一种α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒
文献发布时间:2023-06-19 09:55:50
技术领域
本发明涉及生化检测领域,特别是涉及一种α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒。
背景技术
α-葡萄糖苷酶可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4-糖苷键释放出葡萄糖,或将游离的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6-糖苷键,从而得到非发酵性的低聚糖,其在人体糖原的降解和动植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。糖原累积病(Ⅱ型)又称为庞贝氏病,是由于α-葡萄糖苷酶缺陷导致,使得糖原堆积在溶酶体和胞质中,使心肌、骨骼肌等脏器损害,是一种常染色体隐性遗传病。
目前,国内临床上诊断庞贝病暂无快速、便捷的诊断试剂产品,通常主要通过基因的突变检测、CT、X线等手段结合典型临床症状如面容改变、皮肤粗糙、关节变形、脏器受累等进行诊断。但针对缺乏典型临床症状的患者,上述手段均不能有效达到早期诊断的目的,且存在操作复杂、费用昂贵、多次反复对患者二次伤害的弊端,也不能作为一种更直接的诊断标准进行该疾病的诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒,以解决上述现有技术存在的问题,该试剂盒通过测定滤纸干血片血液样本或静脉血液样本中α-葡萄糖苷酶活性,辅助诊断庞贝病患者,具有微量、快速、便捷的特点,解决了目前暂无同类成熟检测试剂盒产品使用的问题。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒,包括反应液、沉淀剂、终止液、线性标准品、对照品,其中,所述线性标准品为4-甲基伞形酮溶液,所述反应液为4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷溶液。
进一步地,所述4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷溶液为酸性溶液,由缓冲液调节pH。
进一步地,所述4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷溶液的pH为4.0~6.0;
所述缓冲液为选自醋酸-醋酸钠缓冲液、PBS缓冲液、Goods缓冲液、tris缓冲液、柠檬酸钠-磷酸氢二钾缓冲液、mops缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液、pipes缓冲液和hepes缓冲液中的至少一种。
进一步地,所述反应液的制备方法为:4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷50mmol加入到纯化水中搅拌充分溶解,加入缓冲液调节溶液的pH为4.0~6.0,定容至1000mL。
进一步地,所述线性标准品的浓度包括40nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L和500nmol/L。
进一步地,所述沉淀剂为氢氧化钡、碳酸钠、硫酸锌、氢氧化钠、碳酸氢钠中的一种或几种的混合溶液,所述沉淀剂的离子浓度为0.2mol/L。
进一步地,所述终止液中为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钡中的一种或几种的混合溶液,所述终止液的离子浓度为0.5mol/L~1.0mol/L。
进一步地,所述对照品为健康人群的全血样本制备的干血片或纯酶样本。
进一步地,所述干血片对照品分为阴性对照品、弱阳性对照品和阳性对照品,是通过血细胞和正常人全血样本制备的干血片样本,其中血细胞比容为50~55%,各水平参考品制备方法如下:
进一步地,所述纯酶对照品为α-葡萄糖苷酶溶液,各水平参考品制备方法如下:
α-葡萄糖苷酶初始浓度为10U/ml,用0.2ug/ul的BSA溶液分2次稀释到0.0066U/ml浓度,记为质控品1;用0.2ug/ul的BSA溶液稀释质控品1到3.3×10
本发明公开了以下技术效果:
本发明检测试剂盒的检测分析原理是:
α-葡萄糖苷酶的活性采用荧光底物法进行检测。α-葡萄糖苷酶在酸性条件下能够将人工合成的底物4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl-α-D-glucoside)水解,产生荧光产物4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferone)和葡萄糖;4-甲基伞形酮在激发波长为360nm,发射波长为460nm条件下可检测到特异的荧光,根据检测的荧光值可计算出α-葡萄糖苷酶活力。
本发明基于上述原理开发出了一种可以快速、准确进行人体血样样本中α-葡萄糖苷酶的体外诊断试剂盒,通过对采集的滤纸干血片样本或静脉血样本进行检测,可实现批量化快速、便捷、准确辅助诊断庞贝病患者的目的。该试剂盒检测灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、可重现性好、操作简便、稳定性好,可用于α-葡萄糖苷酶的活性检测。
滤纸干血片的血液样本是当前临床普遍采用的一种血液样本采集的方式,具有操作简便易行,血液需求量少(约20μL/血斑),易于保存和运输的优点,尤其适用于婴幼儿人群。采用α-葡萄糖苷酶荧光底物法对滤纸干血片样本的快速检测技术,不受到干血片样本中所含血细胞的干扰。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
本发明实施例中滤纸干血片参考《新生儿疾病筛查滤纸血片采集和递送及保存专家共识》进行制备操作、运输、使用。
实施例1α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒的组成
所述检测试剂盒包含如下部分:
1)反应液:称取4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷50mmol加入到纯化水中搅拌充分溶解,用醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH=4.0~6.0,定容至1000mL。
2)沉淀剂:称取0.1mol氢氧化钡、0.1mol碳酸钠加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解。
3)终止液:称取碳酸钠0.5mol加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解,调节溶液的pH>10.0。
4)线性标准品:称取4-甲基伞形酮500nmol,加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解;以此为母液,用纯化水稀释至40nmol/L,100nmol/L,200nmol/L,400nmol/L,即可。
