疫苗组合物

发明领域

本发明涉及包含黄病毒肽的疫苗组合物，以及这种组合物在治疗和预防黄病毒感染中的用途。

黄病毒是一类阳性单链包膜RNA病毒，可能感染人类并严重威胁公共健康。尤其是，黄病毒是寨卡热（Zika fever）、登革热、黄热病和西尼罗河热的病原体。这些疾病通常以包括发热、呕吐、头痛、关节痛和肌肉痛的症状为特征，尽管每种疾病也可能伴有更严重的症状。例如，寨卡病毒在怀孕期间的母婴传播可能导致脑畸形，并且寨卡病毒感染也与格林-巴雷综合征（Guillain-Barré syndrome）有关。 登革热可能发展成威胁生命的登革出血热综合症或登革热休克综合症。黄热病可能会引起肝脏损害，从而导致出血和肾脏问题。 西尼罗河热可能扩散到神经系统，引起脑炎或脑膜炎。

黄病毒是虫媒病毒，这意味着它们是通过受感染的节肢动物媒介（例如蚊子和壁虱）传播的。 黄病毒的地理分布主要由节肢动物媒介决定。 在大多数情况下，这些媒介仅限于热带和亚热带地区，例如东南亚和南美。 但是，气候变化似乎正在扩大某些病媒的分布，从而增加处于感染黄病毒感染风险的人群。 此外，已经证明引起传播寨卡病毒和黄热病病毒的蚊子能够适应高密度城市地区的生存。 因此，重要的是找到有效的方法来遏制黄病毒感染。

尽管某些黄病毒（例如西尼罗河病毒）仅偶然感染人类，但其他黄病毒（例如黄热病病毒、登革热病毒和寨卡病毒）主要存在于节肢动物-人生命周期中。 这种黄病毒在人宿主中生长良好，病毒滴度高，使感染可以循环回节肢动物媒介并转移到新的人宿主上。 在这两种情况下，媒介引起的传播以及感染其他物种（如猴子和鸟类）的能力都意味着黄病毒感染倾向于迅速而轻松地传播。 因此，控制黄病毒感染的传播具有挑战性。

黄病毒基因组的结构也使得控制扩散更具挑战。 存在很少的用于单链RNA复制的校对和校正机制。 因此，在复制过程中产生的突变经常保留在基因组中，并传递给下一代。因此，黄病毒进化迅速。

尽管存在一种安全有效的黄热病疫苗，但寨卡病毒、登革热病毒或西尼罗河病毒并非如此。存在一种登革热病毒疫苗，但仅建议用于以前感染过登革热病毒的人，因为以前未感染过这种病毒的人的结局可能会恶化。 暴露于一种血清型的登革热病毒（例如DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4）可能会恶化随后对另一种登革热血清型的感染，因此目前正在临床试验的登革热疫苗在其制剂中包括登革热血清型。 由于寨卡病毒与登革热病毒密切相关，因此任何寨卡病毒疫苗也都需要将抗体依赖的登革热病毒感染增强的可能性降至最低。因此，需要针对寨卡病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒感染的有效疫苗。

本发明涉及黄病毒疫苗组合物，其刺激免疫反应，同时避免通常与含病毒的疫苗相关的不良临床作用。该疫苗组合物可提供针对多种黄病毒（例如寨卡病毒、登革热病毒和/或西尼罗河病毒）和/或特定物种的多种谱系或血清型（例如非洲寨卡病毒、亚洲寨卡病毒、DENV-1、 DENV-2、DENV-3和/或DENV-4）的保护。

本申请的发明人惊奇地发现，纳米颗粒（例如金纳米颗粒）可以用于诱导对设计成刺激针对黄病毒的T细胞应答的疫苗组合物的有效应答。纳米颗粒的使用消除了在疫苗组合物中使用病毒的需要。 还避免了可能在临床中与不良反应相关的传统佐剂的使用。因此，降低了个体在施用疫苗组合物后发生不良反应的可能性。

本发明人还鉴定了在不同黄病毒之间保守的并且由MHC分子呈递到被那些病毒感染的细胞上的多个肽。 在疫苗组合物中包含这种保守的肽可以赋予针对多种黄病毒和/或特定物种的多种谱系或血清型的保护能力。 在疫苗组合物中包含与不同的HLA超型结合的多个保守肽可产生对具有不同HLA类型的个体有效的疫苗。

因此，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含黄病毒肽，所述黄病毒肽包含一个或多个SEQ ID NO：1至10所示的CD8 + T细胞表位。在一些方面，所述黄病毒肽可以连接至纳米颗粒。

本发明还提供：

- 预防或治疗黄病毒感染的方法，包括将前述权利要求中任一项的疫苗组合物施用至感染黄病毒或有感染黄病毒风险的个体； 和

- 用于预防或治疗个体中黄病毒感染的方法的本发明的疫苗组合物。

图1：分析活化的PBMC的CD8水平，以确定该细胞群的扩增。 所有5种肽均导致（P1-5）细胞扩增。 无负载的T2细胞（T2）充当对照。 误差线代表重复实验的标准偏差。

图2：用肽负载的T2激活后，PBMC的CD8 +群体的CD107a表达。 所有5个肽（P1-5）表位均激活了CD8 + T细胞，以黄病毒肽特有的方式对载有肽的T2细胞作出反应。 误差线代表重复实验的标准偏差。 无负载的T2细胞（T2）充当对照。

图3：用肽负载的T2s激活后，PBMC CD8 +群体中的IFNγ表达。 所有5个肽（P1-5）表位均激活了CD8 + T细胞，以黄病毒肽特有的方式对载有肽的T2细胞作出反应。 未加载的T2细胞（T2）充当对照。 误差线代表重复样品的标准偏差。

图4：研究了用合并的寨卡肽（P1-P5）刺激的PMBC杀死寨卡病毒感染的细胞的能力。 用载有肽的T2激活PBMC。 测量了被刺激的PBMC对未感染的HepG2细胞（HepG2；对照）或被寨卡病毒（ZIKV）感染的HepG2细胞的响应（CD8 + T细胞扩增，CD107a表达，IFNγ表达）。暴露于健康HepG2细胞的Zika肽刺激的PMBC显示约3％的CD8 +细胞扩增，而暴露于寨卡感染的HepG2细胞的Zika肽刺激的PMBC显示约16％的CD8 +细胞扩增。 暴露于寨卡病毒感染的HepG2细胞的寨卡肽刺激的PMBC的CD107a表达和IFNγ表达明显高于暴露于未感染HepG2细胞的寨卡肽刺激的PMBC。 这表明PMBC可“识别”寨卡病毒感染的细胞。

图5：用200ng NP-登革热肽免疫转基因A2小鼠。 分离脾细胞，然后暴露于寨卡或登革热感染的细胞。 图5显示HepG2靶细胞含有能够模拟来自转基因A2小鼠的脾细胞的I类肽靶。 肽的酸剥离使细胞无反应。

图6：用200ng NP-登革热肽免疫转基因A2小鼠。 分离脾细胞，然后暴露于寨卡或登革热感染的细胞。 用黄病毒感染HepG2细胞会置换自身肽，并导致病毒衍生肽暴露于细胞表面，如图6所示。图6显示未免疫小鼠的脾细胞对登革热或寨卡病毒感染的细胞无反应。相反，用NP-登革热或NP-Zika肽免疫的A2小鼠能够杀死登革热或Zika感染的HepG2细胞。

本发明提供了包含黄病毒肽的疫苗组合物，所述黄病毒肽包含一个或多个SEQ ID NO：1至10所示的CD8 + T细胞表位。该疫苗组合物具有许多益处，这些益处将从下面的讨论中变得显而易见。此处总结了主要的益处。

首先，本发明的疫苗组合物有利地包含黄病毒肽，该黄病毒肽包含一个或多个SEQID NO：1至10中列出并由本申请的发明人新近鉴定的CD8 + T细胞表位。 如实施例所示，疫苗组合物因此能够刺激针对黄病毒的细胞免疫应答（例如CD8 + T细胞应答）。 CD8 +细胞毒性T淋巴细胞（CTL）通过其对感染细胞的细胞毒性活性来介导病毒清除。 因此，刺激细胞免疫可以提供抗黄病毒感染的有益防御。

