述步骤a获得的反应液置于冰上，并向其添加试剂盒中PrimerScript RT 2μL，RT PrimerMix 2μL，5×PrimerScript Buffer2 8μL，无RNA酶的水4μL，得到反转录总体积40μL的混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离心至PCR管底部，使用Labnet MULTIGENE OPTIMAX进行反应，反应条件为：先在37℃下反应15min，再于85℃下反应5s，之后置于-20℃保存。

3.SYBR Green实时荧光定量PCR检测PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达情况

取1μL上述反转录得到的cDNA，加入2×

本申请用到的引物：

GAPDH正向引物GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，反向引物ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA；

PDX1正向引物CGGAACTTTCTATTTAGGATGTGG，反向引物AAGATGTGAAGGTCATACTGGCTC；

NKX6.1正向引物GGGCTCGTTTGGCCTATTCGTT，反向引物CCACTTGGTCCGGCGGTTCT。

实时荧光定量PCR检测的胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达量，结果如图5所示；在向胰腺前体细胞分化阶段中，胰腺前体细胞的标志物PDX1和NKX6.1的mRNA有显著提高。

实施例2

一种制备胰腺前体细胞的方法，包括如下步骤：

S1：干细胞扩增培养：人诱导多能干细胞SZBKi002-A扩增培养；

该步骤S1中干细胞扩增培养包括：步骤S11：人诱导多能干细胞SZBKi002-A用mTeSR1培养基于二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；以及步骤S12：用Accutase消化人诱导多能干细胞SZBKi002-A至单细胞，按照2.7×105cells/孔/mL,将SZBKi002-A接种于1％Growth Factor Reduced-Matrigel包被的24孔培养板。用含有10μMY27632的1mLmTeSR1培养基培养24h后开始分化。

S2：诱导干细胞分化为定型内胚层细胞；

该步骤S2中诱导干细胞分化为定型内胚层细胞包括如下具体步骤：

S21：采用定型内胚层阶段一培养基培养：配制定型内胚层阶段第一天培养基，将人诱导多能干细胞SZBKi002-A使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

其中定型内胚层阶段一培养基的组成为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μMVC(维生素C)、115ng/mL激活素A(Activin A)、1μM JNK-IN-8、4.5μM CHIR99021，50nMPI103、10μMY27632，该浓度均为终浓度。

S22：采用定型内胚层阶段二培养基培养：配制定型内胚层阶段第二天培养基，将经过步骤S21培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第二天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

其中定型内胚层阶段二培养基的组成为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μMVC(维生素C)、110ng/mL激活素A(Activin A)、0.45μM CHIR99021，该浓度均为终浓度。

S23：采用定型内胚层阶段三培养基培养：配制定型内胚层阶段第三天培养基，将经过步骤S22培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第三天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

其中定型内胚层阶段三培养基的组成为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μMVC(维生素C)、105ng/mL激活素A(Activin A)，该浓度均为终浓度。

S3：诱导定型内胚层细胞分化为原始肠管细胞；

配制原始肠管细胞阶段培养基，将定型内胚层细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养2天，每天换液。

该原始肠管细胞阶段培养基组成成分为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：4.5mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、50ng/mL角质细胞生长因子(KGF)、5μΜSB431542、10μΜWnt-C59。

S4：诱导原始肠管细胞分化为后前肠细胞；

配制后前肠细胞阶段培养基，将原始肠管细胞使用上述的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养2天，每天换液。

该后前肠细胞阶段培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、2μΜ视黄酸(Retinoic Acid)、100nΜLDN193189、250nΜSANT1、100nΜWnt-C59。

S5：诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞；

该步骤S5中诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞具体包括如下阶段：

阶段一、配制胰腺前体细胞阶段一培养基，将后前肠细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

阶段二、配制胰腺前体细胞阶段二培养基，将上述阶段一的细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养3天，每天换液。

阶段三、配制胰腺前体细胞阶段三培养基，将上述阶段二的细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养2-3天，每天换液。

该胰腺前体细胞阶段一的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、100ng/mL表皮生长因子(EGF)、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nM SANT1、1μM I-BET282E、8mM dm-αKG。

该胰腺前体细胞阶段二的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、100ng/mL表皮生长因子(EGF)、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nM SANT1、1μM I-BET282E。

该胰腺前体细胞阶段三的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、50ng/mL表皮生长因子(EGF)、1μM I-BET282E、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10μM Repsox。

