Ptbp1抑制剂在预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域。更具体地，本发明涉及Ptbp1抑制剂在预防和/ 或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病中的应用。

背景技术

帕金森病(PD)是一种严重的神经退行性疾病，其特征是中脑黑质多巴胺神经元的丧失。以往的研究通过同时过表达几种转录因子，已经实现了体外和动物模型中星形胶质细胞向多巴胺神经元的直接重编程。然而迄今为止，Ptbp1 介导的体内神经元重编程还尚未报道。

目前对帕金森疾病的主要治疗手段是以左旋多巴制剂为代表的药物。同时手术治疗也能在一定程度上改善症状。需要指出的是所有这些手段只能部分的缓解病情，还达不到阻止病情发展的效果。

因此，本领域迫切需要开发能够有效治疗神经退行性疾病的靶点。

发明内容

本发明的目的就是提供能够有效治疗神经退行性疾病的靶点。

本发明的另一目的在于提供一个全新治疗帕金森疾病的靶点Ptbp1，通过抑制Ptbp1的表达可以将纹状体内的星形胶质细胞直接转化为多巴胺神经元并且可以恢复帕金森疾病的表型。

本发明的另一目的在于提供一个全新治疗视力损伤病的靶点Ptbp1，通过抑制Ptbp1的表达可以将视网膜内的穆勒胶质细胞直接转化为视神经节细胞并且可以缓解永久性视力损伤的表型。

在本发明第一方面，提供了一种Ptbp1基因或RNA或其编码蛋白的抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病。

在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：

(a1)诱导星形胶质细胞向多巴胺神经元转分化；

(b1)治疗哺乳动物帕金森病的运动障碍；

(c1)诱导胶质细胞向功能性神经元转化或分化；

(d1)治疗与视神经节细胞(RGC)变性有关的神经系统疾病；

(e1)预防或治疗视网膜疾病；

(f1)预防和/或治疗神经退行性疾病；

(g1)穆勒胶质细胞向视神经节细胞转分化；

(h1)治疗哺乳动物视神经节死亡导致的视力损伤。

在另一优选例中，所述神经系统疾病选自下组：青光眼、年龄相关的RGC 丧失、视神经损伤、视网膜缺血、Leber遗传性视神经病变、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、精神分裂症、抑郁、吸毒、运动障碍(例如舞蹈病，胆脂过多症和动作障碍)、运动神经元损伤疾病(例如肌萎缩侧索硬化，脊髓损伤)、躁郁症、自闭症谱系障碍(ASD)、功能障碍、帕金森疾病、或其组合。

在另一优选例中，所述胶质细胞选自下组：星形胶质细胞、MG细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、Schwan细胞、NG2细胞、卫星细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述功能性神经元选自下组：RGC神经元、多巴胺神经元、或其组合。

在另一优选例中，所述功能性神经元来源于纹状体。

在另一优选例中，所述功能性神经元来源于成熟的视网膜。

在另一优选例中，所述视网膜疾病为神经变性引起的视网膜疾病。

在另一优选例中，所述组合物或制剂通过诱导MG细胞转分化为RGC细胞来治疗神经变性引起的视网膜疾病。

在另一优选例中，所述的MG细胞为Müller胶质细胞(穆勒胶质细胞)。

在另一优选例中，所述的MG细胞来源于视网膜。

在另一优选例中，所述的RGC细胞为视网膜神经节细胞。

在另一优选例中，所述的RGC细胞为功能性RGC。

在另一优选例中，所述的RGC细胞可以整合到视觉通路中，并改善视觉功能。

在另一优选例中，所述的RGC细胞可以实现对中央视觉区域的功能性投射，并改善视觉功能。

在另一优选例中，所述的改善视觉功能是改善患有神经变性引起的视网膜疾病的哺乳动物的视觉功能。

在另一优选例中，所述MG细胞转分化为RGC细胞的同时，还分化为无轴突细胞。

在另一优选例中，RGC(1)表达Brn3a、Rbpms、Foxp2、Brn3c和/或小清蛋白；(2)是F-RGC，3型RGC或PV-RGC；(3)被整合在所述受试者中现有的视网膜通路中(例如，能够将中心信息投影到dLGN，并且通过将视觉信息中继到V1而能够部分恢复视觉)；和/或(4)能够接收视觉信息，这些信息的特征在于能够在光刺激，突触连接(例如与大脑中现有的功能性dLGN神经元)，突触前神经递质的生物发生和/或后继作用建立动作电位的能力突触反应。

在另一优选例中，对所述成熟视网膜中的穆勒胶质细胞进行重编程，并将其转化为RGC。

在另一优选例中，多巴胺神经元(1)表达酪氨酸羟化酶(TH)，多巴胺转运蛋白(DAT)，水泡单胺转运蛋白2(VMAT2)，杂化同源盒1(Enl)，FoxA2 和/或LIM同源盒转录因子1alpha(Lmxla)；(2)表现出突触前神经递质的生物发生；(3)被整合到所述受试者的大脑中现有的神经元回路中；和/或 (4)其特征在于，其建立动作电位，突触连接，突触前神经递质的生物发生和/或突触后反应的能力。

在另一优选例中，对所述纹状体中的多个神经胶质细胞进行重编程，并且其中至少10％或至少30％的胶质细胞被转化为多巴胺神经元。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括患有神经退行性疾病的哺乳动物。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、或兔)、灵长类动物(如猴)。

在另一优选例中，所述星形胶质细胞来源于纹状体、黑质、脊髓、背侧中脑或大脑皮层，较佳地，所述的星形胶质细胞来源于纹状体。

在另一优选例中，所述星形胶质细胞包括纹状体星形胶质细胞。

在另一优选例中，所述星形胶质细胞为脑组织的星形胶质细胞。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、microRNA、 siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、核酸适配体、基因编辑器、或其组合。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括任选的gRNA和基因编辑蛋白。

在另一优选例中，所述基因编辑器由神经胶质细胞特异性启动子(例如 GFAP启动子)驱动表达。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括2个或多个gNRA和基因编辑蛋白。

在另一优选例中，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合Ptbp1基因的 RNA。

在另一优选例中，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合Ptbp1基因的 mRNA。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：Cas13d、CasRx、Cas13e、 CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13f、RNA靶向基因编辑蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述的基因编辑蛋白为CasRx，且gRNA的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO.:1、2、3、4、5和6。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的来源选自下组：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)、黄化瘤胃球菌(Ruminococcus Flavefaciens)、或其组合。

