用于癌症治疗的抗oxMIF/抗CD3抗体

技术领域

本发明涉及抗oxMIF/抗CD3抗体及其在治疗过度增殖性疾病，特别地在治疗癌症中的用途，所述抗oxMIF/抗CD3抗体包含至少一个特异性识别oxMIF的结合位点和至少一个特异性识别CD3的结合位点。

背景技术

早在1966年，已经描述了细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)(David,J.R.,1966,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.56,72–77；Bloom B.R.and Bennet,B.,1966,Science153,80–82)。但是，MIF与其他细胞因子和趋化因子明显不同，因为它是组成型地表达、存储在细胞质中，并存在于健康受试者的血液中。由于该蛋白无处不在，因此MIF可被视为治疗干预的不适当靶标。然而，MIF以两种免疫学上独特的构象亚型发生，分别称为还原MIF(redMIF)和氧化MIF(oxMIF)(Thiele M.et al.,J Immunol 2015；195:2343-2352)。人们发现RedMIF是MIF的充分表达的同种型，其可以存在于任何受试者的细胞质和血液中。RedMIF似乎代表潜在的非活性存储形式(Schinagl.A.et al.,Biochemistry.2018Mar 6；57(9):1523-1532)。

相比之下，oxMIF似乎是与生理相关且与疾病相关的同种型，其可以在结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌和肺癌患者的肿瘤组织中特异性地检测到(Schinagl.A.et al.,Oncotarget.2016Nov 8；7(45):73486-73496)。

像上述oxMIF阳性指示一样，用于治疗癌症的成功的药物靶标的数量受到限制。例如，描述了300多种潜在的免疫肿瘤靶标，但许多临床研究集中在抗PD1和抗PDL1抗体上(Tang J.,et al.Ann Oncol.2018Jan 1；29(1):84-91)。因此，科学界和医学界热切期待靶向肿瘤特异性抗原的潜在药物，以增加预后不良的癌症患者的治疗选择。

OxMIF似乎是高度肿瘤特异性的，靶向oxMIF的抗体在体外和动物研究中均显示出功效(Hussain F.et al.,Mol Cancer Ther.2013Jul；12(7):1223-34；Schinagl.A.etal.,Oncotarget.2016Nov 8；7(45):73486-73496)。在1期临床试验中，oxMIF特异性抗体示出可接受的安全性、令人满意的组织渗透性和抗肿瘤活性的迹象(Mahalingam D.et al.,2015,ASCO Abstract ID2518)。但是，抗oxMIF抗体的作用方式似乎仅基于oxMIF的生物活性的中和。抗体未表现出任何旁观者效应，例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)(Hussain F.et al.,Mol Cancer Ther.2013Jul；12(7):1223-34)。

Del Bano J等人提供关于用于癌症免疫疗法的双特异性抗体的一般综述(ANTIBODIES,vol.5,no.1,2015,page 1)。

在WO 2009/086920A1中描述了抗MIF抗体。

WO 2016/156489A1涉及抗MIF抗体的给药方案。

WO 2016/184886A1描述了抗MIF抗体用于治疗含有突变体TP53和突变体RAS的肿瘤。

KERSCHBAUMER R.J等人报道了通过完全人抗体对巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的中和作用(JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,vol.287,no.10,2012,pages 7446-7455)。

Douillard P.等人公开了对氧化的巨噬细胞迁移抑制因子(oxMIF)具有特异性的人抗体，其与癌症动物模型中的化学治疗剂协同作用”(Cancer Research,2014,2654-2654页)。

存在解决关于如何开发具有增强的特异性和有效性的免疫细胞介导的疗法的问题的迫切需要。特别地，需要克服治疗性抗体(例如抗oxMIF抗体)在肿瘤学中的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供针对oxMIF和CD3的具有改良的生物学活性的双特异性抗体形式。

该目的通过所要求保护的主题解决。

根据本发明，提供了抗oxMIF/抗CD3抗体，其包含至少一个特异性识别oxMIF的结合位点和至少一个特异性识别CD3的结合位点。

与结合oxMIF的单一抗体相比，本发明的抗oxMIF/抗CD3抗体具有有利的特性。特别地，本发明抗体的双特异性形式使肿瘤细胞和T细胞接近，以使T细胞能够杀伤肿瘤细胞，从而具有显著降低肿瘤和转移负担的潜力。

根据具体的实施方案，与抗oxMIF和抗CD3抗体的结合相比，该抗体以更高的程度诱导T细胞介导的细胞毒性。这种增加可以通过本领域已知的任何测定来确定，例如但不限于通过T细胞介导的肿瘤细胞裂解测定。抗oxMIF/抗CD3双特异性抗体的T细胞介导的细胞毒性也可以在体外在癌细胞上确定，特别地在实体瘤细胞上，特别地在结肠直肠、胰腺、卵巢、肺癌细胞上。

根据本发明，oxMIF结合位点对氧化的MIF具有特异性，并且不结合还原的MIF。

根据具体的实施方案，提供了抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别oxMIF的结合位点包含

(a)重链可变区，其包含

CDR1-H1序列，其与选自由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO19和SEQ ID NO 26组成的组中的任何序列具有至少70％，特别地至少80％，至少90％，至少95％，更特别地至少99％的序列一致性，和

CDR2-H1序列，其与选自由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO20和SEQ ID NO 27组成的组中的任何序列具有至少70％，特别地至少80％，至少90％，至少95％，更特别地至少99％的序列一致性，和

CDR3-H1序列，其与选自由SEQ ID NO3、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 15和SEQ ID NO21组成的组中的任何序列具有至少70％，特别地至少80％，至少90％，至少95％，更特别地至少99％的序列一致性，和

(b)轻链可变区，其包含

CDR1-L1序列，其与选自由SEQ ID NO4、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO22和SEQ ID NO 28组成的组中的任何序列具有至少70％，特别地至少80％，至少90％，至少95％，更特别地至少99％的序列一致性，和

CDR2-L1序列，其与选自由SEQ ID NO5、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO23和SEQ ID NO 25组成的组中的任何序列具有至少70％，特别地至少80％，至少90％，至少95％，更特别地至少99％的序列一致性，和，

CDR3-L1序列，其与选自由SEQ ID NO6、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 18和SEQ ID NO24组成的组中的任何序列具有至少70％，特别地至少80％，至少90％，至少95％，更特别地至少99％的序列一致性。

根据替代实施方案，提供了如本文所描述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其在每个CDR序列中包含0、1或2个点突变，所述CDR序列为

CDR1-H1序列，其选自由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 26组成的组，和

CDR2-H1序列，其选自由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 27组成的组，和

CDR3-H1序列，其选自由SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 15和SEQ ID NO21组成的组，和

CDR1-L1序列，其选自由SEQ ID NO4、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 28组成的组，和

CDR2-L1序列，其选自由SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO23和SEQ ID NO 25组成的组，和

CDR3-L1序列，其选自由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 18和SEQ ID NO24组成的组。

根据进一步的实施方案，提供了如本文所描述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别CD3的结合位点包含

(a)重链可变区，其包含

CDR1-H2序列，其与选自由SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 86和SEQ ID NO 92组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR2-H2，其与选自由SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 87和SEQ ID NO 93组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR3-H2，其与选自由SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 88、SEQ ID NO 94和SEQ ID NO149组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

(b)轻链，其包含

CDR1-L2，其与选自由SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 89和SEQ ID NO95组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR2-L2，其与选自由SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 90和SEQ ID NO96组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR3-L2，其与选自由SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 151组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性。

根据进一步的实施方案，提供了如本文所描述的抗oxMIF/抗CD3抗体，所述抗体在每个CDR序列中包含0、1或2个点突变，所述CDR序列是

CDR1-H2序列，其来自由SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 86和SEQ ID NO 92组成的组，和CDR2-H2序列，其来自由SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 87和SEQ ID NO 93组成的组，和CDR3-H2序列，其来自由SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 88、SEQ ID NO 94和SEQ ID NO 149组成的组，和

