一种新冠病毒NP抗体双抗夹心法建立的胶体金试纸条

技术领域

本发明是关于生物技术的领域，特别是关于一种新冠病毒NP抗体双抗夹心法建立的胶体金试纸条。

背景技术

新冠病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)是一种主要感染人的烈性传染病。目前针对新冠病毒感染的检测主要有三种方式，即核酸检测、抗原检测和抗体检测。核酸检测的检测对象是核酸序列，检测速度较慢，需要2h以上，在整个感染阶段均可检测到，灵敏度高，但是操作难度复杂。抗体检测的检测对象是免疫球蛋白IgG/IgM等，检测速度快，检测15min内出结果，在感染后3-5天可以检测到，灵敏度较高，操作难度中等。抗原检测的检测对象为病毒的结构蛋白，检测速度快，在急性期，出现症状7天内均可检测到，灵敏度偏低，需要一定的抗原量，操作难度简便。核酸检测和抗原检测通过采集鼻咽拭纸来检测，抗体检测通过采集血液检测。病毒感染后，人体中最早出现的是病毒的蛋白和核酸，抗体需要感染一定的时间后机体免疫系统应答后产生，时间上稍晚。核酸检测具有样本量大、检测灵敏度高、特异性好等优点，但是核酸检测需要严格的实验室环境、专业的技术人员、易出现假阳性的缺点，应用相对受限，且需要几个小时后出结果，检测时间较长。同时核酸检测受病程的影响较大，无症状者需要检几次甚至数十次才能检测到阳性。抗体检测在目前全球大范围内都接种了新冠疫苗的环境下应用不佳，抗体的检测结果不能反应出是否有病毒感染。虽然目前用于新冠抗原诊断的试纸条较多，但是检测结果参差不齐，灵敏度相差较大。市售的新冠抗原检测试纸条多数针对的是病毒的S蛋白，S蛋白具有高度变异性，针对S蛋白的检测可能存在漏检的风险。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新冠病毒NP抗体双抗夹心法建立的胶体金试纸条，其能够解决新冠病毒感染的检测灵敏度低、操作难的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种新冠病毒NP抗体双抗夹心法建立的胶体金试纸条，由下至上依次包括：底板、吸水滤纸、依次设有质控线和检测线的固相硝酸纤维素膜、吸附有胶体金标记的NP抗体P301-H5和山羊抗鸡IgY的金标垫、聚酯纤维素膜样品垫和设有加样孔的外壳；

所述质控线喷涂有鸡IgY抗体；所述检测线喷涂有NP抗体P301-F7。

优选地，所述质控线和所述检测线间距为4mm。

进一步地，制备步骤如下：

(1)胶体金复溶液配制，取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na

(2)胶体金的制备，取0.01％ HAuCl

(3)试纸条制备，取0.5-1.0mL胶体金复溶液，加5-16μL K

(4)以2-4μg/cm的包被量在固体硝酸纤维素膜喷涂P301-F7抗体，作为检测线；

(5)以2μg/cm的喷涂量在硝酸纤维素膜上喷涂鸡IgY抗体，作为质控线。

与现有技术相比，根据本发明的一种新冠病毒NP抗体双抗夹心法建立的胶体金试纸条，具有如下有益效果：

1、该胶体金检测试纸条检测NP蛋白的浓度敏感性为4ng/ml；

2、检测活病毒的敏感性为10

3、选择更为保守且丰度高的新冠蛋白NP蛋白作为检测靶点，NP蛋白在冠状病毒基因组中是高度保守的基因，编码的蛋白同源性高，变异小，且NP蛋白在新冠感染的患者体内表达丰度最高，感染早期就能检测得到，选择NP蛋白作为新冠抗原检测的主要靶点检测结果更为准确，检测结果符合度为83％，检测特异性为95％；

4、胶体金试纸条携带方便，操作简单，样品采集后只需与样品稀释液按一定比例混合后滴加至样品孔中，5min就可以出检测结果，且结果准确；

5、C线采用包被鸡卵黄囊抗体IgY来捕捉流动液相中胶体金标记的抗鸡卵黄囊抗体IgY抗体，不与T线共用同一种胶体金标记的抗体，无交叉反应，该设计避免了T线亮度的不稳定性。

附图说明

图1是根据本实施例1的胶体金试纸条NP蛋白敏感性的测定结果图；

图2是根据本实施例1的胶体金试纸条活病毒敏感性试验的结果测定图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

根据本发明优选实施方式的一种新冠病毒NP抗体双抗夹心法建立的胶体金试纸条，制备方法如下：

(1)材料的准备

SARS-CoV-2NP抗体，两株非竞争的SARS-CoV-2抗体由本单位深圳市第三人民医院肝病研究所从康复病人记忆B细胞中分离得到并保存，分别命名为P301-F7和P301-H5。

主要试剂和耗材，鸡IgY蛋白(#CY01)和山羊抗鸡IgY抗体(#GCY06)购自杭州启泰生物技术有限公司；氯金酸(HAuCl

样品稀释液配制，NaCl 8g、KCl 0.2g、Na

胶体金复溶液配制，样品稀释液中添加终质量浓度为25％的蔗糖和10％的D-海藻糖作为胶体金复溶液。

SARS-CoV-2病毒株，由深圳市第三人民医院P3实验室分离和保存。

(2)胶体金的制备

取0.01％ HAuCl

(3)试纸条制备

用胶体金颗粒为红色，用于标记指示SARS-CoV-2NP抗体P301-H5。标记步骤如下：为了摸索最佳的SARS-CoV-2NP抗体胶体金标记条件和NC膜上包被条件，将各项试验条件进行梯度测定。取五份500μL胶体金复溶液，分别加入1μL、2μL、4μL、8μL和16μL 0.2mol/LK