其次，由本申请的发明人鉴定的许多CD8 + T细胞表位可以在许多不同的黄病毒之间是保守的，并且可以由被那些病毒感染的细胞上的MHC分子呈递。 例如，本申请的发明人已经确定，在感染寨卡病毒的细胞中表达的某些CD8 + T细胞表位与其他黄病毒（例如登革热病毒和/或西尼罗河病毒）表达的肽具有100％同源性（参见表1和2）。 在疫苗组合物中包含此类保守的肽可赋予针对多种黄病毒和/或特定黄病毒的多种谱系或血清型的保护能力，即赋予交叉保护。赋予交叉保护并不需要黄病毒之间的100％同源性。相反，如果某些残基保留在正确的位置，以与在感染寨卡病毒的细胞中表达的CD8 + T细胞表位例如约50％或更高（例如60％、70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％）同源性的序列免疫后发生交叉保护。 因此，包含一种或多种在SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位的疫苗组合物能够提供针对在表1和2中以及之外的多种现有黄病毒的交叉保护。在疫苗组合物包含一种或多种保守的肽还可赋予针对与黄病毒基因组快速进化相关的新黄病毒株的保护能力。这样，单个黄病毒疫苗组合物可用于赋予针对多种不同黄病毒的保护。 这提供了控制黄病毒感染传播的经济有效的方法。

第三，由本申请的发明人鉴定的不同CD8 + T细胞表位能够结合不同的HLA超型。将多种肽（每种包含能够结合不同HLA超型的CD8 + T细胞表位）包含在内使得所产生的疫苗组合物对具有不同HLA类型的个体有效。这样，单个黄病毒疫苗组合物可用于在很大比例的人口中提供保护。 这再次提供了控制黄病毒感染传播的经济有效的手段。

第四，包含在本发明的疫苗组合物中的黄病毒肽可以附着于纳米颗粒，例如金纳米颗粒。如下面更详细描述的，与纳米颗粒的附着减少或消除了在疫苗组合物中包括佐剂的需要。因此，本发明的疫苗组合物在施用于个体时不太可能引起负面临床作用。

肽

本发明的疫苗组合物包含黄病毒肽，其包含一种或多种在SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位。该疫苗组合物可以包含约1至约50个这样的肽，例如约2至40、3至30、4至25、5至20、6至15、7、8、9或10个这样的肽。 表1列出了SEQ ID NO：1至10。

表 1。

包含在SEQ ID NO：1至10中列出的一个或多个CD8 + T细胞表位的黄病毒肽可以仅包含一个在SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位。作为替代，包含在SEQ ID NO：1至10中列出的一个或多个CD8 + T细胞表位的黄病毒肽可以以任何组合包含两个或更多个（例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、或九个或更多个）在SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位。包含在SEQ IDNO：1至10中列出的一个或多个CD8 + T细胞表位的黄病毒肽可以包含在SEQ ID NO：1至10中列出的所有CD8 + T细胞表位。

除在SEQ ID NO：1至10中列出的一个或多个CD8 + T细胞表位外，黄病毒肽还可以包含一个或多个其他CD8 + T细胞表位、一个或多个CD4 + T细胞表位和/或一个或多个B细胞表位。 例如，黄病毒肽可以包含两个或更多个（例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个）除在SEQ ID NO：1至10中列出的那些以外的CD8 + T细胞表位。黄病毒肽可包含两个或更多个（例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个）CD4 + T细胞表位。 黄病毒肽可包含两个或更多个（例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个）B细胞表位。

所述疫苗组合物可包含两种或更多种黄病毒肽，每种包含具有选自SEQ ID NO：1至10的不同序列的CD8 + T细胞表位。每种黄病毒肽可具有前述段落中列出的任一性质。例如，每种黄病毒肽可包含多个在SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位，并且任选地包含一个或多个其他CD8 + T细胞表位、一个或多个CD4 + T细胞表位和/或一个或多个B细胞表位。 在一个方面，该疫苗组合物可包含三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种或九种或更多种黄病毒肽，每种包含具有选自SEQ ID NO：1至10的不同序列的CD8 + T细胞表位。该疫苗组合物可以例如包含10种黄病毒肽，每种包含具有选自SEQ ID NO：1至10的不同序列的CD8 + T细胞表位。

该疫苗组合物可以进一步包含一种或多种（例如约1至50、2至40、3至30、4至25、5至20、6至15、7、8、10或10种）另外的肽，每种包含一个或更多个表位。该表位可以是CD8+ T细胞表位、CD4+ T细胞表位和/或B细胞表位。CD8+ T细胞表位优选是除SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位以外的CD8 + T细胞表位。例如，CD8+ T细胞表位可以是黄病毒CD8+表位，即，由一种或多种黄病毒表达并且能够（i）通过I类MHC分子呈递和（ii）通过CD8+ T细胞上存在的T细胞受体（TCR）识别的肽。

作为替代，CD8+ T细胞表位可以是一种或多种黄病毒不表达的CD8 + T细胞表位。CD4+ T细胞表位可以是例如黄病毒CD4+表位，即由一种或多种黄病毒表达且能够（i）通过II类MHC分子呈递和（ii）通过 CD4+ T细胞上存在的T细胞受体（TCR）识别的肽。 或者，CD4+ T细胞表位可以是一种或多种黄病毒不表达的CD4 + T细胞表位。 CD8 +和CD4 + T细胞表位在下面更详细地描述。

黄病毒肽是由一种或多种黄病毒表达的肽。 存在多种黄病毒，包括寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和黄热病病毒，以及圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒，墨累谷（Murray Valley）脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津（Kunjin）脑炎病毒、罗西奥（Rocio）脑炎病毒、俄罗斯春夏季脑炎病毒、Negeishi病毒、Kyasanur森林病毒、鄂木斯克（Omsk）出血热病毒、Powassan病毒、Louping Ill病毒、Rio Bravo病毒、Tyuleniy病毒、Ntaya病毒和Modoc病毒。登革热病毒有四种血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4），寨卡病毒有两种毒株（非洲寨卡病毒和亚洲寨卡病毒）。

本发明的疫苗组合物中包含的任何黄病毒肽可包含由寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津脑炎病毒、罗西奥脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒、Negeishi病毒、Kyasanur森林病毒、鄂木斯克出血热病毒、Powassan病毒、Louping Ill病毒、Rio Bravo病毒、Tyuleniy病毒、Ntaya病毒 和Modoc病毒中的一种或多种表达的肽。例如，包含在本发明的疫苗组合物中的黄病毒肽可以包含由寨卡病毒和登革热病毒表达的肽，或由寨卡病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒表达的肽。例如，包含一种或多种在SEQ ID NO：1至10所示的CD8 + T细胞表位的黄病毒肽可以（i）由寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津脑炎病毒、罗西奥脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒、Negeishi病毒、Kyasanur森林病毒、鄂木斯克出血热病毒、Powassan病毒、Louping Ill病毒、Rio Bravo病毒、Tyuleniy病毒、Ntaya病毒 和Modoc病毒中的一种或多种表达； （ii）由寨卡病毒和登革热病毒表达；或（iii）由寨卡病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒表达。同样地，当组合物包含一种是黄病毒肽的额外的肽时，该额外的丝状病毒肽可以（i）由寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津脑炎病毒、罗西奥脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒、Negeishi病毒、Kyasanur森林病毒、鄂木斯克出血热病毒、Powassan病毒、Louping Ill病毒、Rio Bravo病毒、Tyuleniy病毒、Ntaya病毒 和Modoc病毒中的一种或多种表达； （ii）由寨卡病毒和登革热病毒表达；或（iii）由寨卡病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒表达。因此，该疫苗组合物可包含来自一种或多种黄病毒的黄病毒肽，例如1至20、2至19、3至18、4至17、5至16、6至15、7至14、8至13、9至12、10或11种黄病毒。

当包含在本发明的疫苗组合物中的黄病毒肽包含由寨卡病毒表达的肽时，该肽可以由非洲寨卡病毒、亚洲寨卡病毒或非洲寨卡病毒和亚洲寨卡病毒两者表达。 当本发明的疫苗组合物中包含的黄病毒肽包含由登革热病毒表达的肽时，该肽可以由DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4中的一种或多种以任何组合表达， 例如：1; 2; 3; 4; 1和2; 1和3; 1和4; 2和3; 2和4; 3和4; 1、2和3； 1、2和4； 1、3和4； 2 、3和4；或1、2、3和4。