CDR1-L2序列，其来自由SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 89和SEQ ID NO95组成的组，和

CDR2-L2序列，其来自由SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 90和SEQ ID NO96组成的组，和

CDR3-L2序列，其来自由SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO97和SEQ ID NO 151组成的组。

根据具体的实施方案，本发明特别地考虑了包含衍生自重链可变区的序列CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H和/或从轻链可变区的序列CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L的oxMIF结合位点的任何抗体的用途，包括包含单个可变域的构建体，所述单个可变域包含CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H序列的组合，或CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L序列的组合；或此类可变结构域对，例如VH、VHH或VH/VL结构域对。

根据具体的实施方案，本发明特别地考虑了包含衍生自重链可变区的序列CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H和/或从轻链可变区的序列CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L的CD3结合位点的任何抗体的用途，包括包含单个可变域的构建体，所述单个可变域包含CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H序列的组合，或CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L序列的组合；或此类可变结构域对，例如VH、VHH或VH/VL结构域对。

特定的实施方案涉及抗体，其包含至少一个抗oxMIF的CDR序列(优选地至少两个或三个)和至少一个抗CD3的CDR序列。

进一步的具体实施方案涉及抗体，其包含至少一个抗CD3的CDR序列(优选地至少两个或三个)和至少一个抗oxMIF的CDR序列。

进一步的具体实施方案涉及抗oxMIF/抗CD3抗体，其中相应的可变重链区(VH)和相应的可变轻链区(VL)从N-末端到C-末端，以VH(oxMIF)-V

根据具体的实施方案，提供了抗oxMIF/抗CD3抗体，其包含序列SEQ ID NO 7、SEQID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 77、SEQID NO 78、SEQ ID NO 149、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84和SEQ ID NO 151。

在进一步的实施方案中，提供了如本文所描述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别oxMIF的结合位点包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 172的氨基酸序列，或与SEQ ID NO 172具有至少70％，优选地至少80％，优选地至少90％、更优选地至少95％的序列一致性的序列；该轻链可变区包含SEQ ID NO 134的氨基酸序列，或与SEQ ID NO 134具有至少70％的序列一致性的序列。

在替代的实施方案中，提供了如本文所描述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别oxMIF的结合位点包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 172的氨基酸序列，或包含0、1、2、3、4或5个点突变的SEQ ID NO 172的氨基酸序列；该轻链可变区包含SEQ ID NO 134的氨基酸序列，或包含0、1、2、3、4或5个点突变的SEQ ID NO 134的氨基酸序列。

本文还提供了抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别CD3的结合位点包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区与SEQ ID NO 135的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性，该轻链可变区与SEQ ID NO 136的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性。

在替代实施方案中，提供了如本文所描述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别CD3的结合位点包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO 135的氨基酸序列，或包含0、1、2、3、4或5个点突变的SEQ ID NO 135的氨基酸序列；该轻链可变区包含SEQ ID NO 136的氨基酸序列，或包含0、1、2、3、4或5个点突变的SEQ ID NO 136的氨基酸序列。

根据进一步的实施方案，提供了本文所描述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中所述至少一个结合位点是抗体片段，该抗体片段选自由scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab’、以及F(ab')2、不同物种的两种单链抗体的融合蛋白(BiTE)、迷你抗体、TandAb、DutaMab、DART和CrossMab组成的组。

根据进一步的实施方案，该抗体包含至少一个人源的抗体结构域，或嵌合体，或人以外的哺乳动物源的人源化抗体结构域，优选人源化、鼠源或骆驼科源。在具体的实施方案中，抗体是纳米抗体，例如衍生自骆驼科重链抗体的单结构域抗原结合片段。

根据进一步的实施方案，本文所描述的抗体包含特异性结合oxMIF的单价、二价、三价、四价或多价的结合位点和特异性结合CD3的单价、二价、三价、四价或多价的结合位点。

在进一步的实施方案中，该抗体是双特异性抗体，特别地选自由双特异性IgG、附有CD3结合位点的IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白、BsAb缀合物组成的组。

根据进一步的实施方案，本文还提供了包含抗oxMIF/抗CD3抗体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

特别地，提供了本文所描述的抗体或药物组合物用于治疗过度增殖性疾病，特别地涉及任何组织或器官的癌症，特别地用于治疗头部、颈部、乳房、肝脏、皮肤、胃、膀胱、肾、食道、妇科、支气管、鼻咽、甲状腺、前列腺、结直肠、卵巢、胰腺、肺癌和纤维肉瘤。

特别地，本文所描述的抗体可以用作药物。

特别地，提供了一种用于治疗低增殖性疾病(hypoproliferative)(特别地癌症)的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所描述的药物组合物。

本文进一步提供了编码本发明的抗oxMIF/抗CD3抗体形式的分离的核酸分子。

在进一步的实施方案中，提供了包含本文所描述的核酸分子的表达载体。

进一步的实施方案涉及包含所述载体的宿主细胞。

本文进一步提供了生产本发明的抗oxMIF/抗CD3抗体的方法，其包含在宿主细胞中表达编码抗体的核酸。

根据具体的实施方案，提供了一种检测oxMIF的细胞表达的体外方法，该方法包含：使包含人细胞的待测生物样品与本发明的抗oxMIF/抗CD3抗体接触；和检测所述抗体的结合；其中所述抗体的结合表明在细胞表面上存在oxMIF，从而检测细胞是否表达oxMIF。

特别地，生物学样品包含完整的人细胞、活检(biopsies)、切除(resections)、组织样品或待测细胞的膜部分。

更特别地，采用可检测的标记物来标记抗oxMIF/抗CD3抗体，所述可检测的标记物选自由放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物和生物发光标记物组成的组。

根据另一方面，缀合至可检测的标记物的抗体可用于诊断低增殖性疾病(例如癌症)，其中受试者的细胞表达oxMIF。

附图说明

图1：使T细胞接近肿瘤细胞的oxMIF和CD3的抗oxMIF/抗CD3双特异性抗体的示意图。

图2：通过ELISA用抗oxMIF/CD3双特异性抗体检测oxMIF(vs redMIF)(C0008＝抗oxMIF单特异性对照抗体)。

图3：抗oxMIF/CD3双特异性抗体与oxMIF和CD3的结合。(C0008＝抗oxMIF单特异性对照抗体)。

图4：用抗oxMIF/CD3双特异性抗体检测CD3阳性Jurkat的t细胞上的天然CD3(C0008＝抗oxMIF单特异性对照抗体)。

图5在ELISA中，抗oxMIF/CD3双特异性实体与固定化MIF(oxMIF)的结合。

图6：抗oxMIF/CD3双特异性抗体与A2780卵巢癌细胞的细胞表面上的天然oxMIF的结合(C0008＝抗oxMIF单特异性对照抗体)。

图7：在存在或不存在A2780卵巢癌细胞的情况下，通过抗oxMIF/CD3 BiTE来激活t细胞(C0008＝抗oxMIF单特异性对照抗体)。

图8：采用抗oxMIF/CD3双特异性抗体C0006，PBMC介导的肿瘤细胞杀死A2780卵巢癌细胞(A)和A549肺癌细胞(B)。

具体实施方式

如本文所使用的术语“包含(comprise)”、“含有(contain)”，“具有(have)”和“包括(include)”可以同义地使用，并且应被理解为开放式限定，允许进一步的元件或部件或元素。“由……组成(consisting)”被认为是最接近的限定，不含有由……组成限定的特征的其他元素。因此，“包含(comprising)”限定的范围更广，含有“由……组成(consisting)”的限定。