在另一优选例中，所述Ptbp1来源于哺乳动物；优选地，来源于人、小鼠、大鼠、或兔；更优选地，来源于人。

在另一优选例中，所述Ptbp1基因包括野生型Ptbp1基因和突变型Ptbp1 基因。

在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。

在另一优选例中，所述的突变型Ptbp1基因编码的多肽与野生Ptbp1基因所编码的多肽相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变型Ptbp1基因包括与野生Ptbp1基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的突变型Ptbp1基因包括在野生型Ptbp1基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的Ptbp1基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在另一优选例中，所述Ptbp1蛋白包括Ptbp1的活性片段或其衍生物。

在另一优选例中，所述活性片段或其衍生物与Ptbp1的同源性至少为90％，优选为95％，更优选为98％、99％。

在另一优选例中，所述活性片段或其衍生物至少具有80％、85％、90％、95％、100％的Ptbp1活性。

在另一优选例中，所述Ptbp1蛋白的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:11所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:11所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述蛋白功能的、由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:11所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％或99％)，具有所述蛋白功能的多肽。

在另一优选例中，所述Ptbp1基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:11所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:12所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:12所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:12所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述ptbp1蛋白如SEQ ID NO.:11所示。

在另一优选例中，所述ptbp1蛋白的编码核酸如SEQ ID NO.:12所示。

在另一优选例中，所述ptbp1基因或其编码蛋白的抑制剂(如基因编辑蛋白) 靶向的区域为ptbp1基因序列的第4758－4787位、和/或5381-5410位。

在另一优选例中，所述ptbp1基因或其编码蛋白的抑制剂抑制ptbp1的活性和/ 或表达量。

在另一优选例中，所述ptbp1基因或其编码蛋白的抑制剂的浓度(病毒的滴度) ＞1×10

在另一优选例中，所述ptbp1基因或其编码蛋白的抑制剂对ptbp1的活性和/或表达量的抑制率大于90％，较佳地，90％-95％。

在另一优选例中，所述抑制剂靶向脑组织的星形胶质细胞。

在另一优选例中，所述抑制剂靶向视网膜的MG细胞。

在另一优选例中，所述神经退行性疾病包括帕金森疾病。

本发明第二方面提供了一种组合物，包括：

(a)基因编辑蛋白或其表达载体，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、 CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA靶向基因编辑蛋白、或其组合；和

(b)gRNA或其表达载体，所述gRNA引导所述基因编辑蛋白特异性结合 Ptbp1基因的DNA或RNA。

在另一优选例中，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合Ptbp1基因的 mRNA。

在另一优选例中，所述gRNA的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO.:1、2、 3、4、5和6。

在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述组合物还包括：

(c)其他预防和/或治疗神经退行性疾病的药物。

在另一优选例中，所述组合物还包括：

(d)其他用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物。

在另一优选例中，所述组合物还包括：

(e)其他预防和/或治疗视网膜疾病的药物。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体包括靶向胶质细胞的载体。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体包括靶向脑组织星形胶质细胞的载体。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体包括靶向视网膜MG细胞的载体。

在另一优选例中，所述表达载体包括病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、SV40、痘病毒、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、或其组合，较佳地，所述载体为腺相关病毒(AAV)。

在另一优选例中，所述载体包括AAV2或AAV9。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的编码基因与gRNA位于同一表达载体(如AAV载体)。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体与gRNA的表达载体为同一表达载体(如AAV载体)。

在另一优选例中，所述表达载体还包括神经胶质细胞特异性启动子(例如 GFAP启动子)，用于驱动所述基因编辑蛋白的表达。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为液体制剂。

在另一优选例中，所述组合物的剂型为注射剂型。

在另一优选例中，其他预防和/或治疗神经退行性疾病的药物选自下组：多巴胺前体药物、非麦角类多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物为细胞制剂。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白的表达载体和gRNA的表达载体为同一载体或不同载体。

在另一优选例中，所述组分(a)与组分(b)的重量比为100:1－0.01:1，较佳地，10:1－0.1:1，更佳地，2:1－0.5:1。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)的含量为0.001％-99％，较佳地，0.1％-90％，更佳地，1％-70％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(b)的含量为0.001％-99％，较佳地，0.1％-90％，更佳地，1％-70％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(c)的含量为1％－99％，较佳地，10％－90％，更佳地，30％－70％。

在另一优选例中，所述组合物中，所述组分(a)和组分(b)和任选的组分(c) 占所述组合物总重的0.01-99.99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

本发明第三方面提供了一种药盒，包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的基因编辑蛋白或其表达载体，或含有基因编辑蛋白或其表达载体的药物，所述基因编辑蛋白选自下组： Cas13d、CasRx、Cas13e、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、 Cas13c、Cas13f、RNA靶向基因编辑蛋白、或其组合；

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的gRNA或其表达载体，或含有 gRNA或其表达载体的药物，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合Ptbp1基因的DNA或RNA。

在另一优选例中，所述gRNA引导基因编辑蛋白特异性结合Ptbp1基因的 mRNA。

在另一优选例中，所述gRNA的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO.:1、2、 3、4、5和6。

在另一优选例中，所述gRNA靶向的区域为Ptbp1基因序列的第4758－4787 位、和/或5381-5410位。

在另一优选例中，所述药盒还包括：

(c1)第三容器，以及位于所述第三容器中的其他预防和/或治疗神经退行性疾病的药物，和/或含有其他预防和/或治疗视网膜疾病的药物，和/或含有其他治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器、第三容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含基因编辑蛋白或其表达载体的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含gRNA或其表达载体的单方制剂。

在另一优选例中，所述的第三容器的药物是含其他预用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物的单方制剂。

在另一优选例中，所述药物的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。

本发明第四方面提供了一种本发明第二方面所述的组合物或本发明第三方面所述药盒的用途，用于制备用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物。

在另一优选例中，所述组合物中，基因编辑蛋白或其表达载体的作用浓度 (病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述组合物中，所述gRNA或其表达载体的作用浓度(病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述其他用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物的作用浓度(病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述药物组合物中，所述其他用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物的作用浓度(病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述组合物或药盒包括(a)基因编辑蛋白或其表达载体；和(b)gRNA或其表达载体；和(c)任选的其他用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物；和(d)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述组合物或药盒中，(a)基因编辑蛋白或其表达载体；和(b)gRNA或其表达载体；和(c)任选的其他用于治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的药物占所述组合物或药盒总重的0.01-99.99wt％,较佳地 0.1-90wt％，更佳地1-80wt％。