黄病毒肽可以是在一种或多种黄病毒的表面上表达的肽，或是在一种或多种黄病毒内的细胞内表达的肽。 该肽可以是结构肽或功能肽，例如参与黄病毒的代谢或复制的肽。 优选地，该肽是内部肽。 优选地，该肽在两种或更多种不同的黄病毒或黄病毒血清型之间是保守的。肽在两种或多种不同的黄病毒或黄病毒血清型之间是保守的，是指两种或多种不同的黄病毒或黄病毒血清型中的每一种编码的序列与该肽具有50％或更高（例如60％、70％、75％、80％、90％、95%、98%或99%）的同源性。

黄病毒肽可以包含任何数目的氨基酸，即具有任何长度。 通常，黄病毒肽的长度为约8至约30、35或40个氨基酸，例如长度为约9至约29、约10至约28、约11至约27、约12至约26、约13至约25个、约13至约24、约14至约23、约15至约22、约16至约21、约17至约20或约18至约29个氨基酸。

黄病毒肽可以化学地衍生自多肽黄病毒抗原，例如通过蛋白水解切割得到。 更典型地，黄病毒肽可以使用本领域众所周知的方法合成。

术语“肽”不仅包括其中氨基酸残基通过肽（-CO-NH-）键连接的分子，还包括其中肽键反向的分子。 可以使用本领域已知的方法制备这种逆反（retro-inverso）肽模拟物，例如在Meziere等人（1997）J.Immunol.159, 3230-3237中描述的那些。 该方法涉及制备肽模拟物，该肽模拟物包含涉及骨架的变化，而不涉及侧链的方向。 Meziere等人（1997）表明，至少对于II类MHC和T辅助细胞反应，这些肽模拟物是有用的。 包含NH-CO键而不是CO-NH肽键的逆反肽更能对抗蛋白水解。

类似地，只要使用保留氨基酸残基的碳原子之间的间隔的合适的接头部分，就可以完全省去肽键；特别优选的是，接头部分具有与肽键基本相同的电荷分布和基本相同的平面性。 还应理解，该肽可方便地在其N-或C-末端被封闭，以帮助降低对胞外消化的敏感性。 例如，可以通过与羧酸反应来保护肽的N-末端氨基，并且可以通过与胺反应来保护肽的C-末端羧基。 修饰的其他实例包括糖基化和磷酸化。 另一种可能的修饰是R或K的侧链胺上的氢可以被亚甲基取代（-NH2可以修饰为-NH(Me)或-N(Me)2）。

术语“肽”还包括增加或减少肽的体内半衰期的肽变体。能够增加本发明使用的肽的半衰期的类似物的实例包括肽的类肽类似物、肽的D-氨基酸衍生物和肽-类肽杂化物。根据本发明使用的变体多肽的另一个实施方案包括该多肽的D-氨基酸形式。用D-氨基酸而不是L-氨基酸制备多肽大大减少了这种试剂通过正常的代谢过程的任何不希望的分解，减少了需要给药的试剂的量及其给药频率。

CD8+ T细胞表位

本发明的疫苗组合物包含黄病毒肽，其包含一个或多个在SEQ ID NO：1至10所示的CD8+ T细胞表位（参见表1）。 包含一个或多个在SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位的黄病毒肽可以进一步包含一个或多个（例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个）其他CD8 + T细胞表位。 该疫苗组合物可进一步包含一种或多种（例如1至50、2至40、3至30、4至25、5至20、6至15、7、8、9或10种）另外的肽，每种包含一个或多多个CD8 + T细胞表位。 优选地，该另外的肽是黄病毒肽。

CD8+ T细胞表位是能够（i）通过I类MHC分子呈递和（ii）通过存在于CD8 + T细胞上的T细胞受体（TCR）识别的肽。 优选地，TCR的识别导致CD8 + T细胞的活化。 CD8 + T细胞活化可导致增殖增加、细胞因子产生和/或细胞毒性作用。

通常，CD8 + T细胞表位的长度约为9个氨基酸。 CD8 + T细胞表位可以更短或更长。 例如，CD8 + T细胞表位的长度可以是约8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。 CD8 + T细胞表位的长度可以是约8至15、9至14或10至12个氨基酸。

包含CD8 + T细胞表位的黄病毒肽是本领域已知的。 鉴定CD8 + T细胞表位的方法是本领域已知的。 表位作图的方法包括X射线共结晶、基于阵列的寡肽扫描（有时称为重叠肽扫描或pepscan分析）、定点诱变、高通量诱变作图、氢-氘交换、交联偶联质谱法、噬菌体展示和有限的蛋白水解。也可以使用 MHC基序预测方法。

可以鉴定由黄病毒感染的细胞呈递的CD8 + T细胞表位，以便直接鉴定用于包含在疫苗组合物中的CD8 + T细胞表位。 这是一种有效且合乎逻辑的方法，可以单独使用，也可以用于确认通过MHC基序预测方法确定的潜在CD8 + T细胞表位的实用性。 本申请的发明人使用该方法来鉴定SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位（参见实施例1）。

要进行该方法，将细胞感染黄病毒，并在37℃左右的温度下培养72小时左右。 培养后，收获细胞并洗涤。 接下来，例如通过均质化并在含有1％NP40的缓冲液中冷冻/融化来裂解细胞。 通过以2000 rpm离心30分钟除去细胞碎片来澄清裂解物。

然后，使用涂有W6 / 32（识别泛I类MHC分子的单克隆抗体）的蛋白A / G微珠（UltraLink Immobilized Protein A/G, pierce, Rockford, IL），通过免疫亲和色谱法从裂解物中分离MHC /肽复合物。 为了用抗体包被微珠，将微珠用低pH缓冲液洗涤，然后用PBS冲洗，在室温下与0.5mg抗体孵育2小时，并洗涤3次以除去未结合的抗体。 对于免疫亲和色谱，将包被的微珠与裂解物在室温下连续摇动孵育2小时。 然后通过以1000 rpm离心5分钟将微珠与裂解物分离。 通过添加pH 1.5的0.1％三氟乙酸（TFA）将结合的MHC复合物从微珠上洗脱下来。

接下来将洗脱液在85ºC加热15分钟，以使结合的肽与MHC分子解离。 冷却至室温后，使用例如截留分子量为3kDa的膜过滤器（Millipore）通过离心将肽与抗体分离。 使用真空离心将滤液浓缩，并重构至最终体积为100μl。 纯化的肽混合物例如通过使用离线HPLC的C-18反相（RP）柱（例如4.6mm直径×150mm长度）分级分离。 对于此步骤，流动相A可以是水中的2％乙腈（CAN）和0.1％甲酸（FA），而流动相B可以是在水中的0.1％FA和90％CAN。

然后将含有肽的级分从柱上洗脱，在真空下干燥，并通过质谱分析以鉴定级分的序列。 然后可以针对所有数据库中的黄病毒蛋白搜索获得的光谱数据，以鉴定与黄病毒相关的肽序列。 然后可以根据鉴定的序列制备合成肽，并进行质谱分析，以确认它们与含肽馏分中的肽相同。

在这种方法中，任何类型的细胞都可以用黄病毒感染。 所述细胞可以是抗原呈递细胞。 所述细胞可以是肝癌细胞，例如HepG2细胞、EBV转化的淋巴母细胞B细胞（例如JY细胞）或淋巴母细胞（例如T2细胞）。

同样，任何感兴趣的黄病毒都可以用于感染细胞。 例如，黄病毒可以是寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、昆津脑炎病毒、罗西奥脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒、Negeishi病毒、Kyasanur森林病毒、鄂木斯克出血热病毒、Powassan病毒、Louping Ill病毒、Rio Bravo病毒、Tyuleniy病毒、Ntaya病毒 和Modoc病毒。 寨卡病毒可以是例如非洲寨卡病毒或亚洲寨卡病毒。 登革热病毒可以是例如DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4。