如本文所用，术语“约”是指相同值或与给定值相差+/-5％的值。

本发明的抗体包含至少一个特异性识别oxMIF的结合位点和至少一个特异性识别CD3的结合位点。

oxMIF结合位点对MIF的氧化形式具有特异性，即对人oxMIF具有特异性但对还原的MIF不显示出实质性的交叉反应性。oxMIF是MIF的疾病相关的结构同种型，其可以在患有炎症性疾病的受试者的血液中和癌症患者的肿瘤组织中被特异性和主要地检测到。在一个实施方案中，人源化或人抗oxMIF结合位点包含本文所描述的人源化或人抗oxMIF结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区，和/或本文所描述的人源化或人抗oxMIF结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区，例如，人源化或人抗oxMIF结合结构域，其包含一个或多个(例如，所有三个)LC CDR和一个或多个(例如，所有三个)HC CDR。

本发明的抗体进一步包含至少一个特异性识别CD3的表位(特别地人CD3的表位)的结合位点，包括CD3γ(伽马)链、CD3δ(德尔塔)链和两条CD3ε(艾普西隆)链，其存在于细胞表面。CD3在T细胞上的聚集(例如通过固定化的抗CD3抗体)可导致T细胞活化，这类似于T细胞受体的参与但不依赖于其克隆典型的特异性。在某些实施方案中，本文描述的抗体的CD3结合结构域不仅表现出与人CD3的有效CD3结合亲和力而且还显示出与各自的食蟹猴(cynomolgus monkey)CD3蛋白的优异的交叉反应性。在一些情况下，抗体的CD3结合结构域与来自食蟹猴的CD3交叉反应。在一个实施方案中，抗CD3结合位点包含本文所描述的抗CD3结合结构域的一个或多个(例如，所有三个)轻链互补决定区，和/或本文所描述的抗CD3结合结构域的一个或多个(例如，所有三个)重链互补决定区，例如包含一个或多个(例如，所有三个)LC CDR和一个或多个(例如，所有三个)HC CDR的抗CD3结合结构域。

本文中术语“抗体”以最广义使用，并涵盖由抗体结构域组成的多肽或蛋白质或包含抗体结构域的多肽或蛋白质，其被理解为免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域，带有或不带有连接基序列。该术语涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性，即与oxMIF和CD3表位结合。

抗体结构域可以是天然结构或通过诱变或衍生化修饰，例如，修饰抗原结合特性或任何其他特性(例如稳定性或功能特性，例如与Fc受体结合，例如FcRn和/或Fc-γ受体)。如果多肽序列包含由通过环序列连接的抗体结构域结构的至少两个β链组成的β-桶状结构，则认为多肽序列是抗体结构域。

应当理解，术语“抗体”包括其衍生物。衍生物是本发明的一种或多种抗体结构域或抗体和/或融合蛋白的任何组合，其中本发明的抗体的任何结构域可以融合在一种或多种其他蛋白的任何位置，例如其他抗体或抗体形式，例如包含CDR环的结合结构、受体多肽，还包括配体、支架蛋白、酶、标记、毒素等。

术语“抗体”应特别地指表现出双特异性结合特性，即与靶抗原oxMIF和CD3结合的多肽或蛋白质。

“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该完整抗体的一部分与完整抗体所结合的抗原结合。抗体片段的实施例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、Fab-scFv融合体、Fab-(scFv)2-融合体、Fab-scFv-Fc、F(ab')2、ScFvFc、双抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。另外，抗体片段包含单链多肽，所述单链多肽具有VH结构域的特征(即能够与VL结构域一起组装)或具有VL结构域的特征(即能够与VH结构域一起组装到功能性抗原结合位点)，从而提供全长抗体的抗原结合特性。本文所指的抗体片段还涵盖包含一个或多个结构环区域的Fc结构域，该结构环区域含有抗原结合区，例如Fcab

如本文所用，“Fab片段”是指包含轻链片段和重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，所述轻链片段包含轻链(CL)的VL结构域和恒定结构域。本发明的双特异性抗体可包含至少一个Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。由于可变区或恒定区的交换，所述Fab片段也称为“跨交-Fab(cross-Fab)片段”或“交叉(crossover)Fab片段”。交叉Fab分子的两种不同链组成是可能的并且包含在本发明的抗体中：Fab重链和轻链的可变区可以交换，即交叉Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该交叉Fab分子也称为跨交Fab(CrossFab)(VLVH)。当Fab重链和轻链的恒定区交换时，交叉Fab分子可包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。此交叉Fab分子也称为跨交Fab(CrossFab)(CLCH1)。

“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)以及连接基组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述连接基在N-末端至C-末端方向上具有以下顺序：VH-CH1-连接基-VL-CL、VL-CL-连接基-VH-CH1、VH-CL-连接基-VL-CH1或VL-CH1-连接基-VH-CL；其中所述连接基是具有至少20个氨基酸，至少30个氨基酸，特别地32至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段VH-CH1-连接基-VL-CL、VL-CL-连接基-VH-CH1、VH-CL-连接基-VL-CH1和VL-CH1-连接基-VH-CL可以通过CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定。此外，通过插入半胱氨酸残基产生链间二硫键，可以进一步稳定这些单链Fab分子。

术语“N-末端”表示N-末端的最后一个氨基酸。

术语“C-末端”表示C-末端的最后一个氨基酸。

“双特异性T细胞衔接子”的“BiTE”是指人工单克隆抗体，它是一种融合蛋白，其由约50千道尔顿的单条肽链上的不同抗体的两个单链可变片段(scFv)，或来自四个不同基因的氨基酸序列组成。其中一个scFv通过CD3受体与T细胞结合，其他的通过oxMIF与肿瘤细胞结合。具体地，BiTE约为50kDa。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 BiTE包含以下序列，或与以下序列具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％的序列一致性的序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKHHHHHH

(SEQ ID NO 137)。

术语“迷你抗体”是指由一对通过CH3结构域(单链Fv-CH3)连接的单链Fv片段和具有独特特异性的Fv组成的抗体，其通过异源二聚化过程与前一部分配对(Hu S.Z.et al.,1996,Cancer Research,56,3055-3061)。为了提高异源二聚化效率，可以将单残基突变引入每个CH3结构域中，以实现“旋钮和孔”方法。不仅如此，还可以将额外的半胱氨酸残基引入CH3结构域，以稳定双特异性迷你抗体的结构。迷你抗体的一种形式，Tribi迷你抗体包含一条链，该链经设计可通过其两个Fv片段识别抗原，而另一条具有Fv片段的链负责募集效应细胞，例如T细胞毒性细胞或NK细胞。通过添加该额外的结合结构域，Tribi迷你抗体的亲合力(avidity)高于双特异性迷你抗体的亲合力。具体地，该迷你抗体约为75kDa。

术语“纳米抗体”是指单结构域抗体(sdAb)片段，即由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。纳米抗体的分子量约为12-15kDa。

术语“DART”是指双亲和力重靶向抗体，其是双特异性抗体(BsAb)的最简单形式。DART分子由两个工程改造的Fv片段组成，这些片段各自具有彼此交换的VH。Fv1由抗体A的VH和抗体B的VL组成，而Fv2由Ab-B的VH和Ab-A的VL组成。Fv结构域的这种相互交换，通过短连接肽从构象约束中释放变体片段。

术语“DutaMab”是指DutaMab(一种BsAb格式)，它通过在单一免疫球蛋白链中连接两个独立的互补位而形成。

术语“TandAb”或“串联抗体”是指具有来自两个不同Fv的串联的两对VL/VH的抗体，这也意味着串联抗体不携带Fc结构域。TandAb小于完整IgG或IgG衍生的双特异性Ab，但大于单结构域双特异性Ab。中等的尺寸还使得TandAb具有更高的组织穿透能力和更长的血清半衰期。此外，四价性质，这意味着每种抗原的二价体可以提高其结合效率，从而改善治疗效果。特别地，TandAb约为100kDa。

在具体的实施方案中，本发明的抗oxMIF/抗CD3TandAb包含以下序列，或与以下序列具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列：

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGSGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKGGSGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSHHHHHH(SEQ ID NO 138)。