本发明第五方面提供了一种促进胶质细胞分化为功能性神经元的方法，包括步骤：

在Ptbp1基因或RNA或其编码蛋白的抑制剂或本发明第二方面所述的组合物存在下，培养胶质细胞，从而促进胶质细胞分化为功能性神经元。

在另一优选例中，所述胶质细胞选自下组：星形胶质细胞、MG细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、Schwan细胞、NG2细胞、卫星细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述功能性神经元选自下组：RGC神经元、多巴胺神经元、或其组合。

在另一优选例中，所述胶质细胞为体外的细胞。

在另一优选例中，所述Ptbp1基因或其编码蛋白抑制剂的作用浓度(病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述权利要求2所述组合物的作用浓度(病毒滴度)＞ 1×10

本发明第六方面提供了一种预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的方法，包括：

给需要的对象施用Ptbp1基因或RNA或其编码蛋白的抑制剂、或本发明第二方面所述的组合物、或本发明第三方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述对象包括患有功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。

本发明第七方面提供了一种筛选预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的候选化合物的方法，所述方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中Ptbp1的表达量(E1)和/或活性(A1)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中Ptbp1的表达量(E0) 和/或活性(A0)；

其中，如果测试组中细胞的Ptbp1的表达量(E1)和/或活性(A1)显著低于对照组，就表明该测试化合物是对Ptbp1的表达和/或活性有抑制作用的预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的候选化合物。

在另一优选例中，所述的Ptbp1的表达量是通过qPCR而得出的。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对胶质细胞向功能性神经元分化的促进作用；和/或进一步测试其对Ptbp1基因是否有下调的作用。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物模型，测定其对哺乳动物的影响。

在另一优选例中，所述哺乳动物为患有功能性神经元死亡相关的神经系统疾病的哺乳动物。

在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述“显著低于”指A1/A0≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述细胞包括胶质细胞。

在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

本发明第八方面提供了一种促进星形胶质细胞分化为多巴胺神经元的方法，包括步骤：

在Ptbp1基因或RNA或其编码蛋白的抑制剂或本发明第二方面所述的组合物存在下，培养星形胶质细胞，从而促进星形胶质细胞分化为多巴胺神经元。

在另一优选例中，所述星形胶质细胞包括纹状体星形胶质细胞。

在另一优选例中，所述星形胶质细胞为脑组织的星形胶质细胞。

在另一优选例中，所述星形胶质细胞为体外的细胞。

在另一优选例中，所述Ptbp1基因或其编码蛋白抑制剂的作用浓度(病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述组合物的作用浓度(病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述的方法是非诊断非治疗方法。

本发明第九方面提供了一种促进穆勒胶质细胞分化为视神经节细胞的方法，包括步骤：在Ptbp1基因或RNA或其编码蛋白的抑制剂或本发明第二方面所述的组合物存在下，从而促进视网膜穆勒胶质细胞分化为视神经节细胞。

在另一优选例中，所述Ptbp1基因或RNA或其编码蛋白的抑制剂的作用浓度 (病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述组合物的作用浓度(病毒滴度)＞1×10

在另一优选例中，所述的方法是非诊断非治疗方法。

本发明第十方面提供了一种AAV载体，包括：

(a)基因编辑蛋白的编码序列，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、 CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、RNA靶向基因编辑蛋白、或其组合；和

(b)gRNA，所述gRNA引导所述基因编辑蛋白特异性结合Ptbp1基因的DNA 或RNA。

在另一优选例中，所述AAV载体还包括神经胶质细胞特异性启动子(例如 GFAP启动子)，用于驱动所述基因编辑蛋白的表达。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CasRx可以在体外特异性敲低Ptbp1 mRNA1。(A)CasRx介导的 Ptbp1mRNA敲低的示意图。(B)示意图显示了Ptbp1基因中六个gRNA的靶位点。(C和D)不同组合的gRNA的敲低效率。gRNA 5和6在N2a细胞(C)和星形胶质细胞(D)中均显示出最高的敲除效率。上方的数字表示每组重复的次数。所有值均以平均值±SEM表示。(E和F)CasRx-Ptbp1可以特异性敲低Ptbp1。N2a个细胞 (E)，n＝4个独立重复；星形胶质细胞(F)，n＝2个独立重复。

图2显示了AAV特异性和表达，GFP表达随时间关闭以及转化的RGC的亚型，与图1相关。(A)与CasRx对照(x轴

图3显示了Ptbp1组合式将MG转换为完整成熟视网膜中的RGC。(A)MG 到RGC转换的示意图。载体I(AAV-GFAP-GFP-Cre)编码由MG特异性启动子 GFAP驱动的Cre重组酶和GFP，载体II(AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1)编码CasRx 和gRNA。为了诱导RGC，向视网膜(5周龄的Ai9小鼠)注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1或对照载体AAV-GFAP-CasRx以及AAV-GFAP-GFP-Cre。注射后约一个月检查转化的发生。ONL，外核层；OPL，外丛状层；INL，内核层；IPL，内部丛状层；GCL，神经节细胞层。(B)代表性图像显示了GCL 中tdTomato和Brn3a的共定位(虚线)。白色箭头表示未与Brn3a共定位的 MG的末端，黄色箭头表示tdTomato和Brn3a在注射AAV-GFAP-GFP-Cre和 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1的视网膜中的共定位。Brn3a是RGC的特异性标记物。比例尺，20微米。(C)AAV注射后1个月时，GCL中tdTomato

图4显示了敲低Ptbp1在C57BL小鼠完整视网膜中将MG转化为RGC，与图 3相关。

(A)从MG诱导RGC的示意图。载体1(GFAP-mCherry)表达由MG特异性启动子GFAP驱动的mCherry，载体2(AAV-EFS-CasRx-Ptbp1)在光谱的启动子下表达gRNA和CasRx。为了诱导RGC，向视网膜注射AAV-GFAP-mCherry，同时注射AAV-EFS-CasRx-Ptbp1或对照病毒AAV-GFAP-mCherry。注射后2-3周检查转化的发生。(B)代表性图像显示mCherry和MG标记Sox9的共定位，表明AAV-GFAP-mCherry在MG中特异性表达。比例尺，50微米。(C，D)代表性图像显示了GCL中的mCherry+Brn3a+和mCherry+Rbpms+细胞。每组n＝3个视网膜。比例尺，50微米。(E)类似RGC的mCherry+细胞对LED光的产生电生理反应。

