一种钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料及其制备和在用于制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤活性药物开发技术领域，具体涉及钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料。

背景技术

癌症，即恶性肿瘤，由于其非正常的细胞增殖、不可控的生长能力及高的致死率，早已成为困扰人类的几大病症之一。而目前对于癌症的治疗方法依然集中在化疗、放疗、手术治疗等。但是这些治疗方法治疗效率低下、对于普通细胞与癌细胞缺乏选择性，其严重的副作用导致在治疗癌症的同时，也会导致人体免疫系统受损，对正常的细胞也会带来不可逆转的损伤，往往给癌症患者带来极大的痛苦。因此，研究出对癌细胞具有特异性杀伤且相对温和、低创的治疗方法迫在眉睫。

压电催化疗法是最近报道的温和、低创治疗手段之一。所述的压电催化疗法是利用超声波(一种频率超过人类听力(>20kHz)的机械波)对生物组织的强穿透性，无创地将声能集聚在深部的组织并激活压电纳米材料的压电效应产生自由基以达到抗肿瘤效果的一种新型治疗方法，作为一种非侵入性的治疗方式，压电催化治疗具有很高的组织穿透性能并且利用压电材料的机电转换特性产生自由基来杀伤癌细胞。

虽然压电催化疗法具有优异的效果，但其研究进展缓慢，主要阻碍在于压电材料的开发。虽然压电材料已经在催化以及环境治理方面得到了广泛的研究，但现有压电材料难于满足生物使用需求，例如，还普遍存在难于全身给药，难于参与血液循环，生物活化能高，毒性大等诸多问题。因此，开发出具有生物适用性，并具有良好反应活性的材料对于成功实现并改善压电催化疗法效果至关重要。

发明内容

针对现有压电催化疗法存在的生物适应性以及治疗效果不理想的问题，本发明第一目的在于，提供一种钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料(本发明也称为钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合抗肿瘤活性材料)，旨在提供一种可静脉注射全身给药、具有优异生物适应性、生物安全性、优异抗肿瘤活性的全新结构材料。

本发明第二目的在于，提供所述的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的制备方法。

本发明第三目的在于，提供所述的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料在制备抗肿瘤药物中的应用以及获得的抗肿瘤药物。

一种钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料，包括钛酸锰纳米圆盘以及包覆在其表面的柠檬酸类化合物层。

本发明所述的材料，其核为钛酸锰纳米圆盘，在核的表面包覆有柠檬酸类化合物的壳层。本发明研究发现，基于材料的成分以及结构的协同控制，能够意外地解决钛酸锰难于实现生物适用、压电生物催化性能不理想、抗肿瘤活性不足等诸多不同。研究发现，本发明所述的材料生物无害，且能够意外地实现静脉注射全身给药，不仅如此，还具有优异的压电催化自由基催化效果，具有优异的抗肿瘤活性。

本发明中，所述的钛酸锰纳米圆盘结构以及在其表面修饰复合柠檬酸有机层的包覆结构的协同控制是实现其生物适用、改善其压电生物自由基催化，改善抗肿瘤活性的关键。

作为优选，所述的钛酸锰纳米圆盘为钛酸锰的二维材料，其二维平面呈圆形或者接近圆形；其平面大小为130～250nm，进一步优选为150～200nm。

优选地，所述的钛酸锰纳米圆盘的厚度为5～10nm，进一步优选为6～8nm。

本发明中，所述的柠檬酸类化合物层的成分为柠檬酸，还允许含有柠檬酸的衍生物；所述的衍生物优选为柠檬酸酯、柠檬酰胺、柠檬酸盐、柠檬酸酸酐中的至少一种。

优选地，所述的柠檬酸类化合物层基于物理和/或化学作用力包覆在钛酸锰纳米圆盘的表面。所述的物理作用例如可以是范德华力。所述的化学作用例如可以是络合作用。

本发明还提供了一种所述的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料，包括以下步骤：

步骤(1)：将包含钛酸源、乙二醇的溶液A、包含锰源和乙二胺的溶液B和水混合，进行溶剂热反应，制得所述的钛酸锰纳米圆盘；

步骤(2)：将钛酸锰纳米圆盘、柠檬酸和三乙胺液相混合、超声、固液分离得到固体a，将得到的固体a和柠檬酸盐液相混合后再次超声、固液分离，即得。

本发明研究发明，在步骤(1)制得的钛酸锰纳米圆盘上配合步骤(2)的手段，可以产生协同作用，能够意外地成功实现钛酸锰纳米圆盘的包覆。本发明研究发现，采用所述的制备方案，能够意外地解决钛酸锰难于生物适用，压电生物催化活性不理想，抗肿瘤性能不理想等不足。