术语“双体抗体(diabody)”是指单链Fv(scFv)片段的非共价二聚体，其由通过小肽连接基连接的重链可变区(V

术语“crossMab”(其中mab指单克隆抗体)是衍生自独立亲本抗体的双特异性抗体(Ab)的形式。通过应用旋钮入孔(knobs-into-holes)(KIH)方法，可以避免重链错配。可以避免轻链错配，因为双特异性抗体是通过抗体结构域交换产生的，而一个Fab臂的可变结构域或恒定结构域(CL和CH1)在轻链和重链之间交换。这种“交叉”保留了抗原结合亲和力，还保留了两个不同的臂，以避免轻链错配。CrossMab的实施例可以是但不限于Fab、VH-VL和在不同区域交换的CH1-CL。在CrossMAb Fab中，完整的VH-CH1和VL-CL区被交换。在CrossMAbVH-VL格式中，仅VH和VL区域被交换；在CrossMAb CH1-CL1格式中，双特异性抗体的CH1和CL区被交换。特别地，CrossMab约为150kDa。

术语“IgG-scFv”是指一种双特异性抗体，其通过分别将两个scFv融合到单特异性IgG上而被工程化为双特异性。每个scFv的特异性可以相同或不同。此外，每个轻链或重链的氨基或C末端都可以附加上成对的抗体可变结构域，从而导致产生多种类型的IgG-scFvBsAb：IgG(H)-scFv或scFv-(H)IgG：IgG(H)-scFv，具有相同特异性的与全长IgG HC的C末端连接两个scFv；scFv-(H)IgG，其与IgG(H)-scFv同样相同，除了scFvs连接到HC的N末端。IgG(L)-scFv或scFv-(L)IgG：连接到IgG轻链的C或N末端的两个相同的scFv，其分别形成IgG(L)-scFv或scFv-(L)IgG。2scFv-IgG或IgG-2scFv：通过将具有不同特异性两对scFv融合到N末端(2scFv-IgG)或C末端(IgG-2scFv)而产生。特别地，IgG(H)-scFv约为200kDa。

在具体的实施方案中，本发明的抗oxMIF IgG x抗CD3scFv融合蛋白包含以下序列，或与SEQ ID NO 139和/或SEQ ID NO 140具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGSGGSGGSGGSGGSDIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO 139，抗oxMIF重链-抗CD3 scFv融合体)。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO 140，抗-oxMIF轻链)。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 Fab-scFv包含以下序列，或与以下序列具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO 173)。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 Fab-scFv包含序列或与SEQ ID NO 154具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 Fab-(scFv)2包含以下序列，或与以下序列具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO 174)。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 Fab-(scFv)2包含以下序列，或与以下序列具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO 175)。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 Fab-scFv-Fc包含SEQ ID NO 157、SEQ IDNO 158和或SEQ ID NO 159序列，或与SEQ ID NO 157、SEQ ID NO 158和或SEQ ID NO 159具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 IgG(lc)-scFv包含SEQ ID NO 160和/或SEQ ID NO 161序列，或与SEQ ID NO 160和/或SEQ ID NO 161具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 Crossmab包含SEQ ID NO 162、SEQ ID NO163、SEQ ID NO 164和/或SEQ ID NO 165序列，或与SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQID NO 164和/或SEQ ID NO 165具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 v IgG1-scFv包含SEQ ID NO 166和/或SEQID NO 167序列，或与SEQ ID NO 166和/或SEQ ID NO 167具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3BiTE包含以下序列或与以下序列具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或99％序列一致性的序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO 176)。

在具体的实施方案中，抗oxMIF/抗CD3 VL1-VH2-VL2-VH1，TandAb包含以下序列，或与以下序列具有至少70％，特别地75％、80％、85％、90％、95/或与99％的序列一致性的序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKGGSGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO 177)。

根据具体的实施方案，本文所描述的抗体可以包含一个或多个用于纯化和/或检测的标签，例如但不限于亲和性标签、溶解性增强标签和监测标签。

特别地，亲和标签选自由多组氨酸标签、聚精氨酸标签、抗体的肽底物、几丁质结合结构域、RNAse S肽、蛋白A、β-半乳糖苷酶、FLAG标签、链球菌II标签、链霉亲和素结合肽(SBP)标签、钙调蛋白结合肽(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、S标签、HA标签和c-Myc标签组成的组，特别地该标签是包含一个或多个H的His标签，更特别地，它是六聚组氨酸标签。

“融合的”或“连接的”是指组分(例如Fab分子和Fc结构域亚基)通过肽键，直接地或通过一个或多个肽连接基连接。

如本文所用，术语“连接基”是指肽连接基并且优选地是具有氨基酸序列的肽，该氨基酸序列具有至少5个氨基酸的长度，优选地具有5至100个氨基酸的长度，更优选地具有10至50个氨基酸的长度。

术语“免疫球蛋白”是指具有天然抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成。从N-末端到C-末端，每条重链都有可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，紧跟着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N-末端到C-末端，每个轻链都有可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，紧跟着是恒定轻(CL)结构域，也称为轻链恒定区。IgG类免疫球蛋白基本上由两个Fab分子和通过免疫球蛋白铰链区连接的Fc结构域组成。免疫球蛋白的重链可以分配为五种类型之一，称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG

术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种，通常是通过重组DNA技术来制备。嵌合抗体可包含兔或鼠可变区和人恒定区。根据本发明，其他形式的“嵌合抗体”是指恒定区已被修饰或从原始抗体的恒定区改变而产生特性的那些抗体。这样的嵌合抗体也称为“类别转换(class-switched)抗体”。嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述免疫球蛋白基因包含编码免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段。产生嵌合抗体的方法涉及常规的重组DNA，并且基因转染技术是本领域众所周知的(Morrison,S.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.81(1984)6851-6855)。

“人抗体”是具有氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体或衍生自利用人抗体库的非人源的抗体或其他编码序列的人抗体的的氨基酸序列。人抗体的定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。如对于嵌合抗体和人源化抗体所提到的，本文所用的术语“人抗体”还包括此类抗体，其在恒定区被修饰，例如通过“类别切换”，即Fc部分的变化或突变(例如，从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。

如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如从宿主细胞(例如HEK细胞、NS0或CHO细胞)或从人类免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体，或使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。已经对根据本发明的重组人抗体进行了体内体细胞超突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，该序列虽然衍生自人种系VH和VL，并与之相关，但其可能天然不存在体内人抗体种系中。

“人共有框架(human consensus framework)”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选择中最常见的氨基酸残基的框架。通常地，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自可变结构域序列的亚组。通常地，序列的亚组是如Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中所述的亚组。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自已经历人源化的人框架区(FR)的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将基本上包含至少一个，且通常地是两个可变域的全部，其中所有或基本上所有的HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有FR都对应于人抗体的那些。人源化抗体可选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。本发明涵盖的其他形式的人源化抗体是这些人源化抗体，其中与原始抗体的恒定区相比，其恒定区被另外修饰或改变以产生新特性，例如关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。

根据本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同结合特异性的抗体。本发明的抗体对oxMIF和CD3具有特异性。本文所用的术语双特异性抗体表示具有至少两个结合位点的抗体或其衍生物或片段，每个结合位点结合至oxMIF和CD3的不同表位。可以将双特异性抗体制备为如本文所描述的全长抗体或抗体片段。双特异性抗体形式的实例可以是但不限于双特异性IgG(BsIgG)、附加了其他抗原结合部分的IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白、BsAb缀合物、杂合bsIgG、仅可变结构域双特异性抗体分子、CH1/CL融合蛋白、Fab融合蛋白、修饰的Fc和CH3融合蛋白、附加的IgG-HC融合体、附加的IgG-LC融合体、附加的IgG-HC&LC融合体、Fc融合体、CH3融合体、IgE/IgM CH2融合体、F(ab′)2融合体、CH1/CL、修饰的IgG、非免疫球蛋白融合蛋白、Fc修饰的IgG、双抗体等，如Spiess C.et al.,2015,Mol.Immunol.,67,95-106and Brinkmann U.and Kontermann R.E.,2017,MABS,9,2,182-212)中所述。