在40倍显微镜明场下拍摄SZBKi002-A进入胰腺前体细胞阶段前后的细胞形态图，结果如图9所示，进入胰腺前体细胞阶段后的细胞排列更加紧密，有成团簇的趋势。

验证实施例2-1

流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1表达情况

将分化后的胰腺前体细胞用1mL/DPBS清洗三次，除尽残留液体，然后每孔加入500μL Accutase置于培养箱消化4-5分钟，镜下观察细胞开始脱落后，立即加入1mL DMEM/F12终止消化，然后用将细胞吹散成单细胞。随后将细胞悬液转入流式管中，300g离心5分钟后去除上清，留下细胞沉淀；添加0.5mL固定通透液(现配现用，注意避光)轻轻吹打，重悬细胞沉淀，避光置于4℃冰箱40min；用现配0.5mL洗涤液终止固定通透，500g离心3min，去除上清，留下细胞沉淀。向细胞沉淀中加入1mL洗涤液，重悬细胞，500g离心3min后弃去上清；加入荧光一抗，避光置于4℃冰箱，孵育40min；孵育完毕后，用0.5mL洗涤液终止孵育，500g离心3min，去除上清；向细胞沉淀中加入1mL洗涤液，重悬细胞沉淀，500g离心3min，弃上清；最后用0.5mL DPBS重悬细胞沉淀后上机；使用BD FACSAria IIu流式细胞仪进行样品分析。

本申请中用到的荧光一抗如下：Alexa

验证实施例2-2

实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达量

1.细胞总RNA提取

收集24孔板中培养的细胞，用0.5mL DPBS清洗2遍，用RNA提取试剂盒中的350μLRLT溶液裂解细胞，反复吹打直至细胞彻底裂解，将细胞裂解液转移至无RNA酶的离心管中。向离心管中的裂解液加入350μL 70％乙醇，并充分混匀。将700μL的样本加入试剂盒中装有收集管的离心柱中。10000g离心15s，弃去流出液。向离心柱中加入700μL的RW1溶液，10000g离心15s，弃去流出液。向离心柱中加入500μL RPE溶液，10000g离心15s，弃去流出液。向离心柱中加入500μL RPE溶液，10000g离心2min，弃去流出液。将离心柱置于新的收集管中，并向其中心添加30μL无RNA酶的水至离心柱膜中央，10000g离心1min。收集流出液即为提取的RNA，将RNA保存于-80℃超低温冰箱。

2.cDNA的制备

步骤a、上述提取的细胞总RNA测定其浓度和纯度(A260/A280吸光度比值>1.8)，使用Takara厂家的逆转录试剂盒获取cDNA；取出总的RNA置于冰上，根据浓度计算出反转录1μg RNA所需体积，随后加入4μL的5×gDNA Eraserbuffer，2μL的gDNAEraser，其余部分用无RNA酶的水补足，得到20μL总体积的去除基因组DNA的混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离心至PCR管底部，使用Labnet MULTIGENE OPTIMAX进行反应，反应条件为：42℃下反应2min。

步骤b、将由上述步骤a获得的反应液置于冰上，并向其添加试剂盒中PrimerScript RT 2μL，RT PrimerMix 2μL，5×PrimerScript Buffer28μL，无RNA酶的水4μL，得到反转录总体积40μL的混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离心至PCR管底部，使用Labnet MULTIGENE OPTIMAX进行反应，反应条件为：先在37℃下反应15min，再于85℃下反应5s，之后置于-20℃保存。

3.SYBR Green实时荧光定量PCR检测PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达情况

取1μL上述反转录得到的cDNA，加入2×

本申请用到的引物：

GAPDH正向引物GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，反向引物ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA；

PDX1正向引物CGGAACTTTCTATTTAGGATGTGG，反向引物AAGATGTGAAGGTCATACTGGCTC；

NKX6.1正向引物GGGCTCGTTTGGCCTATTCGTT，反向引物CCACTTGGTCCGGCGGTTCT。

实时荧光定量PCR检测的胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达量，结果如图6所示；在向胰腺前体细胞分化阶段中，胰腺前体细胞的标志物PDX1和NKX6.1的mRNA有显著提高。