图5显示了敲低Ptbp1将MG转化为无长突细胞，与图3相关。(A)在注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1的Ai9小鼠完整视网膜中观察到tdTomato+Pax6+细胞。绿色箭头指示tdTomato+细胞与Pax6不共定位，黄色箭头指示Pax6和 tdTomato共定位。请注意，Pax6是无长突细胞的标记物。比例尺，20微米。 (B)未观察到tdTomato+Prox1+细胞。箭头指示tdTomato细胞不会与Prox1 (双极细胞的标志物)共定位。比例尺，20微米。(C)在感光细胞层(ONL) 中未观察到tdTomato+细胞。白色箭头表示GCL中的tdTomato阳性RGC样细胞，黄色箭头表示INL中的tdTomato+精蛋白样细胞，绿色箭头表示MG的tdTomato+ 投射。比例尺，20微米。每组独立重复实验至少3次，结果相似。

图6显示了在NMDA引起的视网膜损伤的小鼠模型中诱导MG到RGC的转换。 (A)实验设计。通过玻璃体内注射NMDA(200mM，1.5mL)到4-8周龄的Ai9 小鼠中引起视网膜损伤。NMDA注射后两到三周，通过视网膜下注射AAV。AAV 注射后1个月进行免疫染色和行为测试。(B)NMDA注射基本上杀死了GCL中大部分的RGC。比例尺，50微米。(C)tdTomato和Brn3a的共定位。黄色箭头指示Brn3a和tdTomato在GCL中的共定位。n＝6个视网膜，比例尺，20微米。(D)GCL中Brn3a+或tdTomato+或tdTomato+Brn3a+细胞的数量。未损伤的视网膜，n＝6个视网膜；GFAP-CasRx加GFAP-GFP-Cre，n＝6个视网膜； GFAP-CasRx-Ptbp1加GFAP-GFP-Cre，n＝7个视网膜。数据表示为平均值±SEM， *p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，非配对t检验。(E)tdTomato和Rbpms的共定位。黄色箭头表示在注入GFAP-CasRx-Ptbp1加GFAP-GFP-Cre的GCL中， Rbpms和tdTomato的共定位。比例尺，20微米。(F)GCL中Rbpms+或tdTomato+ 或tdTomato+Rbpms+细胞的数量。未受伤的视网膜，n＝6个视网膜；GFAP-CasRx 加上GFAP-GFP-Cre，n＝7个视网膜；GFAP-CasRx-Ptbp1加GFAP-GFP-Cre，n＝7 个视网膜。数据表示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，非配对t检验。(G)图像显示了在双光子显微镜下记录的代表性RGC样tdTomato+ 细胞。比例尺，20微米。(H)诱导的视神经节细胞对光的反应。总共记录了8 个细胞，其中6个显示了对LED光的响应。在这些细胞中，有5个是ON细胞，有1个是OFF细胞。

图7显示了MG到RGC转换的进度，与图6相关。(A)代表性图像显示了在完整视网膜中五个不同时间点(未注射NMDA)中MG到RGC的转化。箭头指示诱导的RGC。比例尺，20微米。实验独立重复≥3次，结果相似。请注意，“2个月”中的代表性图片也显示在图2B和2D中。(B)GCL中tdTomato+Brn3a+和tdTomato+Rbpms+ 细胞的绝对数量。请注意，图1C和3E中也显示了“1个月”中的值。所有值均以平均值±SEM表示。(C)代表性图像显示了AAV注射后1.5周时诱导细胞的中间阶段(白色箭头)。每组n>＝3只小鼠。请注意，中间单元通常会丢失其在ONL中的投射。比例尺，10微米。实验独立重复≥3次，结果相似。(D)代表性图像显示了在四个不同时间点，NMDA损伤的视网膜中的MG转化为RGC的过程。箭头指示诱导的 RGC。比例尺，20微米。请注意，“3个月”中的代表图像也显示在图3C和3E中。实验独立重复≥2次，结果相似。

图8显示了转换后的RGC的可以投射到大脑和部分的恢复视觉功能。(A) 视觉通路示意图。RGC通过视神经发送轴突，将视神经信号传送到视网膜外的背侧膝状核和上丘中。(B)视网膜平铺图。黄色箭头表示MG衍生的tdTomato 阳性RGC轴突。比例尺，100微米。每组重复实验3次，结果相似。(C)代表性图像显示了视神经中诱导的RGC的tdTomato+轴突。比例尺，200微米。每组独立重复5次，结果相似。(D和E)代表性图像显示在对侧背侧膝状核(D)和上丘(E)(大脑中RGC投射的目标区域)中观察到了强信号。每组独立重复4次，结果相似。请注意，同侧背侧膝状核和SC显示弱的tdTomato+信号。比例尺，500微米(左)，50微米(右)。(F)VEP记录的示意图。(G)VEP在初级视觉皮层中发放情况。显示了来自同一组小鼠的反应，每条线代表一个视网膜。柱状图上面代表每组视网膜的数量。(H)野生型(WT，n＝8个视网膜)， NMDA和AAV-GFAP-mCherry(n＝12个视网膜)，NMDA，AAV-GFAP-mCherry和 AAV-GFAP-CasRx(n＝11个视网膜)，以及NMDA，AAV-GFAP-mCherry和 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1(n＝8个视网膜)。每个点代表一只小鼠。数据表示为平均值±SEM，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，非配对t检验。(I)暗/亮偏好测试的设计。请注意，两只眼睛均接受NMDA治疗，并在NMDA注射2周后注射了相同的AAV。(J)在暗室中花费的时间百分比。WT，n＝13只小鼠；NMDA和 GFAP-mCherry，n＝14只小鼠；NMDA，AAV-GFAP-mCherry和AAV-GFAP-CasRx， n＝12只小鼠；NMDA，AAV-GFAP-mCherry和AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1，n＝12只小鼠。所有值均以平均值±SEM表示；非配对的t检验；*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001。

图9显示了诱导的RGCs向视神经和脑部的投射过程。(A)代表性图像显示在五个不同的时间点(1周，1.5周，2周，3周和1个月)。在AAV注射后1.5 周首次见到tdTomato+轴突(黄色箭头)。比例尺，50微米。实验独立重复3 次，结果相似。(B)背侧膝状核中tdTomato+轴突(黄色箭头)的密度逐渐增加。请注意，在AAV注射后1.5周，在对侧背侧膝状核中首先观察到了tdTomato+ 轴突。比例尺，500微米(上部)，50微米(下部)。实验独立重复3次，结果相似。(C)tdTomato+轴突(黄色箭头)向SC的投射过程。请注意，在AAV 注射后2周，在对侧SC中首先观察到了tdTomato+轴突。比例尺，500微米(上部)，50微米(下部)。实验独立重复3次，结果相似。(D)示意图显示了诱导的RGC逐步的投射过程。