与MHC基序预测方法相比，黄病毒感染的细胞所呈现的CD8 + T细胞表位的直接鉴定是有利的。免疫表位数据库（IEDB; http://www.iedb.org）是通过基序预测方法而非功能方法生成的，并且包含许多预测的HLA特异性黄病毒T细胞表位，包括一些具有高MHC结合评分和有限CTL表征的共享表位。由于黄病毒感染的细胞可能会同时出现显性和次显性（subdominant）表位，因此很难使用数据库来整理出天然存在的表位的显性层次（dominance hierarchies）。 因此，仅从免疫表位数据库尚不清楚，当包含在疫苗组合物中时，预期哪些所列出的表位可以有效诱导CD8 + T细胞应答。 上面提出的直接识别方法提供了用于确认表位的效用的机制。

基于由黄病毒感染的细胞所呈递的表位的疫苗组合物，例如本发明的疫苗组合物，优于基于病毒蛋白亚基或基序预测的表位的疫苗。 免疫系统对蛋白质的加工可能会改变天然病毒表位。 将疫苗组合物建立在被证明可被感染的细胞呈递的肽基础上，消除了这种不确定性，因为肽已经过蛋白质加工。

此外，直接鉴定方法可用于鉴定由不同黄病毒感染的细胞呈递的保守CD8 + T细胞表位。 以此方式，可以鉴定出适合包含在交叉保护性疫苗中的CD8 + T细胞表位。 如实施例所述，本申请的发明人证实了肽SPRRLAAAV（SEQ ID NO：3）和肽PFGDSYIVIGVGE（SEQ IDNO：6）是寨卡病毒CD8 + T细胞表位，与登革热病毒编码的序列具有100％的同源性，并且WVTDHSGKTV（SEQ ID NO：5）是登革热病毒CD8 + T细胞表位，与寨卡病毒和西尼罗河病毒编码的序列具有100％的同源性。

交叉保护性疫苗组合物

由本申请的发明人鉴定的SEQ ID NO：1至10的每一个是（i）衍生自寨卡病毒感染的细胞，或（ii）衍生自登革热病毒感染的细胞，但与寨卡病毒编码的序列100％同源。 因此，本发明的疫苗组合物被设计为引发针对寨卡病毒感染的保护性免疫应答。 然而，由于SEQ IDNO：1至10在黄病毒之间是高度保守的，因此该疫苗组合物还可诱导针对多种其他黄病毒的交叉保护。

如表1所示，SEQ ID NO：1至10中列出的许多CD8 + T细胞表位与非该表位最初被鉴定所在的黄病毒所编码的序列具有100%同源性。 例如，在感染寨卡病毒的细胞中鉴定了SPRRLAAAV（SEQ ID NO：3）和PFGDSYIVIGVGE（SEQ ID NO：6），但是它们各自与登革热病毒编码的序列100％同源。WVTDHSGKTV（SEQ ID NO：5）在登革热病毒感染的细胞中被鉴定，但是与寨卡病毒编码的序列和西尼罗河病毒编码的序列具有100％的同源性。通过接种包含与来自另一种黄病毒的序列100％同源的表位的组合物而产生的免疫应答可以防止随后感染该黄病毒。

通过接种包含与由另一种黄病毒编码的序列具有约50％或更多（例如60％、70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％）同源性的表位的组合物而产生的免疫应答可以防止随后被该黄病毒感染。 在某些情况下，保护作用与该表位和其他黄病毒编码序列之间某些残基的保守性有关。 因此，用本发明的疫苗组合物免疫可诱导针对表1或表2中未提及的多种黄病毒的保护性免疫应答。

因此，本发明的疫苗组合物可以具有内在的交叉物种和/或交叉属功效，即是交叉保护性黄病毒疫苗组合物。 以这种方式，单个黄病毒疫苗组合物可用于赋予针对多种不同黄病毒的保护。 这提供了控制黄病毒感染传播的经济有效的方法。

疫苗组合物中包含保守的肽可以赋予针对与黄病毒基因组快速进化相关的新兴黄病毒株的保护能力。 这可能有助于黄病毒感染的长期控制。

在本发明的疫苗组合物中包含具有保守的CD8 + T细胞表位的黄病毒肽可以有益地预防或最小化施用疫苗组合物后登革热病毒感染的抗体依赖性增强的发展。

与HLA超型的相互作用

所述疫苗组合物可包含至少两种黄病毒肽，所述至少两种黄病毒肽包含分别与不同的HLA超型相互作用的CD8 + T细胞表位。 在疫苗组合物中包括多种这样的肽使得疫苗组合物能够在更大比例的被施用疫苗组合物的个体中引发CD8 + T细胞应答。 这是因为疫苗组合物应该能够在与多种黄病毒肽中所包含的CD8 + T细胞表位之一相互作用的HLA超型的所有个体中引起CD8 + T细胞应答。 每个CD8 + T细胞表位可以与HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B44、HLA-B58或HLA-B62或本领域已知的任何其他HLA超型相互作用。 包含这种CD8 + T细胞表位的黄病毒肽的任何组合都是可能的。

所述疫苗组合物可包含至少一种黄病毒肽，其包含与至少两种不同的HLA超型相互作用的CD8 + T细胞表位。同样，这允许疫苗组合物在更大比例的施用了疫苗组合物的个体中引起CD8 + T细胞应答。该疫苗组合物可包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少两个、至少十五个或至少二十个包含CD8 + T细胞表位的黄病毒肽，每个与至少两个不同的HLA亚型相互作用。每种黄病毒肽可与至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的HLA超型相互作用。每个黄病毒肽均可与HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B27、HLA-B44、HLA-B58或HLA-B62或本领域已知的任何其他HLA超型中以任何方式组合的两个或多个相互作用。优选地，该疫苗组合物包含黄病毒肽，其包含与HLA-A2和HLA-24相互作用的CD8 + T细胞表位。在这种情况下，该疫苗组合物可以例如包含丝状病毒肽，所述丝状病毒肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：8所示的CD8 + T细胞。

CD4+ T细胞表位

本发明的疫苗组合物可以包含含有CD4 + T细胞表位的肽。该疫苗组合物可以包含两个或更多个含有CD4 + T细胞表位的肽，例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、或二十个或更多个。 CD4 + T细胞表位是能够（i）通过II类MHC分子呈递和（ii）通过CD4 + T细胞上存在的T细胞受体（TCR）识别的肽。 优选地，TCR的识别导致CD4 + T细胞的活化。 CD4 + T细胞活化可能导致增殖和/或细胞因子产生增加。

CD4 + T细胞表位可以是黄病毒CD4 + T细胞表位。 即，CD4 + T细胞表位可以是由一种或多种黄病毒表达的肽，其能够（i）由II类MHC分子呈递和（ii）被存在于CD4 + T细胞上的T细胞受体（TCR）识别。这样的肽在本领域是已知的。

CD4 + T细胞表位可以是黄病毒CD4 + T细胞表位以外的CD4 + T细胞表位。 例如，CD4 + T细胞可以由黄病毒以外的生物表达。 CD4 + T细胞表位可以例如由破伤风梭菌（Clostriudium tetani）表达。 例如，CD4 + T细胞表位可以源自破伤风毒素。

CD4 + T细胞表位可以是与所有II类HLA类型反应的CD4 + T细胞表位，即所谓的“混杂（promiscuous）”表位。 疫苗组合物中包含混杂表位可以提高疫苗组合物诱导针对黄病毒肽的免疫应答的能力，所述黄病毒肽包含在SEQ ID NO：1至10中列出的一种或多种CD8+ T细胞表位。CD4 + T细胞表位可以例如包含序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA（SEQ ID NO：11）和/或序列LQTMVKLFNRIKNNVAGGC（SEQ ID NO：12）。 SEQ ID NO:11和12是源自破伤风毒素的混杂表位。

包含CD4 + T细胞表位的肽可以是不同于包含一个或多个在SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位的黄病毒肽的肽。例如，CD4+ T表位可以被包含在疫苗组合物中的另外的肽中，即在不包含SEQ ID NO：1至10中列出的一个或多个CD8 + T细胞表位的肽中。如上所述，所述另外的肽可以包含一个或多个CD8 +中 T细胞表位和/或一个或多个B细胞表位以及CD4 + T细胞表位。 例如，所述另外的肽可以包含一个或多个黄病毒CD8 + T细胞表位。