实施例3

一种制备胰腺前体细胞的方法，包括如下步骤：

S1：干细胞扩增培养：人诱导多能干细胞SZBKi003-A扩增培养

该步骤S1中干细胞扩增培养包括：步骤S11：人诱导多能干细胞SZBKi003-A用mTeSR1培养基于二氧化碳培养箱至细胞融合度达80％-90％；以及步骤S12：用Accutase消化人诱导多能干细胞SZBKi003-A至单细胞，按照2.7×105cells/孔/mL,将HUES8接种于1％Growth Factor Reduced-Matrigel包被的24孔培养板；用含有10μM Y27632的1mL mTeSR1培养基培养24h后开始分化。

S2：诱导干细胞分化为定型内胚层细胞；

该步骤S2中诱导干细胞分化为定型内胚层细胞包括如下具体步骤：

S21：采用定型内胚层阶段一培养基培养：配制定型内胚层阶段第一天培养基，将人诱导多能干细胞SZBKi003-A使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

S22：采用定型内胚层阶段二培养基培养：配制定型内胚层阶段第二天培养基，将经过步骤S21培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第二天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

S23：采用定型内胚层阶段三培养基培养：配制定型内胚层阶段第三天培养基，将经过步骤S22培养后的细胞更换为定型内胚层阶段第三天培养基，于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

该定型内胚层阶段第一天培养基的组成为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、115ng/mL激活素A(Activin A)、1μM JNK-IN-8、4.5μM CHIR99021，50nMPI103、10μMY27632，该浓度均为终浓度。

该定型内胚层阶段第二天培养基的组成为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、110ng/mL激活素A(Activin A)、0.45μM CHIR99021，该浓度均为终浓度。

该定型内胚层阶段第三天培养基的组成为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：9mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、105ng/mL激活素A(Activin A)，该浓度均为终浓度。

S3：诱导定型内胚层细胞分化为原始肠管细胞；

配制原始肠管细胞阶段培养基，将定型内胚层细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养2天，每天换液。

该原始肠管细胞阶段培养基组成成分为：MCDB131为基础培养基，还包括下述培养成分：4.5mM葡萄糖、1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、50ng/mL角质细胞生长因子(KGF)、5μΜSB431542、10μΜWnt-C59。

S4：诱导原始肠管细胞分化为后前肠细胞；

配制后前肠细胞阶段培养基，将原始肠管细胞使用上述的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养2天，每天换液。

该后前肠细胞阶段培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、2μΜ视黄酸(Retinoic Acid)、100nΜLDN193189、250nΜSANT1、100nΜWnt-C59。

S5：诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞；

该步骤S5中诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞具体包括如下阶段：

阶段一、配制胰腺前体细胞阶段一培养基，将后前肠细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养24h；

阶段二、配制胰腺前体细胞阶段二培养基，将上述阶段一的细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养3天，每天换液。

阶段三、配制胰腺前体细胞阶段三培养基，将上述阶段二的细胞使用本申请提供的培养基于37℃二氧化碳培养箱内培养2-3天，每天换液。

该胰腺前体细胞阶段一的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、100ng/mL表皮生长因子(EGF)、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nM SANT1、1μM I-BET282E、8mM dm-αKG。

该胰腺前体细胞阶段二的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，还包括下述培养成分：1％谷氨酰胺、1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、250μM VC(维生素C)、100ng/mL表皮生长因子(EGF)、200nM TPB、10mM Nicotinamide、250nM SANT1、1μM I-BET282E。

该胰腺前体细胞阶段三的培养基组成成分为：DMEM-basic为基础培养基，1％青-链霉素双抗、1％B27-无血清维生素A添加剂、50ng/mL表皮生长因子(EGF)、1μM I-BET282E、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、10μM Repsox。

在40倍显微镜明场下拍摄SZBKi003-A进入胰腺前体细胞阶段前后的细胞形态图，结果如图10所示，进入胰腺前体细胞阶段后的细胞排列更加紧密，有成团簇的趋势。

验证实施例3-1

流式细胞术检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1表达情况

将分化后的胰腺前体细胞用1mL DPBS清洗三次，除尽残留液体，然后每孔加入500μLAccutase置于培养箱消化4-5分钟，镜下观察细胞开始脱落后，立即加入1mL DMEM/F12终止消化，然后用将细胞吹散成单细胞。随后将细胞悬液转入流式管中，300g离心5分钟后去除上清，留下细胞沉淀；添加0.5mL固定通透液(现配现用，注意避光)轻轻吹打，重悬细胞沉淀，避光置于4℃冰箱40min；用现配0.5mL洗涤液终止固定通透，500g离心3min，去除上清，留下细胞沉淀。向细胞沉淀中加入1mL洗涤液，重悬细胞，500g离心3min后弃去上清；加入荧光一抗，避光置于4℃冰箱，孵育40min；孵育完毕后，用0.5mL洗涤液终止孵育，500g离心3min，去除上清；向细胞沉淀中加入1mL洗涤液，重悬细胞沉淀，500g离心3min，弃上清；最后用0.5mL DPBS重悬细胞沉淀后上机；使用BD FACSAria IIu流式细胞仪进行样品分析。