本文所用的“抗原”可与术语“靶标”或“靶标抗原”互换，指的是被抗体结合位点识别的整个靶分子或所述靶分子的片段。特别地，抗原的亚结构，例如多肽或糖类结构，通常称为“表位”，例如与免疫相关的B细胞表位或T细胞表位，可以被这种结合位点识别。

如本文所用的术语“表位”应特别地指可以完全构成本发明抗体形式的结合位点的特异性结合伴侣或特异性结合伴侣的一部分的分子结构。表位可以由糖类、肽结构、脂肪酸、有机物质、生化物质或无机物质或其衍生物及其任何组合组成。如果表位包含在肽结构中，例如肽、多肽或蛋白质中，则其通常将包含至少3个氨基酸，优选地5至40个氨基酸，更优选地约10-20个氨基酸。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽或糖链的基本序列的单个片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由通过折叠多肽形成三级结构而聚集在一起的氨基酸或糖类组成，并且在线性序列中，氨基酸不必彼此相邻。这样的oxMIF表位可以是位于oxMIF的中央区域内的序列EPCALCS(SEQ ID NO 145)。但是，该表位也可能在oxMIF的C-末端。

术语“抗原结合结构域”或“结合结构域”或“结合位点”是指抗原结合部分的一部分，其包含与抗原的部分或全部特异性结合并互补的区域。当抗原较大时，抗原结合分子只能与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由，例如，一个或多个抗体可变结构域(也称为抗体可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

本文关于本发明的抗体所使用的术语“结合位点”是指能够与抗原结合相互作用的分子结构。通常地，结合位点位于抗体的互补决定区(CDR)内，在本文中也称为“CDR结合位点”，其是具有赋予各种抗原结合功能的不同结构的特定区域。不同的结构可以源自抗体的天然库，例如鼠或人类库，或者可以重组或合成产生，例如通过诱变，特别地通过随机化技术。这些包括诱变的CDR区，可变抗体结构域的环区，特别地抗体的CDR环，例如任何VL和/或VH抗体结构域的CDR1、CDR2和CDR3环。根据本发明使用的抗体形式通常包含一个或多个CDR结合位点，每个对抗原都是特异性的。

如本文所用，术语“特异性的”或“双特异性的”应指结合反应，其决定异质分子群体中的目的同源配体。在此，结合反应至少是与CD3抗原和oxMIF抗原的结合。因此，在指定条件下，例如在免疫测定条件下，特异性结合其特定靶标的抗体不会大量结合样品中存在的其他分子，特别地，它对还原MIF不会显示出可检测的结合。

特定的结合位点通常不会与其他靶标发生交叉反应。仍然，特异性结合位点可特异性结合靶标的一个或多个表位、同种型或变体，或与其他相关的靶标抗原(例如同源物或类似物)交叉反应。

特异性结合是指结合在所选择的靶标一致性，高、中或低结合亲和力或亲合力方面具有选择性。与不是靶抗原的抗原的结合常数或结合动力学相比，如果与靶抗原(例如oxMIF和CD3)的结合常数或结合动力学相差至少10倍，优选地相差至少100倍，更优选地至少1000倍，则通常会实现选择性结合。

本发明的双特异性抗体特异性地包含具有特异性结合特性的两个位点，其中两个不同的靶抗原CD3和oxMIF被抗体识别。因此，示例性的双特异性抗体形式可以包含两个结合位点，其中每个结合位点都能够特异性结合不同的抗原，CD3和oxMIF。

本申请中使用的术语“价(valent)”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。这样，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。

根据本发明的双特异性抗体至少是“二价”，并且可以是“三价”或“多价”(例如“四价”或“六价”)。

如本文所用，关于抗体的结合位点的术语“单价”应指仅包含一个针对靶抗原的结合位点的分子。因此，术语“效价”应理解为针对相同靶抗原的特异性结合抗原的相同或不同表位的结合位点的数目。

应理解，本发明的抗体包含特异性结合oxMIF的单价、二价、四价或多价的结合位点和另一种特异性结合CD3的单价、二价、四价或多价的结合位点。

根据进一步的实施方案，抗体可以包含一个或多个另外的结合位点，其特异性识别在效应T细胞上表达的一种或多种抗原，特别地是ADAM17、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11a、CD11b、CD14、CD16、CD16b、CD25、CD28、CD30、CD32a、CD40、CD 40L、CD44、CD45、CD56、CD57、CD64、CD69、CD74、CD89、CD90、CD137、CD177、CEAECAM6、CEACAM8、HLA-Dra cahin、KIR、LSECtin或SLC44A2中的一种或多种。

根据具体的实施方案，本发明的抗体包含奥特利昔珠单抗(otelixizumab)、特替利珠单抗(teplizumab)、维西珠单抗(Visilizumab)或法瑞路单抗(foralumab)的一个或多个CD3可变结合结构域。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的序列中高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区域。通常地，天然的四链抗体包含六个HVR；三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别(Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD)，高变区(HVR)也称为互补决定区(CDR)，这些术语在本文中可互换使用，指的是形成抗原结合区的可变区的某些部分。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基包含特定的CDR。

Kabat定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将该“Kabat编号”系统分配给任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指Kabat et al.,1983,U.S.Dept.of Healthand Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"中提出的编号系统。除非另有说明，否则提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统进行的。在特定的实施例中，恒定区的编号是根据EU编号索引进行的。

CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是与抗原接触的残基。SDR包含在称为缩写CDR或CDR的CDR区域内。除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人(同上)编号。

根据具体的实施方案，抗CD3结合位点包含互补决定区(CDR)，其选自由莫罗单抗(muromonab)-CD3(OKT3)、奥特利昔珠单抗(otelixizumab)(TRX4)、特替利珠单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1和WT-31及其任何人源化衍生物组成的组。

本发明的抗体特异性地包含一种或多种如下所描述的序列：

表1，抗oxMIF重链序列。

表2，抗oxMIF轻链序列

表3，抗CD3重链序列

表4，抗CD3轻链序列

抗oxMIF抗体的可变重链序列可以如下：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO 172)。

抗oxMIF抗体的可变轻链序列可以如下：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO 134)。

抗CD3抗体的可变重链序列可以如下：

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO 135)。

抗CD3抗体的可变轻链序列可以如下：

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO 136)。

特别地，CD3的ε链可包含以下序列

MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO141)。

具体地，CD3的δ链可包含以下序列

MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNK(SEQ ID NO 142)。

特别地，CD3的γ链可包含以下序列

MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO 143)。

根据具体的实施方案，由oxMIF结合位点特异性识别的oxMIF的结构域包含以下序列MPMFIVNTNVPRASVPDGFLSELTQQLAQATGKPPQYIAVHVVPDQLMAFGGSSEPCALCSLHSIGKIGGAQNRSYSKLLCGLLAERLRISPDRVYINYYDMNAANVGWNNSTFA(SEQ ID NO 144)。

特别地，SEQ ID No 134至SEQ ID NO 144和SEQ ID NO 172中的任何一个可包含1、2、3或4个点突变。

“点突变”尤其理解为多核苷酸的工程化，导致氨基酸序列的表达与非工程化的氨基酸序列的氨基酸序列在一个或多个单(非连续)或双氨基酸的替代或交换、删除或插入方面有所不同，用于得到不同的氨基酸。优选的点突变是指相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。在这方面，氨基酸是指由64个三联体密码子编码的20种天然存在的氨基酸。这20种氨基酸可分裂成具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：

下面显示了

丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；

天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；

半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；

谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；

甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；

异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；

亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；

蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；

苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；

脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；

丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；

苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；

色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；

酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；

缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；以及

组氨酸：(His，H)极性，带正电荷(10％)中性(90％)。

“

精氨酸：(Arg，R)极性，带正电荷；以及

赖氨酸：(Lys，K)极性，带正电荷。

“

天冬氨酸：(Asp，D)极性，带负电荷；以及

谷氨酸：(Glu，E)极性，带负电荷。

关于本文识别的多肽序列的“序列一致性的百分数(％)”定义为必要时，为了得到最大的序列一致性百分数，在比对序列和引入缺口后，候选序列中与特定多肽序列中氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分数，任何保守替换并不视为作为序列一致性的一部分。本领域技术人员可以确定衡量比对的合适参数，包括待比较的序列的全部长度实现最大比对所需的任何算法。