图10显示了受损视网膜中诱导的RGC投射进程，相关图9。(A)代表性图像显示在三个不同的时间点(1周，2周，3周)，NMDA诱导的视神经中tdTomato+轴突逐渐增多。比例尺，50微米。实验独立重复2次，结果相似。(B)背侧膝状核中tdTomato+轴突(黄色箭头)的密度逐渐增加。比例尺，500微米(上部)，50 微米(下部)。实验独立重复2次，结果相似。(C)上丘中tdTomato+轴突(黄色箭头)的投射进程。比例尺，500微米(上部)，50微米(下部)。实验独立重复2 次，结果相似。

图11显示了CasRx介导的胶质细胞向神经元的转化。(A，B)注射策略示意图。注射后约一个月评估转化的效率。ST，纹状体。(C)mCherry和GFAP 的共定位。表达GFAP的mCherry+细胞的百分比，n＝3只小鼠。比例尺，20微米。(D)AAV注射后一周，Flag(与CasRx融合)和GFAP共定位。比例尺， 20微米。(E)注射AAV一周后，纹状体中的Ptbp1表达(由Ptbp1抗体检测到)被下调。通过抗Flag标签的抗体检测CasRx(与Flag融合)的表达。每组n＝4只小鼠。比例尺，10微米。(F)使用ImageJ定量Ptbp1荧光强度。 a.u.代表任意单位。(G)纹状体的代表性图像。NeuN是成熟神经元的特定标记。白色箭头指示NeuN表达与mCherry不共定位，黄色箭头指示NeuN和mCherry 共定位。比例尺，50微米。(H)mCherry+细胞中mCherry+NeuN+细胞的百分比(每组n＝6只小鼠；t＝-4.7，p<0.001)。(I)图像显示mCherry+NeuN+谷氨酰胺酶阳性细胞(粉红色箭头)与mCherry+NeuN+谷氨酰胺酶阴性细胞(黄色箭头)相邻。比例尺，10微米。(J)mCherry+NeuN+细胞中mCherry+谷氨酰胺酶+NeuN+细胞的百分比。N＝5只小鼠。(K)代表性图像显示mCherry+NeuN+ 细胞很少与Somatostatin共定位。黄色箭头表示mCherry+NeuN+Somatostatin- 细胞，粉红色箭头表示mCherry+NeuN+Somatostatin+细胞。对照AAV显示不存在mCherry+SST+细胞，表明SST+细胞不能被AAV-GFAP-mCherry感染。独立重复实验5次，结果相似。比例尺，20微米。(L)代表性图像显示mCherry+NeuN+ 细胞不与Palvabumin共定位。独立重复实验4次，结果相似。比例尺，20微米。(M)在完整纹状体中观察到mCherry+TH+细胞(白色箭头)。比例尺，20 微米。(N)mCherry+细胞中mCherry+TH+细胞的百分比，每组n＝5只小鼠。(O) 通常，mCherry+TH+细胞中显示NeuN表达很低(上部，白色箭头)或检测不到的水平(下部，黄色箭头)。比例尺，5微米。独立重复实验5次，结果相似。所有值均以平均值±SEM表示；非配对的t检验；*p<0.05，**p<0.01， ***p<0.001。