包含CD4 + T细胞表位的肽可以是与包含一个或多个在SEQ ID NO：1至10所示CD8+ T细胞表位的黄病毒肽相同的肽。即，包含一个或多个在SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 +T细胞表位的黄病毒肽可进一步包含CD4 + T细胞表位。

当包含CD4 + T细胞表位的肽还包含CD8 + T细胞表位（例如SEQ ID NO：1至10中列出的一个或多个CD8 + T细胞表位）时，CD8 +表位可以嵌套在CD4 + T细胞表位中。 CD4+ T细胞表位通常比CD8 + T细胞表位长。因此，延伸CD8 + T细胞表位的一个或两个末端可以产生更长的CD4 + T细胞表位，其序列仍然包含CD8 + T细胞表位。因此，CD4 + T细胞表位可以包含在其N-末端或C-末端延伸的CD8 + T细胞表位，例如SEQ ID NO：1至10中列出的CD8 + T细胞表位。 CD8 + T细胞表位可以在其N末端延伸1、2、3、4或5个氨基酸。 CD8 + T细胞表位可以在其C末端延伸1、2、3、4或5个氨基酸。优选地，CD8 + T细胞表位在N末端延伸3个氨基酸，在C末端延伸3个氨基酸。但是，CD8 + T细胞表位不需要在每个末端延伸相同数目的氨基酸。

嵌套在CD4 + T细胞表位中的CD8 + T细胞表位可能能够产生强大的CTL反应。 延伸的肽（CD4 + T细胞表位）可能能够诱导T辅助细胞介导的细胞因子应答。 因此，在疫苗组合物中包含含有CD8 + T细胞表位和CD4 + T细胞表位的黄病毒肽可以使疫苗组合物诱导细胞毒性应答和辅助T细胞应答。

包含CD4 + T细胞表位的黄病毒肽可以连接至纳米颗粒。 当包含CD4 + T细胞表位的肽不同于包含一个或多个在SEQ ID NO：1至10所示CD8 + T细胞表位的黄病毒肽时，每种肽可以连接到同一纳米颗粒或不同的纳米颗粒。 纳米颗粒可以是金纳米颗粒。 纳米颗粒及与纳米颗粒的连接在下面描述。

B细胞表位

本发明的疫苗组合物可以包含含有B细胞表位的肽。该疫苗组合物可以包含两个或更多个（例如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个或二十个或更多个）包含B细胞表位的肽。 B细胞表位是能够被B细胞上存在的B细胞受体（BCR）识别的肽。 优选地，被BCR识别导致B细胞的活化和/或成熟。 B细胞活化可能导致增殖增加和/或抗体产生。

B细胞表位可以是黄病毒CD4 + T细胞表位。 即，B细胞表位可以是由一种或多种黄病毒表达的并且能够被存在于B细胞上的B细胞受体（BCR）识别的肽。 这样的肽是本领域已知的。

B细胞表位可以是线性表位，即由丝状病毒蛋白的特定区域的一级氨基酸序列定义的表位。 或者，该表位可以是构象表位，即由天然黄病毒蛋白的构象结构定义的表位。在这种情况下，表位可以是连续的（即与抗体相互作用的成分在蛋白质上依次相邻）或不连续的（即与抗体相互作用的成分在蛋白质的不同部位上，但在折叠的天然蛋白质结构中彼此靠近）。

通常，B细胞表位的长度为约5至20个氨基酸，例如长度为6至19、7至18、8至17、9至16、10至15、11至14或12至13个氨基酸。

鉴定B细胞表位的方法在本领域中也是已知的。 例如，表位作图方法可用于鉴定B细胞表位。 这些方法包括结构方法，其中蛋白质的已知或模型结构用于基于算法的方法中以预测表面表位，以及功能方法，其中可以定量分析完整蛋白质、蛋白质片段或肽与抗体的结合，例如使用酶联免疫吸附测定（ELISA）。 也可以使用竞争作图抗原修饰或蛋白质片段化方法。

纳米颗粒

在本发明的疫苗组合物中，包含一个或多个SEQ ID NO：1至10所示的CD8 + T细胞表位的黄病毒肽可以连接至纳米颗粒。 该疫苗组合物中进一步包含的任何其他肽也可以连接至纳米颗粒。 附着至纳米颗粒（例如金纳米颗粒）是有益的。

如上所述，并在以下实施例中证明，肽附着至纳米颗粒（例如金纳米颗粒）减少或消除了在疫苗组合物中包括病毒或佐剂的需要。 纳米颗粒可能包含免疫“危险信号”，有助于有效诱导对肽的免疫反应。 纳米颗粒可以诱导强烈的免疫应答所需的树突状细胞（DC）活化和成熟。 纳米颗粒可以包含非自身组分，该非自身组分改善了纳米颗粒的吸收，从而改善了诸如抗原呈递细胞等细胞对肽的吸收。 因此，肽附着至纳米颗粒可以增强抗原呈递细胞刺激病毒特异性T和/或B细胞的能力。 附着到纳米颗粒上还促进了疫苗组合物通过皮下、皮内、透皮和口服/颊部途径的递送，从而提供了给药的灵活性。

纳米颗粒是尺寸在1到100纳米（nm）之间的颗粒，可用作固定配体的基质。 在本发明的疫苗组合物中，纳米颗粒的平均直径可以为1至100、20至90、30至80、40至70或50至60nm。 优选地，纳米颗粒的平均直径为20至40nm。 20至40nm的平均直径促进纳米颗粒被吸收到胞质溶胶中。 可以使用本领域众所周知的技术（例如透射电子显微镜）来测量平均直径。

适用于递送抗原（例如黄病毒肽）的纳米颗粒是本领域已知的。 用于生产此类纳米颗粒的方法也是已知的。

纳米颗粒可以例如是聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒、脂质体、免疫刺激复合物（ISCOM）、病毒样颗粒（VLP）或自组装蛋白。 纳米颗粒优选为磷酸钙纳米颗粒、硅纳米颗粒或金纳米颗粒。

纳米颗粒可以是聚合物纳米颗粒。 聚合物纳米颗粒可包含一种或多种合成聚合物，例如聚(d,l-丙交酯-乙交酯)共聚物（PLG）、聚（d,l-乳酸-乙醇酸）共聚物（PLGA）、聚（g-谷氨酸）（g-PGA）m聚乙二醇（PEG）或聚苯乙烯。聚合物纳米颗粒可包含一种或多种天然聚合物，例如多糖，例如支链淀粉、藻酸盐、菊粉和壳聚糖。使用聚合物纳米颗粒可因可以包括在纳米颗粒中的聚合物的性质而是有利的。 例如，上述天然和合成聚合物可具有良好的生物相容性和生物降解性、无毒性质和/或被操纵成所需形状和大小的能力。 聚合物纳米颗粒可以形成水凝胶纳米颗粒。

水凝胶纳米颗粒是一种纳米尺寸的亲水三维聚合物网格类型的纳米颗粒。 水凝胶纳米颗粒具有良好的性能，包括灵活的筛孔尺寸、大的多价结合表面积、高水含量和高抗原负载能力。 诸如聚（L-乳酸）（PLA）、PLGA、PEG和多糖的聚合物都特别适用于形成水凝胶纳米颗粒。

纳米颗粒可以是无机纳米颗粒。 通常，无机纳米颗粒具有刚性结构并且是不可生物降解的。 然而，无机纳米颗粒可以是生物可降解的。 无机纳米颗粒可以包括其中可以封装抗原的壳。 无机纳米颗粒可以包含可以与抗原共价结合的核。 核可以包括金属。 例如，核可以包含金（Au）、银（Ag）或铜（Cu）原子。 核可以由一种以上类型的原子形成。 例如，核可以包括合金，例如Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd或Au/Ag/Cu/Pd的合金。 核可以包含磷酸钙（CaP）。 核可以包括半导体材料，例如硒化镉。

其他示例性的无机纳米颗粒包括碳纳米颗粒和二氧化硅基纳米颗粒。 碳纳米颗粒具有良好的生物相容性，可以合成为纳米管和中孔球。 二氧化硅基纳米颗粒（SiNPs）具有生物相容性，且制备时结构参数可调以适合其治疗应用。