根据本发明，关于本文所述的各个序列，CDR或框架区序列的序列一致性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％。

“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，例如猴子)、兔子和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”核酸”是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有该核酸分子的细胞中所含有的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。

“编码抗oxMIF/抗CD3抗体的分离的核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或不同的载体中的此类核酸分子，并且此类核酸分子存在于宿主细胞中的一个或多个位置。

“基本上无交叉反应性”是指分子(例如抗体)不识别或特异性结合不同于该分子的实际靶标抗原的抗原(例如与靶标抗原密切相关的抗原)，特别地是还原MIF，特别地是当与该靶标抗原比较时。例如，抗体可以以小于约10％至小于约5％的量与不同于实际靶标抗原的抗原结合，或抗体可以以一定的量与不同于实际靶标抗原的所述抗原结合，所述量由小于不同于实际靶标抗原的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，优选地小于约2％、1％或0.5％，最优选地小于约0.2％或0.1％组成。结合可以通过本领域已知的任何方法来确定，例如但不限于ELISA或表面等离子共振。

本发明的抗体的重组生产优选地使用表达系统，例如包括包含编码抗体形式的核苷酸序列的表达构建体或载体。

术语“表达系统”是指含有所需编码序列和可操作连接的控制序列的核酸分子，从而用这些序列转化或转染的宿主能够生产编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可以包含在载体上；然而，然后相关的DNA也可以整合到宿主染色体中。或者，表达系统可用于体外转录/翻译。

本文所用的“表达载体”定义为在合适的宿主生物体中克隆的重组核苷酸序列的转录，即重组基因及其mRNA翻译所必需的DNA序列。表达载体包含表达盒，并且通常还包含宿主细胞或基因组整合位点中自主复制的起点、一个或多个选择标记(例如氨基酸合成基因或赋予抗生素(如博来霉素(zenocin)、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性的基因)、多个限制性酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些组分可操作地连接在一起。本文所用的术语“质粒”和“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。

特别地，该术语是指载体，通过该载体，可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)，例如编码本发明抗体形式的核苷酸序列，导入宿主细胞，以转化宿主并促进所导入的序列的表达(例如转录和翻译)。质粒是本发明的优选载体。

载体通常地包含外源DNA插入其中的可传送试剂(transmissible agent)的DNA。将一个DNA片段插入另一DNA片段的常用方法包括使用称为限制酶的酶，该酶在称为限制位点的特定位点(特定的核苷酸组)上切割DNA。

“盒(cassette)”是指编码表达产物的DNA编码序列或DNA片段，该表达产物可以在限定的限制性位点插入载体。盒限制位点的设计可确保将盒插入正确的读取框架中。通常地，将外源DNA插入载体DNA的一个或多个限制性位点，然后由载体与可传送的载体DNA一起携带入宿主细胞中。具有插入或添加的DNA的DNA的片段或序列，例如表达载体，也可以称为“DNA构建体”。载体的常见类型是“质粒”，其通常是自包含的双链DNA分子，其可以容易地接受额外的(外源)DNA并且可以容易地引入合适的宿主细胞中。本发明的载体通常含有编码DNA和表达控制序列，例如启动子DNA，并具有一个或多个适合插入外源DNA的限制位点。编码DNA是编码特定多肽或蛋白质(例如本发明的抗体形式)的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是起始、调节或相反地介导或控制编码DNA的表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同基因或来自不同基因，并且可以来自相同或不同的生物体。本发明的重组克隆载体通常将包括一种或多种用于克隆或表达的复制系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记物(例如抗生素耐药性)和一个或多个表达盒。

用于连接DNA序列的程序，例如分别提供或编码本发明的因子和/或目标蛋白质、启动子、终止子和其他序列，并将其插入含有整合或宿主复制所必需的信息的合适载体中对于本领域技术人员来说是公知的，例如在J.Sambrook et al.,"Molecular Cloning 2nded.",Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中所描述的。

宿主细胞被特别地理解为用表达构建体(例如根据本发明的载体)转染的细胞、重组细胞或细胞系。

如本文所用，术语“宿主细胞系”是指已获得了长时间增殖能力的特定细胞类型的已建立克隆。术语宿主细胞系是指用于表达内源或重组基因以产生多肽的细胞系，例如本发明的重组抗体形式。

“生产宿主细胞”或“生产细胞”通常地被理解为在生物反应器中可随时用于培养以获得生产过程的产物(本发明的重组抗体形式)的细胞系或细胞培养物。根据本发明的宿主细胞类型可以是任何原核或真核细胞。

如本文所用，术语“重组”应意指“通过基因工程制备”或“基因工程的结果”，例如，特别地，使用掺入重组载体或重组宿主细胞中的异源序列。

可以使用任何已知的和公认的表达系统和重组细胞培养技术来产生本发明的双特异性抗体，例如，通过在细菌宿主(原核系统)，或真核系统(例如酵母、真菌、昆虫细胞或哺乳动物)中表达。可以在转基因生物体，例如山羊、植物或转基因小鼠，具有大片段人免疫球蛋白基因座并且缺乏小鼠抗体产生的工程化小鼠品系中生产本发明的抗体分子。也可以通过化学合成来生产抗体。

根据具体的实施方案，宿主细胞是细胞的生产细胞系，所述细胞选自由CHO、PerC6、CAP、HEK、HeLa、NS0、SP2/0、杂交瘤和Jurkat组成的组。更特别地，宿主细胞从HEK293细胞获得。

在无血清培养物中特异性培养或维持本发明的宿主细胞，所述无血清培养基例如包括其他成分，例如血浆蛋白、激素和生长因子，作为血清的替代物。

最优选的是当在无血清条件下建立、适应和完全培养宿主细胞，并且可选地在不含任何动物来源的蛋白质/肽的培养基中建立、适应和完全培养宿主细胞。

可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗oxMIF/抗CD3抗体。

术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式为允许其中含有的活性成分的生物活性有效，并且不包含对要施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他组分。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分以外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体的一些实例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。药学上可接受的物质的其他实例是润湿剂或少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们延长了抗体的保质期或有效性。

如本文所用，“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指试图改变待治疗的个体的自然病程的临床干预，并且可以进行用于预防或在临床病理过程中进行。理想的治疗效果包括但不限于，预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病的状态，以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。

本发明的抗oxMIF/抗CD3抗体和包含它的药物组合物可以与一种或多种其他治疗剂、诊断剂或预防剂联合施用。根据待治疗的疾病，其他治疗剂包括其他抗肿瘤剂、抗癌抗菌素、抗血管生成剂、化学治疗剂、类固醇或检查点抑制剂。

本发明的药物组合物可以是多种形式，例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射和可输注(infusible)溶液)、分散液或悬浊液、片状、丸状、粉末、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的优选组合物为可注射或可输注溶液的形式，例如类似于用于人被动免疫的那些组合物。优选的施用方式是肠胃外的(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在优选的实施方案中，通过静脉内输注或注射来施用抗体。在另一优选的实施方案中，通过肌肉内或皮下注射施用抗体。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或方式将根据所需结果而变化。

可以施用一次，但是更优选地是多次施用抗oxMIF/抗CD3抗体。例如，可以每天施用三次至每六个月或更长时间施用一次抗体。可以按照时间表进行施用，例如每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次以及每六个月一次。

如本文所用，术语“癌症”是指增殖性疾病，特别地指实体癌，例如结肠直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌(SCC)(例如头颈部、食道和口腔)、肝细胞癌、大肠腺癌、肾癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、星形细胞肿瘤、神经母细胞瘤、尤因氏肉瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和恶性精原细胞瘤，包括顽固型的任何一种上述癌症，或上述癌症中的一种或多种的组合。