图12显示了在帕金森模型小鼠中将星形胶质细胞转化为多巴胺神经元。 (A和B)实验概述。将6-OHDA单侧注射到黑质中。3周后，将 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1加AAV-GFAP-mCherry，AAV-GFAP-CasRx加AAV-GFAP-mCherry或生理盐水注入大鼠的同侧(相对于6-OHDA注入侧)的纹状体中(B)AAV注射后约1个月或3个月进行免疫染色。(C)AAV注射后1个月或3个月，转化的mCherry+TH+(黄色箭头)和mCherry+DAT+(黄色箭头)细胞共聚焦图像。橙色箭头指示已转化的mCherry+TH+DAT+细胞的神经突触。请注意，TH和DAT是多巴胺神经元特异性标记。比例尺，50微米或10微米。 (D)mCherry+细胞中mCherry+TH+细胞的百分比。AAV-GFAP-CasRx，1个月：n＝5 只小鼠；AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1，1个月：n＝5只小鼠；AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1， 3个月：n＝3只小鼠。(E)TH+细胞中mCherry+TH+细胞的百分比，每组n＝5只小鼠。比例尺，50微米。(F)mCherry+细胞中mCherry+DAT+细胞的百分比。 AAV-GFAP-CasRx，1个月：n＝5只小鼠；AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1，1个月：n＝5 只小鼠；AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1，3个月：n＝3只小鼠。(G)mCherry+TH+细胞中mCherry+DAT+TH+细胞的百分比。AAV-GFAP-CasRx，1个月：n＝5只小鼠； AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1，1个月：n＝5只小鼠；AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1，3个月：n＝3只小鼠。(H)代表图像显示ALDH1A1和GIRK2表达与mCherry+TH+(黄色箭头)共定位，而Calbindin表达(橙色箭头)与mCherry+DAT+不共定位。 ALDH1A1和GIRK2是SNc A9区多巴胺神经元特异性标记，而calbindin是VTA 多巴胺神经元特异性标记。每组n＝3只小鼠。比例尺，50微米。(I)mCherry+ 细胞中mCherry+ALDH1A1+,mCherry+GIRK2+和mCherry+calbindin+细胞的百分比。每组n＝3只小鼠。(J)mCherry+TH+细胞中mCherry+TH+ALDH1A1+和 mCherry+TH+GIRK2+的百分比；和mCherry+DAT+细胞中的 mCherry+DAT+calbindin+细胞。每组n＝3只小鼠。(K)在纹状体切片中进行全细胞记录(n＝22个细胞)。该图显示了神经元样mCherry+细胞产生重复动作电位(22个细胞中的20个)和整流的能力(10个细胞中的4个，绿色)。(L) 图像显示了诱导神经元的自发突触电流。(M)超极化的电压门控电流。(N)代表性图像显示mCherry+TH+细胞表达了VMAT2(黄色箭头)和mCherry+TH+细胞中 mCherry+VMAT2+TH+细胞的百分比，n＝3小鼠。比例尺，20微米。(o)图像显示AAV注射1个月后mCherry+细胞可以摄取FFN206(蓝色)(一种荧光多巴胺衍生物)。n>＝每组10个切片。比例尺，30微米(上部)，20微米(下部)。(P)FFN206在mCherry+细胞(黄色箭头)可以被释放。图像显示了高KCl 诱导的FFN206释放。比例尺，10微米。(Q)注射AAV-GFAP-mCherry加 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1的切片中KCl诱导的FFN206释放的统计分析，n＝25 mCherry+blue+细胞。从5个切片中(n＝3只小鼠)分析了25个细胞。所有值均表示为平均值±SEM。非配对的t检验；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图13显示了在6-OHDA诱导的帕金森疾病小鼠模型中，敲低Ptbp1将星形胶质细胞转化为多巴胺神经元。(A)实验示意图。(B)染色显示同侧黑质(相对于6-OHDA注入侧)TH+神经元(绿色)死亡。比例尺，100微米。实验独立重复12次，结果相似。(C)DAT染色显示同侧纹状体中的多巴胺神经元纤维 (绿色)消失。比例尺，500微米。实验被独立重复>10次，结果相似。(D， E)代表性的共聚焦图像，显示在注射AAV后的不同时间点的mCherry+TH+和mCherry+DAT+细胞，以及mCherry+TH+和mCherry+DAT+细胞的定量。每组n>＝3 只小鼠。比例尺，50微米。注意，数据“GFAP-CasRx，1个月”，“GFAP-CasRx-Ptbp1，1个月”和“GFAP-CasRx-Ptbp1，3个月”也显示在图 6C，6D和6中。比例尺，50微米。(F)帕金森疾病模型小鼠中TH+细胞的绝对数量。(G)mCherry+TH+细胞的共聚焦图像和TH+细胞中mCherry+TH+细胞的百分比，每组n＝5只小鼠。比例尺，50微米。(H)mCherry+细胞中mCherry+TH+ 细胞的百分比。(I)PD模型小鼠中DAT+ 细胞的绝对数量。(J，K)mCherry+DDC+细胞的共聚焦图像和mCherry+细胞中 mCherry+DDC+细胞的百分比，每组n＝5只小鼠。DDC是多巴胺神经元标记。比例尺，50微米。(L，M)代表性图像显示了FOXA2和mCherry(黄色箭头)的共定位，以及mCherry+FOXA2+细胞在细胞中的百分比。每组n＝5只小鼠。FOXA2 是多巴胺神经元标记。比例尺，30微米。(N)代表性图像显示mCherry+TH+ 细胞未与代表性纹状体中间神经元标记PV，SST和CR共定位。黄色箭头表示 mCherry+TH+细胞，蓝色箭头表示PV+，SST+或CR+细胞。请注意，SST与mCherry 共定位，但不与TH共定位，这与图S1H中的结果一致，表明敲除Ptbp1可以稀疏地诱导SST+神经元。实验独立重复3次，结果相似。比例尺，20微米。 (O)注射AAV之前和之后1个月的净转数比较。点上方的数字表示每组小鼠的数量。配对t检验。“1个月”的数据也显示在图7中。(P)阿扑吗啡注射引起的净旋转(转/分钟)。每只小鼠在1个月和3个月时评估行为，每组n＝3 只小鼠。双向ANOVA和bonferroni的检验。“1个月”的数据也显示在图7 中。(Q)苯丙胺注射引起的净旋转(每分钟转数)，每组n＝3只小鼠。双向 ANOVA和bonferroni的检验。“1个月”的数据也显示在图7中。所有值均以平均值±SEM表示；非配对的t检验；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图14显示了诱导的神经元减轻了帕金森疾病模型小鼠的运动功能障碍.(A) 实验设计。(B)阿扑吗啡注射引起的净旋转(对侧-同侧)。(C)苯丙胺注射液引起的净旋转(同侧-对侧)。(D)全身注射苯丙胺后，同侧旋转相对于总旋转数的百分比(同侧/总旋转)。(E)自发同侧触摸相对于触摸总数的百分比。(F) 转棒仪测试。结果表示为小鼠掉落前停留在加速的旋转棒上的时间(秒)。条形上方的数字表示每组小鼠的数量。所有值均以平均值±SEM表示。单向方差分析，再进行Tukey检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图15显示了体外Ptbp1敲低工具脱靶的检测方案。检测组质粒分别转染 N2a细胞(1)，48小时后收取细胞，使用流式细胞仪分选出转染阳性细胞(2)，提取RNA后，进行转录组测序(3，RNA-seq)分析。为了检测不同工具敲低Ptbp1 的脱靶效应，实验设置了Cas13e-sg(Ptbp1-target)实验组，以及Cas13e-sg (none-target)对照组。同时，为了与其他基因编辑工具进行比较，我们设置了Cas13d-sg(Ptbp1-target)以及Cas13d-sg(none-target)对照组和shRNA (Ptbp1-target)以及shRNA(none-target)对照组。结果预计Cas13e-sg(Ptbp1-target)编辑工具组合具有较低的脱靶效应。

图16显示了体内Ptbp1敲低后转分化效率的检测方案。本实验使用6-OHDA 诱导的帕金森小鼠模型，通过在小鼠MFB(Medial Forebrain Bundle)中注射 6-OHDA损伤损伤多巴胺神经元，模拟帕金森疾病表型。诱导模型21天后在小鼠纹状体(Striatum)分别注射实验组以及对照组AAV病毒，并且共注了特异性标记胶质细胞的AAV病毒(GFAP启动子驱动表达mCherry)。病毒注射28 天或者90天后，通过行为测定分析以及组织染色分析对体内转分化效率进行验证。本实验涉及编辑工具均使用AAV载体，实验设置了Cas13e-sg (Ptbp1-target)实验组，以及Cas13e-sg(none-target)、Cas13d-sg (Ptbp1-target)和Cas13d-sg(none-target)对照组。以上四组基因编辑工具，均由胶质细胞特异性GFAP启动子驱动表达Cas13e/d蛋白，由U6启动子驱动表达相应sg。同时，增加了shRNA(Ptbp1-target)、shRNA(none-target) 对照组，由U6启动子驱动表达。结果预计Cas13e-sg(Ptbp1-target)编辑工具组合能够更有效的实现胶质细胞体内转分化。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，抑制胶质细胞的ptbp1 基因或RNA或其编码蛋白的表达或活性，可有效诱导胶质细胞向功能性神经元的分化，从而治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病。在此基础上，本发明人完成了本发明。