纳米颗粒可以是硅纳米颗粒，例如元素硅纳米颗粒。 纳米颗粒可以是介孔的或具有蜂窝孔结构。 优选地，纳米颗粒是具有蜂窝孔结构的元素硅颗粒。 这样的纳米颗粒在本领域中是已知的，并且提供可调节和受控的药物负载、靶向和释放，其可以适应几乎任何负载物、施用途径、靶标或释放曲线。 例如，这样的纳米颗粒可以增加其负载物的生物利用度，和/或改善口服活性物质的肠渗透性和吸收。 纳米颗粒由于其多孔结构和大表面积而可能具有异常高的负载能力。 取决于它们的物理性质，纳米颗粒可以在几天、几周或几个月内释放它们的负载物。

由于硅是人体的天然成分，因此纳米粒子可能不会引起免疫系统的反应。 这对于纳米颗粒的体内安全性是有利的。

上述的任何SiNP都可以是可生物降解的或不可生物降解的。 可生物降解的SiNP可能溶解为原硅酸（硅的可生物利用形式）。 已显示原硅酸对骨骼、结缔组织、头发和皮肤的健康有益。

纳米颗粒可以是脂质体。 脂质体通常由可生物降解的、无毒的磷脂形成，并包含具有水性核的自组装磷脂双层壳。 脂质体可以是包含单个磷脂双层的单层囊泡，也可以是包含由水层隔开的几个同心磷脂壳的多层囊泡。 因此，脂质体可被调整为将亲水性分子掺入到水性核中或将疏水性分子掺入磷脂双层中。脂质体可以将抗原包封在核中以进行递送。 脂质体可将病毒包膜糖蛋白掺入壳中以形成病毒体。 许多基于脂质体的产品在本领域中已经建立并且被批准用于人类。

纳米颗粒可以是免疫刺激复合物（ISCOM）。 ISCOM是笼状颗粒，通常由含胶体皂苷的胶束形成。 ISCOM可包含胆固醇、磷脂（例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱）和皂苷（例如来自皂树Quillaia saponaria的Quil A）。 传统上，ISCOM被用于捕获病毒包膜蛋白，例如来自1型单纯疱疹病毒、乙型肝炎或流感病毒的包膜蛋白。

纳米颗粒可以是病毒样颗粒（VLP）。 VLP是缺少传染性核酸的自组装纳米颗粒，其是由生物相容性衣壳蛋白自组装形成的。 VLP的直径通常为约20至约150nm，例如约20至约40nm、约30至约140nm、约40至约130nm、约50至约120nm、约60至约110nm、约70至约100nm、或约80nm 至约90nm。 VLP有利地利用了进化出的病毒结构的力量，而自然地优化了它与免疫系统的相互作用。 自然优化的纳米颗粒大小和重复的结构顺序意味着，即使在没有佐剂的情况下，VLP也会诱导有效的免疫反应。

纳米颗粒可以是自组装蛋白。 例如，纳米颗粒可以包含铁蛋白。 铁蛋白是一种可以自组装成近球形的10 nm结构的蛋白质。 纳米颗粒可包含主穹隆蛋白（MVP）。 96个MVP单元可以自组装成桶形的穹隆纳米粒，大小约为40 nm宽和70 nm长。

纳米颗粒可以是磷酸钙（CaP）纳米颗粒。 CaP纳米颗粒可包含核，该核包含一个或多个（例如两个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、或500个或更多个）CaP分子。 CaP纳米颗粒及其生产方法是本领域已知的。例如，可以通过在恒定混合下以预定比例混合钙和磷酸盐的无机盐溶液来产生CAP纳米颗粒的稳定的纳米悬浮液。

CaP纳米颗粒可具有约80至约100nm（例如约82至约98nm、约84至约96nm、约86至约94nm或约88至约92nm）的平均粒度。 在免疫细胞摄取和免疫反应方面，该粒径可能比其他较大粒径产生更好的性能。 例如当在1个月、2个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月、36个月或48个月的时期内测量时，粒度可以是稳定的（即没有显示出显著变化）。

CaP纳米颗粒可以与一种或多种抗原共同配制，所述抗原或吸附在纳米颗粒的表面上，或在颗粒合成过程中与CaP共沉淀。 例如，可通过以下方法将肽（例如黄病毒肽）附着至CaP纳米颗粒：将肽溶解在DMSO中（例如，浓度约为10 mg / ml），加至CaP纳米颗粒与N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）（例如在0.093mol / L）和超纯水的悬浮液中，在室温下混合约4小时（例如1小时、2小时、3小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时）。

所述疫苗组合物可包含约0.15至约0.8％（例如0.2至约0.75％、0.25至约0.7％、0.3至约0.6％、0.35至约0.65％、0.4至约0.6％或0.45至约0.55％）的CaP纳米颗粒。 优选地，疫苗组合物包含约0.3％的CaP纳米颗粒。

CaP纳米颗粒由于与人类硬组织（例如骨骼和牙齿）的化学相似性而具有高度的生物相容性。 因此，有利地，CaP纳米颗粒在用于治疗应用时是无毒的。 CaP纳米颗粒可通过肌肉内、皮下、口服或吸入途径安全给药。 CaP纳米颗粒也很容易在商业上合成。 此外，CaP纳米颗粒可能与抗原的缓慢释放有关，这可能会增强对附着于纳米颗粒的肽的免疫反应的诱导。 CaP纳米颗粒既可以用作佐剂，也可以用作药物递送载体。

纳米颗粒可以是金纳米颗粒。 金纳米颗粒是本领域已知的，并且特别描述于WO2002/32404、WO 2006/037979、WO 2007/122388、WO 2007/015105和WO 2013/034726中。 附着于每个肽的金纳米颗粒可以是在WO 2002/32404、WO 2006/037979、WO 2007/122388、WO2007/015105和WO 2013/034726中的任何一个中描述的金纳米颗粒。

金纳米颗粒包括包含金（Au）原子的核。 核可进一步包含一种或多种Fe、Cu或Gd原子。 核可以由金合金形成，例如Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd。核的原子总数可以是100至500个原子，例如150至450、200至400或250至350个原子。 金纳米颗粒可以具有1至100、20至90、30至80、40至70或50至60nm的平均直径。 优选地，金纳米颗粒的平均直径为20至40nm。

纳米颗粒可以包括包覆有α-半乳糖和/或β-GlcNHAc的表面。 例如，纳米颗粒可以包含被α-半乳糖和/或β-GlcNHAc钝化的表面。 在这种情况下，纳米颗粒可以例如是包括核的纳米颗粒，其中核包含金属和/或半导体原子。 例如，纳米颗粒可以是金纳米颗粒。Beta-GlcNHAc是一种细菌病原体相关分子模式（PAMP），能够激活抗原呈递细胞。 以这种方式，包含被β-GlcNHAc包覆或钝化的表面的纳米颗粒可以非特异性地刺激免疫应答。 因此，包含SEQ ID NO：1至10所示的一个或多个CD8 + T细胞表位的黄病毒肽与这种纳米颗粒的连接可以改善由向个体施用本发明的疫苗组合物引起的免疫应答。

除肽以外的一种或多种配体可以连接至纳米颗粒，其可以是上述纳米颗粒的任何类型。 配体可以形成“冠状物（corona）”，可以部分或完全覆盖核的表面的层或涂层。 冠状物可被认为是围绕或部分围绕纳米颗粒核的有机层。 冠状物可以提供或参与钝化纳米颗粒的核。 因此，在某些情况下，冠状物可以是使核稳定的足够完整的涂层。 冠状物可以促进本发明的纳米颗粒的溶解度（例如水溶性）。

纳米颗粒可以包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个或至少50个配体。 配体可包括一种或多种肽、蛋白质结构域、核酸分子、脂质基团、碳水化合物基团、阴离子基团或阳离子基团、糖脂和/或糖蛋白。 碳水化合物基团可以是多糖、寡糖或单糖基团（例如葡萄糖）。 一种或多种配体可以是非自身组分，由于其与致病组分的相似性，使得纳米颗粒更可能被抗原呈递细胞吸收。 例如，一种或多种配体可以包含碳水化合物部分（例如细菌碳水化合物部分）、表面活性剂部分和/或谷胱甘肽部分。 示例性配体包括葡萄糖、N-乙酰基葡糖胺（GlcNAc）、谷胱甘肽、2'-硫代乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷和2'-硫代乙基-D-吡喃葡萄糖苷。 优选的配体包括糖缀合物，其形成糖纳米颗粒。