本发明所述的制备方法，所述的圆盘制备以及所述的包覆手段的协同控制是成功构建所述结构材料、并实现其生物适用，改善其生物催化以及抗肿瘤活性的关键。

本发明中，所述的钛酸源为钛酸酯(指钛酸四醇酯)；优选为钛酸甲酯、钛酸乙酯、钛酸丙酯、钛酸异丙酯、钛酸丁酯中的至少一种。

优选地，所述的锰源为Mn

优选地，所述的钛酸源和锰源中的Ti/Mn按化学计量比进行混料；优选地，二者的元素化学比为1:1。

本发明步骤(1)中，所述的成分以及特殊的预反应混料方式的控制是成功制备所述钛酸锰纳米圆盘结构的材料，并赋予表面良好活性基团，利于柠檬酸修饰，改善其生物催化活性的关键。

本发明中，预先将钛酸源和乙二醇混合接触，进行预反应，将其中的Ti预反应转型成乙二醇钛络合物(也即是，所述的溶液A实质上为溶解有乙二醇钛络合物的乙二醇溶液)。其反应机理例如为：Ti(OCH

本发明中，所述的乙二醇的用量不低于将钛酸源完全络合的理论摩尔量。

优选地，溶液A中，Ti元素的摩尔浓度为0.01～1M；进一步优选为0.05～0.1M。

本发明中，先将锰源和乙二胺预反应，将Mn源转化成配位化合物形式(也即是，所述的溶液B为分散有Mn乙二胺配位物的乙二胺溶液，其反应机制为Mn

作为优选，本发明中，所述的乙二醇的用量不低于将锰源完全配位的理论摩尔量。

优选地，溶液B中，Mn元素的摩尔浓度为0.1～1M；进一步优选为0.2～0.4M。

本发明中，将溶液A和溶液B以及水混合，进行溶剂热反应。所述的水用量不低于理论反应量。

优选地，所述的水和溶液A中的乙二醇的体积比为1:1～6；进一步优选为1:3～5。

本发明中，将预配位的溶液A和溶液B再和水进行反应，其反应的机理为：

Ti(OCH

优选地，溶剂热反应的温度为100～400℃；进一步优选为150～250℃；

优选地，溶剂热反应的时间为12～36h；进一步优选为20～28h。研究意外地发现，在该优选的时间下，能够意外地获得可以注射，且具有优异抗肿瘤活性的材料。

本发明中，步骤(2)的包覆方法与所述的步骤(1)的圆盘制备方法存在协同性，能够意外地实现圆盘的成功包覆，且能够意外地实现制得的材料的生物适用，并改善其生物利用、改善抗肿瘤活性。

本发明研究发现，所述的柠檬酸以及三乙胺的创新使用，配合所述的二段超声处理，能够意外地实现所述的纳米圆盘的表面的柠檬酸的包覆，实现其生物使用并改善其生物利用效果。

作为优选，步骤(2)中，将分散有钛酸锰纳米圆盘、柠檬酸和三乙胺和有机溶剂进行液相混合，超声、固液分离得到固体a；随后再将固体a分散在柠檬酸盐的水溶液后再次进行超声、固液分离，得到所述的材料。

本发明研究发现，基于有机溶剂体系下的第一段超声以及水下的第二段超声工艺，进一步配合成分(例如所述特殊手段制得的圆盘、三乙胺等协同)的协同控制，能够意外地实现所述的材料的构建，并能够意外地改善其抗肿瘤活性。