本申请中用到的荧光一抗如下：Alexa

验证实施例3-2

实时荧光定量PCR检测胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达量

1.细胞总RNA提取

收集24孔板中培养的细胞，用0.5mL DPBS清洗2遍，用RNA提取试剂盒中的350μLRLT溶液裂解细胞，反复吹打直至细胞彻底裂解，将细胞裂解液转移至无RNA酶的离心管中。向离心管中的裂解液加入350μL 70％乙醇，并充分混匀。将700μL的样本加入试剂盒中装有收集管的离心柱中。10000g离心15s，弃去流出液。向离心柱中加入700μL的RW1溶液，10000g离心15s，弃去流出液。向离心柱中加入500μL RPE溶液，10000g离心15s，弃去流出液。向离心柱中加入500μL RPE溶液，10000g离心2min，弃去流出液。将离心柱置于新的收集管中，并向其中心添加30μL无RNA酶的水至离心柱膜中央，10000g离心1min。收集流出液即为提取的RNA，将RNA保存于-80℃超低温冰箱。

2.cDNA的制备

步骤a、上述提取的细胞总RNA测定其浓度和纯度(A260/A280吸光度比值>1.8)，使用Takara厂家的逆转录试剂盒获取cDNA；取出总的RNA置于冰上，根据浓度计算出反转录1μg RNA所需体积，随后加入4μL的5×gDNA Eraser buffer，2μL的gDNA Eraser，其余部分用无RNA酶的水补足，得到20μL总体积的去除基因组DNA的混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离心至PCR管底部，使用Labnet MULTIGENE OPTIMAX进行反应，反应条件为：42℃下反应2min。

步骤b、将由上述步骤a获得的反应液置于冰上，并向其添加试剂盒中PrimerScript RT 2μL，RT PrimerMix 2μL，5×PrimerScript Buffer28μL，无RNA酶的水4μL，得到反转录总体积40μL的混合液；轻柔混匀，掌上离心机将混匀后的液体离心至PCR管底部，使用Labnet MULTIGENE OPTIMAX进行反应，反应条件为：先在37℃下反应15min，再于85℃下反应5s，之后置于-20℃保存。

3.SYBR Green实时荧光定量PCR检测PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达情况

取1μL上述反转录得到的cDNA，加入2×

本申请用到的引物：

GAPDH正向引物GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG，反向引物ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA；

PDX1正向引物CGGAACTTTCTATTTAGGATGTGG，反向引物AAGATGTGAAGGTCATACTGGCTC；

NKX6.1正向引物GGGCTCGTTTGGCCTATTCGTT，反向引物CCACTTGGTCCGGCGGTTCT。

实时荧光定量PCR检测的胰腺前体细胞阶段PDX1和NKX6.1的mRNA相对表达量，结果如图7所示；在向胰腺前体细胞分化阶段中，胰腺前体细胞的标志物PDX1和NKX6.1的mRNA有显著提高。

以上的实施例1至实施例3说明，本发明可适用于多种不同干细胞系来源的后前肠细胞，具有较广的使用范围和良好的应用前景。

本发明的设计重点在于，通过采用本申请提供的制备胰腺前体细胞的方法可稳定高效地制备胰腺前体细胞，为有效获取胰腺前体细胞或胰岛β细胞提供了新的途径，同时为胰岛β细胞替代疗法治疗糖尿病奠定了基础；本申请提供的制备胰腺前体细胞的方法得到的胰腺前体细胞纯度好、活率高，有望用于糖尿病的治疗；本申请提供的制备胰腺前体细胞的方法，采用分化诱导剂诱导后前肠细胞分化为胰腺前体细胞，该分化诱导剂包括BET溴结构域泛抑制剂、m6A去甲基化酶ALKBH5的辅因子。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。