接头可以促进配体与核的连接。 接头可包含巯基、烷基、二醇基或肽基。 例如，接头可以包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇。 接头可以包含能够共价附接到核的含硫基团、含氨基基团、含磷酸盐基团或含氧基团。 可选地，配体可以例如通过配体中包含的含硫基团、含氨基基团、含磷酸盐基团或含氧基团直接连接至核。

连接至纳米颗粒

所述肽可以在其N端附着于纳米颗粒。 通常，肽附着于纳米颗粒的核，但附着于冠状物或配体上也是可能的。

所述肽可以例如通过使肽中的含硫基团、含氨基基团、含磷酸盐基团或含氧基团中的原子与纳米颗粒或其核中的原子共价键合而与纳米颗粒直接连接。

接头可用于将肽连接至纳米颗粒。 接头可以包含能够共价附接至核中的原子的含硫基团、含氨基基团、含磷酸盐基团或含氧基团。例如，接头可以包含硫醇基、烷基、二醇基或肽基。

接头可包含肽部分和非肽部分。 肽部分可以包含序列X1X2Z1，其中X1是选自A和G的氨基酸；X2是选自A和G的氨基酸； Z1是选自Y和F的氨基酸。肽部分可以包含序列AAY或FLAAY。 接头的肽部分可以与肽的N-末端连接。 接头的非肽部分可包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇，例如硫乙基（thioethyl group）或硫丙基（thiopropyl group）。

接头可以是（i）HS-(CH2)2-CONH-AAY；（ii）HS-(CH2)2-CONH-LAAY; （iii）HS-(CH2)3-CONH-AAY; （iv）HS-(CH2)3-CONH- FLAAY; （v）HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY; （vi）HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY。 在这种情况下，接头的非肽部分的硫醇基将接头连接至核。

用于将肽附接到纳米颗粒的其他合适的接头是本领域已知的，并且可以被本领域技术人员容易地识别和实施。

如上文所解释，疫苗组合物可包含多种黄病毒肽，其各自包含在SEQ ID NO：1至9所示的一个或多个CD8 + T细胞表位。疫苗组合物可包含一种或多种另外的包含表位的肽，例如 CD4 + T细胞表位、B细胞表位或在SEQ ID NO：1至9所示的CD8 + T细胞表位以外的CD8 + T细胞表位。因此，疫苗组合物可以包含一种以上的肽。

当疫苗组合物包含多于一种的肽时，两种或更多种（例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种或二十种或更多种）的肽可以连接到同一纳米颗粒。两种或更多种（例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种或二十种或更多种）的肽可以分别附着于不同的纳米颗粒。 肽所附着的纳米颗粒可以是相同类型的纳米颗粒。 例如，每种肽可以连接至金纳米颗粒。 每种肽可以连接至CaP纳米颗粒。 肽所附着的纳米颗粒可以是不同类型的纳米颗粒。 例如，一种肽可以附着于金纳米颗粒，而另一种肽可以附着于CaP纳米颗粒。

本发明提供了一种预防或治疗黄病毒感染的方法，该方法包括将本发明的疫苗组合物施用于感染了黄病毒或有感染黄病毒风险的个体。 本发明还提供了用于预防或治疗个体中黄病毒感染的方法的本发明的疫苗组合物。

黄病毒感染可以是例如寨卡病毒感染、登革热病毒感染、西尼罗河病毒感染、黄热病病毒感染、圣路易斯脑炎病毒感染、日本脑炎病毒感染、墨累谷脑炎病毒感染、蜱传脑炎病毒感染、昆津脑炎病毒感染、罗西奥脑炎病毒感染、俄罗斯春夏脑炎病毒感染、Negeishi病毒感染、Kyasanur森林病毒感染、鄂木斯克出血热病毒感染、Powassan病毒感染、LoupingIll病毒感染、Rio Bravo病毒感染、Tyuleniy病毒感染、Ntaya病毒感染或Modoc病毒感染。寨卡病毒感染可以是例如非洲寨卡病毒感染或亚洲寨卡病毒感染。 登革热病毒可以是例如DENV-1感染、DENV-2感染、DENV-3感染或DENV-4感染。

疫苗组合物可以作为药物组合物提供。该药物组合物优选包含药学上可接受的载体或稀释剂。 可以使用任何合适的方法来配制该药物组合物。使用药学上可接受的载体和/或赋形剂配制细胞，可通过药学领域中的常规方法进行。 制剂的确切性质将取决于几个因素，包括要施用的细胞和所需的施用途径。 合适类型的制剂在Remington'sPharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Company, EasternPennsylvania, USA中有完整描述。

疫苗组合物或药物组合物可以通过任何途径施用。 合适的途径包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、皮下、皮内、透皮和口服/颊途径。

组合物可以与生理上可接受的载体或稀释剂一起制备。 通常，此类组合物被制备为肽和/或肽连接的纳米颗粒的液体悬浮液。 可以将肽和/或肽连接的纳米颗粒与药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合。 合适的赋形剂例如是水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。

另外，如果需要，药物组合物可以包含少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂和/或pH缓冲剂。

以与剂型相容的方式和治疗上有效的量施用肽或肽连接的纳米颗粒。给药量取决于要治疗的对象，要治疗的疾病以及对象的免疫系统的能力。所需给药的纳米颗粒的精确量可能取决于从业者的判断，并且可能是每个受试者所特有的。

可以将任何合适数量的肽或肽连接的纳米颗粒施用于对象。 例如，患者每千克可以施用至少或大约0.2×10

应当理解，所公开的产品和方法的不同应用可以适合于本领域的特定需求。 还应理解，本文所用的术语仅出于描述本发明的特定实施方案的目的，而并非旨在进行限制。

另外，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个（a）”、“一个（an）”和“该（the）”包括复数对象，除非内容中另有明确规定。 因此，例如，提及“肽”包括“多个肽”，提及“纳米颗粒”包括两个或更多个这样的纳米颗粒等等。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。

下列实施例说明本发明。

细胞系

HepG2肝癌细胞获自ATCC，并保存在DMEM:F12（Mediatech，Manassas，VA）中。 培养基中添加了10％的胎牛血清、L-谷氨酰胺（300 mg / mL）、非必需氨基酸（1x浓度）、0.5 mM丙酮酸钠、青霉素和链霉素（1x浓度，补充剂购自Mediatech ）[完全培养基]。 将细胞在含5％CO2的潮湿培养箱中保持在37°C。

制备用于MHC肽分析的样品

HepG2细胞生长到大约1E9细胞。 然后分别用寨卡病毒或登革热病毒以在五个MOI感染这些细胞。1小时脉冲后，将病毒洗去，并将细胞在37°C下孵育72小时。 此时，收获细胞并进行处理以进行MHC肽分析。

MHC I类结合肽的分离、纯化和分级分离

通过均质并在含有1.0％NP40的缓冲液中冷冻/融化来裂解感染的细胞。 通过以2000rpm离心30分钟以除去细胞碎片来澄清裂解物。 通过使用W6 / 32抗体（识别泛I类MHC分子的单克隆抗体）包被的蛋白A / G珠（UltraLink固定蛋白A / G，Pierce, Rockford, IL）通过免疫亲和色谱法分离MHC /肽复合物。 用低pH缓冲液洗涤400μl蛋白A / G珠，然后用PBS冲洗。 然后将微珠与0.5mg抗体在室温下孵育2小时。 将标记的微珠洗涤三遍以除去未结合的抗体，并将抗体包被的微珠添加到制备的细胞裂解物中。