本发明中，所述的有机溶剂例如为氯仿、甲醇、乙醇中的至少一种。

进一步优选，步骤(2)中，将分散有钛酸锰纳米圆盘的氯仿溶液和溶解有柠檬酸的甲醇溶液混合，随后加入三乙胺，进行液相混合得混合液，随后经超声、固液分离得到固体a。

优选地，三乙胺在液相混合的混合液中的体积浓度为1～10μL/mL。

第一段超声前的混合液中，柠檬酸的浓度优选为1～30mg/mL。

优选地，将固体a分散在水中，随后再加入柠檬酸盐，混合后再进行超声、固液分离得到钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料；

优选地，所述的柠檬酸盐为柠檬酸的水溶性盐，优选为柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸锂、柠檬酸钙中的至少一种。优选地，第二段超声前的混合液中，柠檬酸盐的浓度优选为10～30mg/mL。

作为优选，步骤(2)中，超声过程的功率为50～200W；超声过程的频率为20～60kHz。

本发明将获得的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料洗涤后重新分散在水溶液中备用。

本发明还提供了一种所述的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的应用，将其作为活性成分用于制备抗肿瘤的药物。

优选的应用方案，将其用于制备压电催化疗法的抗肿瘤的药物。

进一步优选的方案，将其用于制备在超声介导下压电自由基催化的抗肿瘤的药物。

本发明所述的应用，将其用于制备抗肿瘤的注射剂型的药物；优选地，将其用于制备抗肿瘤的静脉注射剂型的药物。本发明研究发现，采用所述的材料，能够首次实现全身静脉给药，没有毒副作用，且生物催化活性高，对于实体瘤具有优异的应用效果。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包含药学有效量的所述的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料。

本发明所述的抗肿瘤药物，其为分散有所述的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的注射液制剂；

优选地，所述的药物中，还含有药学上允许添加的辅料。

本发明所述的复合材料，其具有良好的生物适应性，且能够意外地实现静脉注射，在全身分布，不仅如此，还不会具有生物毒性，本发明中，所述的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料在肿瘤部分分布，并基于外加的超声波作用，促使材料的电子-空穴对不断地分开，从而建立了强大的内置电场和表面电荷，这些作为感应的表面电子/空穴将有效催化活性氧的产生，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

有益效果

(1)本发明提供了一种全新的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料，且发现该材料具有良好的生物适用性，能够意外地实现静脉注射给药，具有优异的生物压电催化活性，具有优异的抗肿瘤活性。

(2)本发明还提供了所述的材料的制备方法，且发现具有所述的步骤(1)和步骤(2)的协同，能够意外地成功实现所述的材料以及结构的构建，能够意外地改善材料的生物适用性，改善生物压电催化性能。

(3)本材料的制备和修饰方法简单，反应条件温和，成本低，可进行大规模制备。

附图说明

【图1】为实施例1步骤1制备的钛酸锰纳米圆盘的透射电镜(TEM)图、粒径分布图、能量散射X射线(EDS)光谱图、X射线光电子能谱(XPS)图和X射线衍射(XRD)图，其中(a)部分为TEM图，标尺1μm；(b)部分为EDS图，(c)部分为粒径分布图；(d)部分为XRD图，(e)部分为XPS图。

【图2】为实施例1步骤(1)制得的圆盘以及步骤(2)制得的圆盘@柠檬酸复合材料的Zeta电位图。

【图3】为实施例1～3制备出的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料在水中的溶解性图片，其中(a)部分为实施例3(水热反应12h制得)的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料，(b)部分为实施例1(水热反应24h制得)的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料，(c)部分为实施例2(水热反应36h制得)的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的水溶性示意图。

【图4】为实施例1(水热24h)和实施例2(水热36h)的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料在超声治疗仪的作用下产生自由基的荧光图谱。

【图5】为实施例1制得的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的PFM图像，其中(a)部分为振幅图，(b)部分为相位图，(c)部分为磁滞回线。

【图6】为实施例1(蓝线)和对照组(绿线)经超声治疗仪超声不同时间后对自由基进行检测的荧光图谱。

【图7】为对实施例1中的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料进行有限元分析计算的示意图，其中(a)图是纳米圆盘@柠檬酸复合材料的受力方向和尺寸的示意图，(b)的是圆盘受到超声声压下产生压电势的模拟图，(c)圆盘受到超声产生的空化气泡塌陷时产生的压电势的模拟图。