在本发明中，视网膜神经节细胞(RGC)退化是造成永久性失明的主要缘由。而Müller胶质细胞(MG)转分化为功能性RGC可有助于恢复视力。发明人发现，通过在成熟小鼠视网膜中使用RNA靶向的CRISPR系统CasRx来敲低Ptbp1，可将MG直接转变为功能性RGC。此外，在由NMDA(N-甲基-d-天冬氨酸)诱导的视网膜损伤的小鼠模型中，从MG转变的RGC实现了对中央视觉区域的功能性投射，并使视觉功能得到改善。因此，由CasRx介导的Ptbp1敲低会是一种很有前景的治疗由神经变性引起的视网膜疾病的的疗法。

本申请使用最近表征的RNA靶向CRISPR系统CasRx对Ptbp1进行抑制。CasRx 介导的再生通过DNA编辑核酸酶避免了shRNA诱导的实质性脱靶效应的出现和永久性改变基因的风险，提供了一种能够治疗多种疾病的卓越工具。

如本文所用，Müller胶质细胞(MG)是视网膜组织中的主要神经胶质细胞, 视网膜神经节细胞(RGC)是位于视网膜最内层的神经细胞，它的树突主要与双极细胞联系，它的轴突延伸至视神经乳头处，形成视神经。

视网膜疾病视是一种眼部疾病。视网膜疾病常见的有以下5种：①血管和血管系统病变。如视网膜血管阻塞，动脉硬化性、高血压性、血液病性以及糖尿病性眼底病变等。②视网膜炎症。与脉络膜炎和视神经炎相互影响密切相关。③视网膜脱离。指视网膜神经层与色素上皮层的分离。④视网膜变性及营养不良。具有遗传因素。⑤视网膜肿瘤。其中以视网膜母细胞瘤为多见。

在本发明中，优选的视网膜疾病为神经变性引起的视网膜疾病，症状主要表现在视力减退或者失明。

在本发明中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。在一优选实施方式中，本发明的基因编辑器包括基因编辑蛋白和任选的gRNA。

术语“重编程”或“转分化”可以指从不同类型的细胞(例如成纤维细胞) 产生特定谱系的细胞(例如神经元细胞)而没有中间分化的过程。

功能性神经元死亡相关的神经系统疾病

在本发明中，功能性神经元死亡相关的神经系统疾病主要包括帕金森病和视神经节死亡导致的视力障碍。

在一优选实施方式中，功能性神经元变性相关的神经系统疾病包括，但并不限于，青光眼、年龄相关的RGC丧失、视神经损伤、视网膜缺血、Leber遗传性视神经病变、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、精神分裂症、抑郁、吸毒、运动障碍(例如舞蹈病，胆脂过多症和动作障碍)、运动神经元损伤疾病(例如肌萎缩侧索硬化，脊髓损伤)、躁郁症、自闭症谱系障碍(ASD)、功能障碍、帕金森疾病。

星形胶质细胞

星形胶质细胞，是哺乳动物脑内数量最多的一类细胞。它们执行许多功能，包括生化支撑(例如形成血-脑屏障)，为神经元提供营养，维持细胞外离子平衡，并参与脑和脊髓损伤后的修复和瘢痕形成。根据胶质丝的含量以及胞突的形状可将星形胶质细胞分为两种：纤维性星形胶质细胞(fibrous astrocyte) 多分布在脑和脊髓的白质，突起细长，分支较少，胞质中含大量胶质丝；原浆性星形胶质细胞(protoplasmic astrocyte)，多分布在灰质，细胞突起粗短，分支多。

可用于本发明的星形胶质细胞没有特别限制，包括哺乳动物中枢神经系统来源的各种星形胶质细胞，例如来源于纹状体、脊髓、背侧中脑或大脑皮层，较佳地，来源于纹状体。

功能性神经元

在本发明中，功能性神经元可以指能够通过化学或电信号发送或接收信息的神经元。在一些实施方案中，功能性神经元展现出存在于正常神经系统中的成熟神经元的一种或多种功能特性，包括但不限于：兴奋性(例如，表现出动作电位的能力，例如快速上升和随后的下降)(跨细胞膜的电压或膜电位)，与其他神经元形成突触连接，突触前神经递质释放和突触后反应(例如，兴奋性突触后电流或抑制性突触后电流)。

在一些实施方案中，功能性神经元的特征在于其表达功能神经元的一种或多种标记，包括但不限于突触蛋白，突触素，谷氨酸脱羧酶67(GAD67)，谷氨酸脱羧酶67(GAD65)，小白蛋白，多巴胺-和cAMP调节的神经元磷蛋白 32(DARPP32)，囊泡谷氨酸转运蛋白1(vGLUT1)，囊泡谷氨酸转运蛋白2 (vGLUT2)，乙酰胆碱，酪氨酸羟化酶(TH)，多巴胺，囊泡GABA转运蛋白(VGAT)和γ-氨基丁酸(GABA)。

多巴胺神经元

多巴胺能神经元(dopaminergic neuron)含有并释放多巴胺(dopamine，DA) 作为神经递质的神经元。多巴胺属于儿茶酚胺类神经递质，在中枢神经系统中发挥重要的生物学作用，大脑内的多巴胺能神经元主要集中在中脑的黑质致密区(substantria nigrapars compacta,SNc)、腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)、下丘脑和脑室周围。很多实验证实多巴胺能神经元与人体的多种疾病密切相关，最典型的就是帕金森疾病。

神经退行性疾病

神经退行性疾病是脑部和脊髓的神经元丧失所致的疾病。神经元是神经系统最重要的组层部分，他的死亡会最终导致神经系统的功能障碍。病人在罹患神经退行性疾病之后，会出现行动或认知障碍，病情的发展往往导致诸多并发症，给患者的生活造成严重伤害。在临床上，神经退行性疾病主要包括有阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈症、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症等。目前对神经性退行性疾病只能做到缓解或者延缓疾病的进展，不能达到完全治愈的地步。帕金森病(PD)是一种严重的神经退行性疾病，其特征是中脑黑质多巴胺神经元的丧失。

基因编辑器

在本发明中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。在一优选实施方式中，本发明的基因编辑器包括基因编辑蛋白和任选的gRNA。