在室温下连续摇动孵育两小时后，通过以1000 rpm离心5分钟将微珠与裂解液分离。通过加入0.1％三氟乙酸（TFA），pH 1.5，从微珠上洗脱结合的MHC复合物。接下来，将洗脱液在85℃加热15分钟以使结合的肽与MHC分子解离。将溶液冷却至室温后，使用AmiconUltra-3 kDa分子量截留膜过滤器（Millipore）通过离心将肽与抗体分离。使用真空离心将滤液浓缩，并重构至最终体积为100μL。使用离线的终极3000 HPLC（Dionex，Sunnyvale，CA），并使用C-18反相（RP）柱（4.6mm直径×150mm长度）分离分级纯化的肽混合物。流动相A为在水中的2％乙腈（ACN）和0.1％甲酸（FA），而流动相B为在水中的0.1％FA和90％ACN。然后，以200μL/ min的流速从5％到80％的缓冲液B以80分钟的线性梯度从柱上洗脱肽。总共收集了35个馏分，并在真空下干燥至6μL，用于LC / MS / MS分析。

质谱分析

使用LTQ（Thermo）和Orbitrap仪器与纳米版HPLC（Dionex）进行质谱实验。 RP-HPLC纯化的肽级分分别注入LC-MS / MS系统中，以鉴定肽序列。作为在线样品净化步骤的一部分，首先使用300μm ID×5mm C18 RP捕集柱（Dionex，Sunnyvale CA）对肽进行浓缩，然后使用75μm ID×15 cm C18 RP分析柱（Dionex，Sunnyvale CA）进行分离，在4％ACN / 0.1％FA中以250 nL / min的流速达到平衡。流动相A为在水中的2％ACN和0.1％FA，而流动相B是在水中的0.1％FA和90％ACN。以4％至50％B的梯度洗脱60min并以50％至80％的梯度洗脱90分钟，然后直接洗脱到质谱仪中。 MS模式下的分子量范围为350 Da至1500 Da，MS/MS模式下的分子量范围为100 Da至1500 Da。使用数据依赖性（Data-Dependent）方法分析肽。使用Proteome Discoverer（Thermo）在登革热（DV 1-4血清型）蛋白质数据库搜索获得的光谱数据，以解释数据并得出肽序列。

通过合成肽进行肽验证

用于验证本研究中鉴定的肽的合成肽是从Genscript Corporation (Piscataway,NJ)获得的。 然后在上述相同的实验条件下对合成肽进行LC-MS/MS分析，并根据其MS/MS数据确定其序列。 通过比较其MS/MS谱图与其合成类似物的谱图，确定了候选肽序列。

结果

表2显示了使用上述方法鉴定出的黄病毒肽

表2.

方法

表位特异性CTL是使用来自健康（原始）人类HLA-A2 +供体的外周血单核细胞生成的。首先，从在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养的PBMC的粘附群体中产生DC。 通过此方法获得的DC（未成熟的DC）用肽（分别为P1至P5）或纳米颗粒结合的肽（分别为P1至P5）脉冲。 两组均补充有微球蛋白。 将CD8 + T细胞与DC以20:1的CD8 + T细胞:DC的比例共培养于24孔板中的完整RPMI中，其中添加了10％FBS和重组人IL-7。 经过三到四轮的再刺激后，分析培养物的CTL反应。

在以下测定中，测试了根据该方法产生的活化的T细胞对载有黄病毒肽的T2细胞和黄病毒感染的HepG2细胞为靶标的细胞毒性活性：通过ELISpt测定IFN- γ和颗粒酶B 的生成；通过MAGPIX分析测定细胞因子的分泌；通过流式细胞分析测定CD107a共表达。

体外刺激CTL反应

在细胞因子混合物中分别用肽P1至P5刺激健康（原始）人HLA-A2 +供体的外周血单核细胞（PBMC），以诱导抗原特异性CTL反应。 用合并的游离肽（FP）刺激HLA-A2 + PBMC，在不同的肽负载下总共刺激4次。

然后通过与未感染的、已感染的或载有肽的靶标共培养来分析这些被刺激的PBMC的抗原特异性反应。 TAP缺陷细胞（T2）用于加载肽，空白T2细胞用作对照。 通过流式细胞术分析活化的PBMC的干扰素γ（IFNγ）和CD107a脱颗粒标记物。

结果如图1至4所示。

用200ng NP-登革热肽免疫转基因A2小鼠。 分离脾细胞，然后将其暴露于寨卡或登革热感染的细胞。 图5显示HepG2靶细胞含有能够模拟来自转基因A2小鼠的脾细胞的I类肽靶（peptide class I targets）。 肽的酸剥离使细胞无反应。 同样，用黄病毒感染HepG2细胞会置换自身肽，并导致病毒衍生肽暴露在细胞表面（如图6所示）。图6显示未免疫小鼠的脾细胞对登革热或寨卡病毒感染的细胞无反应。 相反，用NP-登革热或NP-寨卡肽免疫的A2小鼠能够杀死登革热或寨卡病毒感染的HepG2细胞。

体外刺激CTL反应

在细胞因子混合物中分别用肽P1至P5刺激健康（原始）人HLA-A24+供体的外周血单核细胞（PBMC），以诱导抗原特异性CTL反应。 用合并的游离肽（FP）刺激HLA-A24+ PBMC，在不同的肽负载下总共刺激4次。

然后通过与未感染的、已感染的或载有肽的靶标共培养来分析这些被刺激的PBMC的抗原特异性反应。 TAP缺陷细胞（T2）用于加载肽，空白T2细胞用作对照。 通过流式细胞术分析活化的PBMC的干扰素γ（IFNγ）和CD107a脱颗粒标记物。

Dextramer研究

Dextramer试剂经过荧光标记，用于检测细胞悬浮液和实体组织样品中的抗原特异性T细胞。 MHC dextramer被添加到PBMC或脾细胞中。 然后加入最适量的与相关的荧光染料偶联的抗CD8抗体。 也可以在此步骤中添加与其他相关荧光染料偶联的其他抗体（例如抗CD3或抗CD4抗体）。 然后使用流式细胞仪分析细胞。

体内CTL研究

通过皮下和皮内施用途径，以游离的合成肽或纳米颗粒-肽偶联物，与或不与montanide-51佐剂混合，免疫HLA A2/A24转基因小鼠（每组5-6只小鼠），每2周一次，共3次。最后一次加强免疫后7天，收集脾脏和引流淋巴结进行CTL分析。 从淋巴器官制备单细胞悬液，并在培养物中用肽抗原刺激细胞7天。 使用负载黄病毒肽的T2细胞和黄病毒感染的HepG2细胞作为靶标，在以下试验中测定了重新活化的T细胞的表位特异性CTL应答：ELISpot测定IFN-γ和颗粒酶B的产生； 通过MAGPIX分析测定细胞因子的分泌；通过流式细胞术测定CD107a共表达。

过继转移实验

进行过继转移实验以研究在HLA-A2转基因小鼠体内产生的肽特异性CTL是否在SCID-Beige小鼠体内对黄病毒感染细胞具有细胞毒性作用。 将感染的肝肿瘤悬液皮下注射或静脉内注射到SCID Beige小鼠中，然后单次或多次过继转移在转基因A2小鼠中产生的针对肽-NP构建体的肽特异性CTL。使用适当的对照。监测小鼠的存活。

序列表

<110> 埃默杰克斯疫苗控股有限公司

<120> 疫苗组合物

<130> N412903WO

<150> US 62/649,804

<151> 2018-03-29

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 1

Pro Met Ala Ala Val Gly Leu Leu Ile Val Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 2

Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 3

Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 4

Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 登革热病毒

<400> 5

Trp Val Thr Asp His Ser Gly Lys Thr Val

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 6

Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 7

Asp Ile Gly Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 8

Leu Leu Gly Leu Ile Thr Ala Asn Glu Leu

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 寨卡病毒

<400> 9

Ile Met Leu Leu Gly Leu Leu Gly Thr Val

1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 登革热病毒

<400> 10

Leu Met Arg Asn Lys Gly Ile Gly Lys

1 5

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 破伤风梭菌

<400> 11

Phe Lys Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Asn Asn

1 5 10 15

Val Ala

<210> 12

<211> 19

<212> PRT

<213> 破伤风梭菌

<400> 12

Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala

1 5 10 15

Gly Gly Cys

<210> 13

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 13

Leu Ala Ala Tyr

1

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列

<400> 14

Phe Leu Ala Ala Tyr

1 5