【图8】为以DCFH-DA为活性氧探针，对本发明实施例1(MTO+US组)和对比例1(Control组)，对比例2(US组)，对比例3(MTO组)的小鼠乳腺癌细胞4T1细胞的胞内活性氧染色图片。

【图9】为以钙黄绿素和碘化丙啶为荧光探针，使用荧光倒置显微镜对本发明实施例1(MTO+US组)和对比例1(Control组)，对比例2(US组)，对比例3(MTO组)的细胞死活情况进行染色图片。

【图10】为以荧光素钾盐为染料，使用小动物活体成像在治疗的第14天对本发明实施例1(MTO+US组)和对比例1(Control组)，对比例2(US组)，对比例3(MTO组)的小鼠进行活体成像的图片。其中(a)为对比例1(Control组)，(b)为对比例2(US组)，(c)为对比例3(MTO组)，(d)实施例1(MTO+US组)。

【图11】为实施例1(MTO+US组)和对比例1(Control组)，对比例2(US组)，对比例3(MTO组)处理的小鼠的相对肿瘤体积曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。这些实施例应理解为仅用于说明。

本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，基于本发明的原理对本发明所做出的各种改动或修改同样落入本发明权利要求书所限定。

第一部分：

实施例1(MTO+US组)：

步骤(1)MnTiO

MnTiO

由图1(a)可见，步骤(1)制得的MnTiO

由图1(b)可见，Mn:Ti:O的原子比约为1:1:3，符合MnTiO

由图1(c)可见MnTiO

图1(d)中绿线(上谱线)为本实施例中步骤1中制备的MnTiO

图1(e)中灰线为本实施例中步骤1中制备的MnTiO

步骤(2)MnTiO

将5mg的MnTiO

图2中柱形从左到右依次为柠檬酸修饰前的MnTiO

实施例2：

和实施例1相比，区别主要在于，溶剂热的时间有所延长(36h)，具体为：

步骤(1)MnTiO

在室温下在剧烈搅拌下将钛酸异丙酯(1.25mmol)逐渐加入到16mL乙二醇中(溶液A)。同时，在搅拌下将四水合氯化锰(1.25mmol)溶于4mL乙二胺中(溶液B)。将溶液B倒入溶液A中，均匀混合后，在剧烈搅拌下将5mL去离子水缓慢滴入其中。将溶液转移到50mL不锈钢反应釜中，然后将反应釜放入烘箱中，在200℃下加热36h。自然冷却至室温，离心收集产物，用50％乙醇水溶液洗涤3次，最后分散在无水乙醇中。

将5mg的MnTiO

实施例3：

与实施例1的合成方法和修饰方法相同，但是将水热反应的时间改为12h。

图3为实施例1～3的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料分散液的图片。其中，图3(a)可以看出，水热12h合成的钛酸锰纳米圆盘即使在修饰以后，其水溶性仍然不好，在静置后发生了明显的聚沉。图3(b)为本实施例1中步骤2中制备的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料分散液的图片，钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料均匀分散在水中，未发生聚沉。图3(c)可以看出，水热36h合成出来的钛酸锰纳米圆盘，经柠檬酸修饰后，在水中的溶解性略差于实施例1。从图中可以看出其水溶性明显优于实施例2和实施例3.

第二部分：压电催化产生自由基效果测试：

将1.9mg香豆素-3-羧酸(3-CCA)溶解在1mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，并添加10μL二甲亚砜(DMSO)以促进溶解。将100μL3-CCA添加到1mL钛酸锰@柠檬酸复合材料水溶液(实施例1或2)(100μg/mL)中。通过超声治疗仪(1MHz，1.75W·cm

图4为以3-CCA为荧光探针，对实施例1(水热24h)的样品和实施例2(水热36h)的样品超声不同的时间后测的得的3-CCA的荧光图谱。在ROS存在下，弱荧光的3-CCA可以被转化为强荧光的7-羟基香豆素-3-羧酸(7OH-3CCA)，从图4中可以看出，实施例1的3-CCA荧光增强的幅度明显高于实施例2。说明水热24h合成的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料具有最佳的压电催化效果。