5)对照品:取排除乙肝、丙肝、艾滋、梅毒及肝功能正常的健康体检人群24小时内的全血样本至少3份。阴性参考品:混合后20μL/mm
实施例2α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒的组成
所述检测试剂盒包含如下部分:
1)反应液:称取4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷50mmol加入到纯化水中搅拌充分溶解,用PBS缓冲液调节pH=4.0-6.0,定容至1000mL。
2)沉淀剂:称取0.15mol氢氧化钡、0.05mol碳酸钠加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解。
3)终止液:称取氢氧化钠0.8mol加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解,调节溶液的pH>10.0。
4)线性标准品:称取4-甲基伞形酮500nmol,加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解;以此为母液,用纯化水稀释至40nmol/L,100nmol/L,200nmol/L,400nmol/L,即可。
5)对照品:取排除乙肝、丙肝、艾滋、梅毒及肝功能正常的健康体检人群24小时内的全血样本至少3份。阴性参考品:混合后20μL/mm
实施例3α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒的组成
所述检测试剂盒包含如下部分:
1)反应液:称取4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷50mmol加入到纯化水中搅拌充分溶解,用柠檬酸钠-磷酸氢二钾缓冲液调节pH=4.0-6.0,定容至1000mL。
2)沉淀剂:称取0.05mol氢氧化钡、0.15mol硫酸锌加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解。
3)终止液:称取碳酸氢钠0.5mol、氢氧化钠1mol加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解,调节溶液的pH>10.0。
4)线性标准品:称取4-甲基伞形酮500nmol,加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解;以此为母液,用纯化水稀释至40nmol/L,100nmol/L,200nmol/L,400nmol/L,即可。
5)对照品:取排除乙肝、丙肝、艾滋、梅毒及肝功能正常的健康体检人群24小时内的全血样本至少3份。阴性参考品:混合后20μL/mm
实施例4α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒的组成
所述检测试剂盒包含如下部分:
1)反应液:称取4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷50mmol加入到纯化水中搅拌充分溶解,用Goods缓冲液调节pH=4.0-6.0,定容至1000mL。
2)沉淀剂:称取0.2mol硫酸锌加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解。
3)终止液:称取碳酸氢钠1mol、碳酸钠0.5mol加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解,调节溶液的pH>10.0。
4)线性标准品:称取4-甲基伞形酮500nmol,加入到纯化水1000mL中搅拌充分溶解;以此为母液,用纯化水稀释至40nmol/L,100nmol/L,200nmol/L,400nmol/L,即可。
5)对照品:取排除乙肝、丙肝、艾滋、梅毒及肝功能正常的健康体检人群24小时内的全血样本至少3份。阴性参考品:混合后20μL/mm
实施例5α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒的使用操作及结果判断
1)试剂准备:自2-8℃取出实施例1的试剂盒各组分,室温平衡30分钟以上。
2)样本准备及加样:取待检测滤纸干血片,以专用打孔器取干血片中心血斑样本一个(直径≈3mm),加入U型深孔板内,同时设置空白对照孔、阴性对照孔、阳性对照孔各1孔,分别加入空白滤纸片、阴性对照干血片、阳性对照干血片各1片。
3)加液:加入反应液200μL/孔。
4)孵育:37℃恒温摇床,200rpm/min,避光反应24h。
5)沉淀:加入沉淀剂100μL/孔,震荡混匀后,避光静置10min。
6)终止离心:加入终止液760μL,震荡混匀后,4℃,2500rpm离心15min。
7)比色:准确取200μL待测液在酶标板上,以激发波长/发射波长=360/460nm,记录各测定孔吸光度值。
8)生物酶活计算:
①绘制标准曲线,根据标准品检测结果,绘制标准曲线y=ax,计算斜率a。
4MU标准曲线公式:y=ax
其中:
y:检测的荧光值
a:标准曲线斜率
x:4MU浓度,单位:nmol/L;
②计算样本酶活性
酶活性定义:在37℃条件下每升血液(L)中α-葡萄糖苷酶每分钟(min)将底物4-甲基伞形酮-α-D-葡萄糖苷转化为产物4-甲基伞形酮的纳摩尔数(nmoL)为一个单位(nmoL/L/min)。
酶活性计算公式:
其中:y:检测的荧光值
a:标准曲线斜率;
注:每个血斑的直径为3mm,含血体积约为5μL。
α-葡萄糖苷酶活性检测为1050μL反应体系。
反应时间为24h×60min=1440min。
实施例6α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒的使用操作及结果判断
一、样本前处理
采用诺道中科(北京)生物科技有限公司专用样本释放剂1、2、3进行样本处理,方法如下:
1.将含抗凝血的采血管颠倒混匀,避免血液分层;
2.标本离心:3mL全血,1500g离心6min;3mL以上全血,1500g离心10min;
3.弃上层液(血浆),将下层液吹吸混匀后转移到10mL离心管;
4.加入样本释放剂1至管内总体积达到10mL,颠倒混匀,10min后1500g离心6min,弃上清;
5.加入1mL样本释放剂1,吹吸混匀,重复上一步骤;
6.加入1mL样本释放剂2,吹吸混匀后转移到1.5mL离心管中;1200g,4℃离心3min,弃上清;
7.加入1mL样本释放剂3,吹吸混匀;2000g,4℃离心3min,弃上清;
8.以适量的纯化水重悬后分装待用,如不立即检测保存至-80℃冰箱。
二、标定样本蛋白浓度
以市售试剂进行样本蛋白浓度的标定,可选择考马斯亮蓝法G-250试剂,以纯化水将待测样本浓度稀释到约为0.2±0.02ug/uL备用。
记录标定蛋白浓度为C ug/uL。
三、样本酶活性检测
按照下表内容,依次加入各组分试剂并进行反应:
四、结果计算:
①绘制标准曲线,根据标准品1-6检测结果,绘制标准曲线y=ax,计算斜率a.