可以用本文所描述的抗体进行oxMIF的细胞表达的检测，所述抗体被标记，从而可以检测oxMIF的特异性表达。可以根据本领域公知的方法进行抗体标记。这样的标记可以是但不限于放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记和生物发光标记。

本发明还包括以下项：

1.一种抗oxMIF/抗CD3抗体，其包含至少一个特异性识别oxMIF的结合位点和至少一个特异性识别CD3的结合位点。

2.项1的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别oxMIF的结合位点包含

(a)重链可变区，其包含

CDR1-H1序列，其与选自由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO19和SEQ ID NO 26组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR2-H1序列，其与选自由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO20和SEQ ID NO 27组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR3-H1序列，其与选自由SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 15和SEQ ID NO21组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性的，和

(b)轻链可变区，其包含

CDR1-L1序列，其与选自由SEQ ID NO4、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO22和SEQ ID NO 28组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR2-L1序列，其与选自由SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO23和SEQ ID NO 25组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR3-L1序列，其与选自由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 18和SEQ IDNO 24组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性。

3.项1或2所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其在每个CDR序列中包含0、1或2个点突变，所述CDR序列是

CDR1-H1序列，其选自由SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 26组成的组，和

CDR2-H1序列，其选自由SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 27组成的组，和

CDR3-H1序列，其选自由SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 15和SEQ ID NO21组成的组，和

CDR1-L1序列，其选自由SEQ ID NO4、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 28组成的组，和

CDR2-L1序列，其选自由SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO23和SEQ ID NO 25组成的组，和

CDR3-L1序列，其选自由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 18和SEQ ID NO24组成的组。

4.根据项1至3中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别CD3的结合位点包含

(a)重链可变区，其包含

CDR1-H2序列，其与选自由SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 86和SEQ ID NO 92组成的组的中任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR2-H2，其与选自由SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 87和SEQ ID NO 93组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR3-H2，其与选自由SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 88、SEQ ID NO 94和SEQ ID NO149组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

(b)轻链，其包含

CDR1-L2，其与选自由SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 89和SEQ ID NO95组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性，和

CDR2-L2，其与选自由SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 90和SEQ ID NO96组成的组中的任何序列具有至少70％序列一致性，和

CDR3-L2，其与选自由SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 97和SEQ ID NO 151组成的组中的任何序列具有至少70％的序列一致性。

5.根据项1至4中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其在每个CDR序列中包含0、1或2个点突变，所述CDR序列是

CDR1-H2序列，其来自由SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 86和SEQ ID NO 92组成的组，和

CDR2-H2序列，其来自由SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 87和SEQ ID NO 93组成的组，和

CDR3-H2序列，其来自由SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 88、SEQ ID NO 94和SEQ ID NO149组成的组，和

CDR1-L2序列，其来自由SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 89和SEQ ID NO95组成的组，和

CDR2-L2序列，其来自由SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 90和SEQ ID NO96组成的组，和

CDR3-L2序列，其来自由SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO97和SEQ ID NO 151组成的组。

6.根据项1至5中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其包含序列SEQ ID NO 7、SEQID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 77、SEQID NO 78、SEQ ID NO 149、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84和SEQ ID NO 151。

7.根据项1至6中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别oxMIF的结合位点包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区与SEQ ID NO 172的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性；该轻链可变区与SEQ ID NO 134的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性。

8.根据项1至6中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中特异性识别CD3的结合位点包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区与SEQ ID NO 135的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性；该轻链可变区与SEQ ID NO 136的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的序列一致性。

9.根据项1至8中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中所述至少一个结合位点是抗体，所述抗体选自由scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'、F(ab')2、不同物种的两种单链抗体的融合蛋白(BiTE)、迷你抗体、TandAb、DutaMab和CrossMab组成的组。

10.根据项1至9中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中所述抗体包含至少一个人源的抗体结构域，或嵌合体，或人以外的哺乳动物来源的人源化抗体结构域，优选人源化、鼠源或骆驼科源。

11.根据项1至10中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其包含特异性结合oxMIF的单价、二价或四价的结合位点和特异性结合CD3的单价、二价或四价的结合位点。

12.根据项1至11中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其中所述抗体是双特异性抗体，特别地选自由双特异性IgG、附有CD3结合位点的IgG、附有oxMIF结合位点的IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白和BsAb缀合物组成的组。

13.药物组合物，其包含项1至12所述的抗oxMIF/抗CD3抗体和药学上可接受的载体或赋形剂。

14.根据项1至12中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体或根据权利要求13所述的药物组合物，其用于治疗癌症，特别地用于治疗结肠直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌。

15.根据项1至12中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体，其用作药物。

16.一种治疗癌症的方法，其包括将治疗有效量的根据项13所述的药物组合物施用至有此需要的受试者。

17.一种分离的核酸分子，其编码根据项1至12中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体。

18.一种表达载体，其包含根据项17所述的核酸分子。

19.一种宿主细胞，其包含根据项18所述的载体。

20.生产根据项1至12中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体的方法，其包含在宿主细胞中表达编码该抗体的核酸。

21.一种检测oxMIF的细胞表达的体外方法，该方法包含：使包含人细胞的待测生物样品与根据项1至12中任一项所述的抗oxMIF/抗CD3抗体接触；和

检测所述抗体的结合；

其中所述抗体的结合表明在细胞上存在oxMIF，从而检测细胞是否表达oxMIF。

22.根据项21所述的体外方法，其中所述生物样品包含完整的人细胞、组织、活检探针或目标细胞的膜部分。

23.根据项21或22所述的体外方法，其中采用可检测的标记物来标记所述抗oxMIF/抗CD3抗体，所述可检测的标记物选自由放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、酶标记物和生物发光标记物组成的组。

24.项1至12所述的抗oxMIF/抗CD3抗体用于诊断受试者中表达oxMIF的癌症，其中所述抗体与可检测的标记物缀合。

参考以下实施例将更充分地理解前述的描述。然而，这样的实施例仅表示实现本发明的一个或多个实施例的方法的代表，并且不应被理解为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：

双特异性抗体的生化特征

按照以下描述测试抗oxMIF/抗CD3抗体，以确保质量和功能。

1)一致性：方法：通过电喷雾电离MS(ESI-MS)

2)分子完整性：方法：SEC多角度光散射(SEC MALS)

3)纯度：方法：SDS PAGE

4)结合和亲和力：方法：如下所述的ELISA、Biacore、FACS

特别地，使用标准胺偶联条件，将抗oxMIF/抗CD3抗体或非结合性对照抗体固定在Biacore CM5光学传感器芯片(GE医疗保健，皮斯卡特维，新泽西(GE Healthcare,Piscataway,NJ))上。在0.2％的Proclin300(活性成分5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮；西格玛(Sigma))存在下，将重组MIF在HBS-EP缓冲液(GE医疗保健)中稀释至50、75、100或150nM的浓度，将MIF转换为oxMIF替代品(Thiele M.et al.,2015,J Immunol 2015；195:2343-2352)。将经Proclin300处理的MIF应用于固定化的抗oxMIF/抗CD3抗体，并使用Biacore

实施例2：

在T细胞介导的肿瘤细胞裂解测定中测试了抗oxMIF/抗CD3抗体的体外活性。确定EC50值。

测定形式如下：从不同的供体中分离出原代t细胞，并与钙黄绿素负载的肿瘤细胞在特定的效应细胞：靶标细胞(E:T)比例下进行共培养。将双特异性抗oxMIF/CD3抗体和相应的对照组添加到共培养物中，并通过钙黄绿素释放来监测肿瘤细胞的裂解。

通过PET成像确定抗oxMIF/抗CD3抗体的生物分布和药代动力学(PK)。标记双特异性抗oxMIF/抗CD3抗体，并在带有皮下SKOV-3肿瘤或其他合适细胞系的SCID小鼠中测定肿瘤、血液和主要器官中的蛋白质的药代动力学。