图5为使用压电显微镜(PFM)观察钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料(实施例1)的铁电畴的分布。在-10V～10V直流偏置电压下，用PFM尖端扫描钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料表面，得到压电响应信号。钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的振幅(图5(a))和相位(图5(b))的三维图像显示了明显的对比，表明钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料在外加载荷下产生了良好的压电响应。典型的蝶形振幅曲线(图5(c))也进一步证实了钛酸锰纳米圆盘的压电特性。

图6为以3-CCA为荧光探针对实施例1(含钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料)和对照组(采用PBS缓冲液作为参比对照)分布进行超声处理0、3、6、9、12，15min后，3-CCA的荧光图谱，可以从图中看出，含钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的组产生的荧光升高幅度远远高于不含钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的组，证实了钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料具有很好的压电催化性能。

图7为使用COMSOL软件对钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料在超声下的压电势产生情况进行模拟的示意图，从图7(b)可以看出，当应力方向是从侧面施加时，在声压(10

第三部分：细胞抗肿瘤效果的测试：

3.1：DCFH-DA荧光实验

以4T1细胞为模型癌细胞，探究钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料在细胞内的压电催化性能：按每孔大约10000个细胞的密度在96孔板上种上4T1细胞，每个孔大约100μL培养基，培育12h。随后，去除原培养基，在种满细胞的细胞液进行四组实验，分别为实验组(MTO+US组)、Control组、US组以及MTO组；

其中，实验组测试过程中，向细胞液中加入100μL 100μg/mLMnTiO

参比测试：

对比例1(Control组)：

和实验组相比，采用PBS溶液代替了所述的钛酸锰@柠檬酸复合材料水溶液，且在测试过程中不进行超声处理。

对比例2(US组)：

和实验组相比，只是用PBS溶液代替了实施例1中的钛酸锰水溶液。其他条件相同，例如，进行了超声处理。

对比例3(MTO组)：

和实验组相比，区别仅在于，不进行超声处理。

图8为实施例1(MTO+US组)和对比例1(Control组)，对比例2(US组)，对比例3(MTO组)的胞内活性氧染色图片。其中，蓝光为用Hoechst 33342染的细胞核，绿光为DCF发出的荧光。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。从中可以看出，钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料在超声下能产生大量的活性氧，因此其绿色荧光明显高于其他组。

3.2：CalceinAM+PI荧光实验：

以4T1细胞为模型癌细胞，采用本发明所提供的柠檬酸包覆的MnTiO

CalceinAM本身并无荧光，进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解生成具有强负电荷的不能通透细胞膜的极性分子钙黄绿素(Calcein)，从而被滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光。由于核酸红色荧光染料PI不能穿透活细胞的细胞膜而只能染色细胞膜完整性被破坏的死细胞，所以CalceinAM常常与碘化丙啶(ST511)联合使用，对活细胞和死细胞同时进行双重荧光染色。

从图9可以看出MTO+US组的红色荧光明显强于其他三组，绿色荧光几乎消失，说明在超声的作用下，钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料产生的活性氧能够有效杀死癌细胞。

第四部分：动物模型试验

在中南大学湘雅医学院实验动物中心的批准下，按照道德规范和规程进行了动物实验。给小鼠皮下注射200μL含5x10

在第0和第6天给MTO组和MTO+US组注射100μL 2mg/mL的钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料的PBS溶液，给Control组和US组注射100μL的PBS溶液。在第1、2、3和第7、8、9天，对US组和MTO+US组超声3分钟(1MHz，1.75W cm

图10是在第14天时对进行治疗的各组小鼠进行的小动物活体成像图片。荧光素钾盐是萤光素酶最常用的底物，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下通过萤光素酶的作用进行氧化脱羧反应发出波长约为560nm的蓝绿色生物萤光，所以可以根据肿瘤处的荧光强度判断肿瘤细胞的多少。从图10可以看出来，经过钛酸锰纳米圆盘@柠檬酸复合材料和超声的共处理的小鼠(图10(d))几乎没有荧光，而其他几组的荧光强度均比较强，这说明钛酸锰纳米圆盘的压电催化效应具有很好的抗肿瘤效果。

图11的肿瘤相对体积曲线进一步证明了钛酸锰纳米圆盘的压电催化效应具有最佳的抗肿瘤效果。

通过以上实施实例，申请人以举例的方式证明了新型压电材料-钛酸锰(MnTiO