4MU标准曲线公式:y=ax
其中:
y:检测的荧光值
a:标准曲线斜率
x:4MU浓度,单位:nmoL/L
②计算样本酶活性
酶活性定义:在37℃条件下每克白细胞(g)中α-葡萄糖苷酶每分钟(min)将底物4-甲基伞形酮酰-α-L-艾杜糖苷转化为产物4-甲基伞形酮的纳摩尔数(nmoL)为一个单位(nmoL/g/min)。
酶活性计算公式:
其中:y:检测的荧光值
a:标准曲线斜率
C:标定蛋白浓度
注:α-葡萄糖苷酶活性检测为1000uL反应体系
反应时间为2h×60min=120min
五、质量控制
使用本公司质控品,根据各实验室的具体要求采用合适的质控间隔和限值,检测值应在设定范围内。
实施例7α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒的技术标准评价(干血片样本)
1)空白吸光度
通过至少三个批次产品的检测,确定试剂盒空白滤纸片吸光值≤100。
2)准确度
采用专用的10例阴性(酶活≈100%正常人)干血片、10例弱阳性(酶活≈15%正常人)干血片、10例强阳性(酶活≈5%正常人)干血片质控品对连续三个批次试剂盒准确度进行验证,以确定的cut off值进行阴性、阳性结果的判断。
结果显示,阴性质控品全部为阴性,符合率为100%,阳性、弱阳性质控品全部为阳性、弱阳性,符合率为100%。
3)精密度
取阴性、阳性、弱阳性质控品各一份,以连续三个批次试剂盒精密度进行验证,每天重复检测8次,连续检测5天,并以确定的cut off值进行阴性、阳性结果的判断。
结果显示,连续三个批次试剂盒阴性质控品未出现阳性结果,阳性、弱阳性质控品全部为阳性,未出现阴性结果。
4)灵敏度
以连续三个批次试剂盒检测三份弱阳性质控品均未出现阴性结果。
5)实际临床样本的检测
将本发明试剂盒对一年时间内的561例临床检测样本结果进行结果汇总,如下表所示,发现阳性结果2例,经追踪临床确诊为庞贝病患者;对临床已经确诊的2例庞贝病患者血液样本进行检测,检测结果均为阳性。对128例临床收集的体检人群血液样本进行检测,均为阴性结果。
临床样本的检测结果
实施例8α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒的技术标准评价(静脉血样本)
1.试剂空白
空白吸光值≤15。
2.线性范围
在样本酶活2.95nmoL/g/min~117.8nmoL/g/min范围内:相关系数r≥0.975,相对偏差应在±15%的范围内。
3.准确度
测定标示酶活57.0~63.0nmoL/g/min、28.0~31.0nmoL/g/min、8.40~9.28nmoL/g/min的样本,测定结果应不超过标示值的±10%。
4.重复性
用同一批号试剂测定标示酶活为29.45±1.47nmoL/g/min和8.84±0.44nmoL/g/min的样本,每个样本重复测试10次,检测CV值应≤15%。
5.批间差
取三个批号的试剂测定标示酶活为29.45±1.47nmoL/g/min和8.84±0.44nmoL/g/min的样本,每个样本重复测试3次,检测CV值应≤15%。
5)实际临床样本的检测
将本发明试剂盒对一年时间内的253例临床检测样本结果进行结果汇总,如表1所示,发现阳性结果3例,经追踪临床确诊为庞贝病患者;对临床已经确诊的2例庞贝病患者血液样本进行检测,检测结果均为阳性。对128例临床收集的体检人群血液样本进行检测,均为阴性结果。
表1临床样本的检测结果
以上结果表明,本发明所述的α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒检测α-葡萄糖苷酶活性具有较高的准确性和特异性,能够满足临床对于庞贝病辅助诊断的需求,解决当前暂无同类产品的问题,且以滤纸干血片样本为检测对象,血液样本使用量约为5μL(3mm
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
- 一种α-葡萄糖苷酶活性的检测试剂盒
- 一种端粒酶活性检测试剂盒及端粒酶活性检测方法