结果显示，16μL K

胶体金试纸条组装顺序为硬质底板→吸水滤纸→固相硝酸纤维素膜(依次有C线和T线)→吸附有胶体金标记的P301-H5和山羊抗鸡IgY的金标垫→聚酯纤维素膜(样品垫)→塑料外壳(设置加样孔)。具体操作如下：(1)25mm长的固相硝酸纤维素膜硬质底板上；(2)黏附吸水滤纸长约18mm，并与固相硝酸纤维素膜重叠约为2mm；(3)10mm长的金标垫与固相硝酸纤维素膜重叠约为2mm；(4)聚酯纤维素膜长约15mm，与金标垫重叠约为2mm；(5)自动斩切机(上海金标公司ZQ2000)切割成4mm宽的条带；(6)条带外装上保护性的塑料外壳。

实施例1，胶体金试纸条的特异性试验、敏感性试验和重复性试验测定

以梯度稀释的SARS-CoV-2NP蛋白选择最优的P301-H5抗体标记条件和NC膜上包被的P301-F7抗体的用量。选定最适条件后，测定建立方法的特异性和敏感性。最终加样量为80μL。

选用HIV-1CN54蛋白、HIV-1GP120蛋白、HBV核心蛋白、SARS-CoV-2病毒株RBD蛋白测定该胶体金试纸条的特异性。各蛋白浓度调整为400μg/ml，并取80μL滴加至加样孔中，5min后观察试验结果。

结果显示：该方法与其他病原核心蛋白或糖蛋白无交叉反应，表明该方法特异性好。

在深圳市第三人民医院生物安全等级3级(P3)实验室中，选用SARS-CoV-2病毒株以10

选用SARS-CoV-2NP蛋白高浓度(400ng/ml)、中浓度(40ng/ml)和低浓度(4ng/ml)进行批间三次重复和批内三次重复，测定该胶体金试纸条的重复性。

如图1所示，胶体金试纸条NP蛋白敏感性测定结果，NP蛋白浓度梯度分别为400ng/ml、40ng/ml、4ng/ml和稀释液对照，结果显示：该胶体金检测试纸条检测NP蛋白的浓度敏感性为4ng/ml。

如图2所示，胶体金试纸条活病毒敏感性试验结果测定，病毒初始浓度为10

实施例2，利用建立的胶体金试纸条测定临床血清样品

利用建立的胶体金试纸条测定采集于2021年的100份临床鼻咽拭纸，作用5min后观察试验结果。结果与real-time RT-PCR结果进行比对，测定该方法的准确性。

将临床样本鼻咽拭纸洗脱液滴加至胶体金试纸条的样品孔，5min内观察结果，将同时出现检测线和质控线的样品判为SARS-CoV-2感染阳性样本，仅出现质控线的判为SARS-CoV-2感染阴性样本。

随机选取100份于2021年采集的鼻咽拭纸，包括新冠病毒患者、无症状感染者和健康人鼻咽拭纸，同时利用real-time RT-PCR检测方法、已上市的新冠抗原检测试剂盒和本研究建立的胶体金检测方法测定这100份临床样本的阴阳性。结果显示：与real-time RT-PCR检测方法(样品Ct值小于35时被判定为阳性，样品Ct值大于或者等于35且小于40时被判定为可疑，样品Ct值大于或等于40时被判定为阴性)相比较，该方法的检测结果符合度为83％，检测特异性为95％。结果表明，该试验方法可应用于临床新冠病毒感染的检测。

选择更为保守且丰度高的新冠蛋白NP蛋白作为检测靶点，NP蛋白在冠状病毒基因组中是高度保守的基因，编码的蛋白同源性高，变异小，且NP蛋白在新冠感染的患者体内表达丰度最高，感染早期就能检测得到，选择NP蛋白作为新冠抗原检测的主要靶点检测结果更为准确。胶体金试纸条携带方便，操作简单，样品采集后只需与样品稀释液按一定比例混合后滴加至样品孔中，5min就可以出检测结果，且结果准确。胶体金试纸条易保存，放置常温下即可保存。胶体金试纸条使用蛋白原料和胶体金试剂较少，节约了成本。与其他胶体金试纸条设计原理不同，本研究的C线采用包被鸡卵黄囊抗体IgY来捕捉流动液相中胶体金标记的抗鸡卵黄囊抗体IgY抗体，不与T线共用同一种胶体金标记的抗体，无交叉反应，该设计避免了T线亮度的不稳定性。同时本研究利用的一对NP抗体具有互不竞争、与抗原具有高亲和力的天然优势，对于低丰度的NP蛋白都能很好的捕获，大大提高了抗原检测的灵敏度。本研究应用的NP抗体序列清晰并提交至抗体序列数据库，且已申请了专利保护抗体序列，因此本研究所建立的抗原检测方法背景清晰、灵敏度高，可快速用于商品化，精准助力新冠病毒的防疫工作。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。