1)异种移植NOD/SCID SKOV-3模型：使用人淋巴细胞在卵巢癌的NOD/SCID SKOV-3异种移植小鼠模型中，确定了抗oxMIF/抗CD3双特异性抗体的剂量响应曲线(Xing,J.,etal.,Translational Oncology(2017)10,780–785)。

简而言之，将新鲜培养的SKOV-3细胞(1×10

作为替代方案，通过生物发光监测抗oxMIF/抗CD3抗体的PD。简而言之，在第0天向30只5周龄的NSG小鼠(杰克逊实验室(The Jackson Laboratory))的每只腹膜内(i.p.)注射1×10

2)原发性卵巢人类异种移植模型：基本测试了抗oxMIF/抗CD3双特异性抗体，如Schleret B.et al.,Cancer Res 2005；65(7):2882-9中所述。

简而言之，在手术切除经组织学证实的卵巢癌患者的腹膜转移后，将原发性肿瘤样本本切成50至100mm

作为替代方案，将从健康供体的肝素化新鲜全血中分离出的1×10

为了消除NOD/SCID小鼠中已建立的肿瘤，用抗oxMIF/CD3抗体治疗，将5×10

实施例3：

实施例中使用的抗体形式概述。

C0036(与抗CD3 scFv(HC)融合的抗oxMIF Fab；形式：Fab-scFv)：

多肽1：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKAAAEQKLISEEDLAAHHHHHH(SEQ ID NO 153)。

多肽2

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO 154)。

C0037(与两种抗CD3 scFv融合的抗oxMIF Fab，格式：Fab–(scFv)2)：

多肽1：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKAAAEQKLISEEDLAAHHHHHH(SEQ ID NO 155)。

多肽2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKASAWSHPQFEK(SEQ ID NO156)。

C0038(与Fc融合的抗oxMIF Fab和抗CD3 scFv，Fab-scFv-Fc)：

多肽1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO 157)。

多肽2：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 158)。

多肽3：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 159)。

C0039(与轻链融合的带有抗CD3 scFv的完整的抗oxMIF IgG，IgG(lc)-scFv)：

多肽1：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO 160)。

多肽2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO 161)。

C0006(抗oxMIF/CD3 Crossmab(CH1-CL)、Crossmab)

多肽1：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO 162)。

多肽2：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 163)。

多肽3：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO 164)。

多肽4：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC(SEQ ID NO165)。

C0007(与重链融合的带有抗CD3 scFv的完整的抗oxMIF IgG，v IgG1-scFv融合体)多肽1：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO 166)。

多肽2：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO 167)。

C0032(与抗CD3-scFv融合的抗oxMIF-scFv，BiTE)

多肽1

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKAAAEQKLISEEDLSAWSHPQFEK(SEQ ID NO 168)。

C0033(抗oxMIF和抗CD3的可变结构域连续融合(VL1-VH2-VL2-VH1，TandAb)

多肽1

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLEIKGGSGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSGGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGQGLEWMGYINPSRGYTNYNQKFKDRVTLTTDKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDLSAWSHPQFEK(SEQ ID NO 169)。

C0008(完整的抗oxMIF IgG，IgG1)

多肽1

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIGSSGGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSQWLYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO 170)。

多肽2

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQRIMTYLNWYQQKPGKAPKLLIFVASHSQSGVPSRFRGSGSETDFTLTISGLQPEDSATYYCQQSFWTPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO 171)。

实施例4：oxMIF ELISA

为了确定oxMIF特异性，将双特异性抗体以2μg/ml(在PBS中)固定在微孔板中。用2％的BSA/TBST封闭后，将孔与500ng/ml的redMIF或oxMIF替代TNB-MIF(oxMIF surrogateTNB-MIF)(用DTNB处理的MIF，根据Schinagl et al.,Biochemistry,2018,57(9),pp1523–1532)一起孵育。用多克隆兔抗MIF山羊抗兔IgG-HRP缀合物检测捕获的TNB-MIF。用四甲基联苯胺将板染色，并用H

实施例5：oxMIF-CD3桥接ELISA

将重组人MIF以1μg/ml(在PBS中)固定在微孔板中(根据Thiele M.et al.,2015,JImmunol 2015；195:2343-2352将MIF转换为oxMIF)。封闭后，将双特异性抗体以4μg/ml的浓度添加到平板中。添加一系列稀释的带有FLAG标签的CD3-ε-δ-Fc融合蛋白，并使用单克隆小鼠抗FLAG标签-HRP检测结合的CD3。在450nM下测量OD。

双特异性抗体与oxMIF和CD3的同时结合如图3所示。C0008代表单特异性抗oxMIF抗体作为阴性对照。

实施例6：双特异性抗体与T细胞上的天然CD3的结合

将表达功能性CD3(CD3+)的CD3阳性Jurkat T细胞与双特异性抗体C0008(抗oxMIF单特异性对照抗体)、非特异性同种型对照抗体(同种型)以70nM的浓度或不添加抗体(仅有第二(secondary)ab)一起孵育。通过山羊抗人IgG(H+L)Alexa-Fluor 488缀合物(第二抗体)检测结合的抗体。使用7AAD标记死亡的细胞，并通过FACS分析样品。

图4示出了用抗oxMIF/CD3双特异性抗体)检测在活Jurkat T细胞上的天然CD3。

实施例7：与oxMIF的结合(ELISA)

将在PBS中稀释的重组人MIF(1μg/ml)固定在微孔板中(根据Thiele M.et al.,2015,J Immunol 2015；195:2343-2352，将MIF转换为oxMIF)。封闭后，将双特异性抗体以不同的浓度添加到平板中。使用蛋白L-HRP缀合物检测结合的双特异性抗体。加入TMB使板显色，并用H

抗oxMIF/CD3双特异性抗体与固定化的MIF(oxMIF)的结合曲线如图5所示。结合曲线的EC50值反映了粗略的KD估计值，通过4参数拟合计算得出，并在表5中示出。

表5：双特异性抗体的EC50值(ELISA)：

实施例8：双特异性抗体的亲和力(SPR)

使用Biacore

表6：双特异性抗体的亲和常数(KD)

实施例9：

双特异性抗体与卵巢癌细胞表面上的天然oxMIF的结合。

将A2780卵巢癌细胞与双特异性抗体C0008(抗oxMIF单特异性对照抗体)、非特异性同种型对照抗体(同种型)以70nM的浓度(在5％BSA/PBS中)或不添加抗体(仅有第二抗体，在5％BSA/PBS中)一起孵育。用山羊抗人IgG(H+L)AlexaFluor 488缀合物(第二抗体)检测结合的双特异性分子。用7AAD标记死亡的细胞，并通过FACS分析样品。

图6示出了抗oxMIF/CD3双特异性抗体与A2780卵巢癌细胞的细胞表面上的天然oxMIF的结合。

实施例10：通过抗oxMIF/CD3 BiTE激活T细胞

是根据产品J1621的Promega技术手册，通过使用表达由NFAT响应元素驱动的萤光素酶报告基因的基因工程化的Jurkat T细胞(效应细胞)进行T细胞活化生物测定。在存在或不存在A278卵巢癌细胞(靶标细胞)的情况下，以2.5:1的效应子:靶标(E:T)细胞比率进行测定。

图7示出了在存在A2780卵巢癌细胞的情况下，抗oxMIF/CD3双特异性实体C0032与抗oxMIF单特异性对照抗体C0008对T细胞的激活。

实施例11：

PBMC介导的肿瘤细胞杀伤

将A2780卵巢癌细胞和A549肺癌细胞接种在96孔V型底板中。从健康的人供体的血液中分离PBMC。将一系列稀释的抗oxMIF/CD3 Crossmab与PBMC一起添加至肿瘤细胞，并孵育2.5小时(效应细胞与靶标细胞的比例：10:1)。将细胞培养上清液转移至新板中，并使用Promega Cytotox-Glo

图8示出了在C0006存在下的A2780卵巢癌细胞(A)和A549肺癌细胞(B)的PBMC介导的肿瘤细胞杀伤。上清液的蛋白酶活性/裂解物活性的比例x 100＝细胞杀伤％。