基因编辑蛋白

在本发明中，基因编辑蛋白的核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型的基因编辑蛋白的来源包括(但并不限于)：黄化瘤胃球菌(Ruminococcus Flavefaciens)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)。

在本发明的一个优选例中，所述基因编辑蛋白包括，但并不限于Cas13d、 CasRx、Cas13e、CRISPR/Cas9、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、 Cas13f、RNA靶向基因编辑蛋白。

ptbp1蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“ptbp1蛋白”、“ptbp1多肽”、“PTB”可互换使用，都指具有ptbp1氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的ptbp1蛋白。此外，该术语还包括全长的ptbp1及其片段。本发明所指的ptbp1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

ptbp1蛋白为多聚嘧啶区结合蛋白1，是一个RNA结合蛋白，调控着RNA 剪接调控。同时也对RNA的其他功能起到非常关键的左右。

在本发明中，术语“ptbp1基因”、“ptbp1多核苷酸”、“PTB基因”可互换使用，都指具有ptbp1核苷酸序列的核酸序列。

人ptbp1基因的基因组全长14936bp(NCBI GenBank登录号为5725)。

鼠ptbp1基因的基因组全长10004bp(NCBI GenBank登录号为19205)。

人和鼠ptbp1，在DNA水平的相似性为88％，蛋白序列相似性为84％。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了ptbp1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的ptbp1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA 分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的ptbp1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人ptbp1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，ptbp1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含ptbp1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

腺相关病毒

因腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对遗传性疾病的基因治疗方法受到了广泛的关注。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。 ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的 DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请 No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535 和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于 AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap 基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、 AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。

ptbp1抑制剂和药物组合物

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与ptbp1基因或蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。

可用于本发明的ptbp1抑制剂(或拮抗剂)包括任何可以抑制ptbp1基因或其编码蛋白的表达和/或活性的物质。

例如，所述ptbp1的抑制剂包括ptbp1的抗体、ptbp1核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、基因编辑器、或ptbp1的活性抑制剂。一种优选的ptbp1的抑制剂指的是能够抑制ptbp1表达的基因编辑器。

优选的，本发明的ptbp1的抑制剂包括靶向ptbp1基因序列的第4758－4787 位、和/或5381-5410位的抑制剂。本发明ptbp1抑制剂所作用的对象包括星形胶质细胞或MG细胞。

在一种优选的实施方式中，抑制ptbp1的方法和步骤包括利用ptbp1的抗体中和其蛋白，利用病毒(如腺相关病毒)携带的shRNA或siRNA或基因编辑器进行ptbp1基因的沉默。

对ptbp1的抑制率一般为达到至少50％以上的抑制，优选为60％、70％、80％、90％、95％的抑制，可以基于常规技术，例如流式细胞术、荧光定量PCR或Western blot等方法对ptbp1的抑制率进行控制和检测。

本发明ptbp1蛋白的抑制剂(包括抗体、反义核酸、基因编辑器以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制ptbp1蛋白的表达和/或活性，进而诱导胶质细胞分化为功能性神经元，从而治疗功能性神经元变性相关的神经系统疾病。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：局部、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药、自体细胞提取培养后回输等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明抑制剂(如抗体、基因编辑器、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现，降低星形胶质细胞中的Ptbp1基因或其编码蛋白的表达或活性，可诱导星形胶质细胞向多巴胺神经元的分化，从而预防和/或治疗神经退行性疾病(如帕金森病)。

(2)本发明首次发现，用基因编辑器(包括基因编辑蛋白和gRNA)抑制星形胶质细胞中的ptbp1的表达，可以使星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，进而为帕金森治疗提供了一种潜在的途径。

(3)本发明首次发现，多巴胺神经元的诱导缓解了帕金森小鼠模型的运动功能障碍。

(4)本发明首次发现，RNA靶向的CRISPR系统CasRx可避免传统的CRISPR-Cas9编辑引起的永久性DNA改变的风险。因此，CasRx介导的RNA编辑为治疗各种疾病提供了一种有效的手段。

(5)本发明通过抑制视网膜中Ptbp1的表达，将MG直接转变为功能性RGC。

(6)再生的RGC可被整合到视觉通路中，并改善RGC损伤小鼠模型的视觉功能。

(7)本发明使用RNA靶向的CRISPR系统CasRx来敲低Ptbp1，避免了shRNA诱导的实质性脱靶效应的出现和永久性改变基因的风险，提供了一种能够治疗多种疾病的卓越工具。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

通用方法

动物伦理：动物的使用和饲养符合中国科学院神经科学研究所生物医学研究伦理委员会的指导原则。

向导RNA序列

向导1:5’-tttgtaccgactgctatgtctgggacgat-3’(SEQ ID NO:1)；

向导2:5’-ggctggctgtctccagagggcaggtcaggt-3’(SEQ ID NO:2)；

向导3:5’-gtatagtagttaaccatagtgttggcagcc-3’(SEQ ID NO:3)；

向导4:5’-gctgtcggtcttgagctctttgtggttgga-3’(SEQ ID NO:4)；

向导5:5’-tgtagatgggctgtccacgaagcactggcg-3’(SEQ ID NO:5)；

向导6:5’-gcttggagaagtcgatgcgcagcgtgcagc-3’(SEQ ID NO:6).

瞬时转染星形胶质细胞和qPCR：星形胶质细胞的分离和培养如前所述

立体定向注射：在该研究中使用到了AAV8(图1)和AAV-PhP.eb(图2和 3)。立体定向注射(C57BL/6,1-3个月大)的方法如前所述

免疫荧光染色：免疫荧光染色实施于注射后5-6周(图1)或3-4周(图 2和3)。灌注小鼠后取脑并用4％多聚甲醛(PFA)固定过夜，并在30％蔗糖中保持至少12小时。在包埋后冷冻切片，切片厚度为35μm。免疫荧光染色之前，用0.1M磷酸盐缓冲液(PB)彻底冲洗脑切片。一抗：兔多克隆NeuN抗体 (Brain，1：500，#ABN78，Millipore)，兔多克隆Tbr1抗体(#NG1854874， Mill ipore)，小鼠TH抗体(1：300，MAB318，Millipore)以及兔DAT抗体 (1：100，MAB369，Mill ipore)。二抗：在该研究中使用驴抗小鼠(# 715-545-150，JacksonImmunoResearch)，驴抗兔(#711-545-152，Jackson ImmunoResearch)。在抗体孵育后，洗涤切片并用封片剂(Life Technology) 覆盖。

电生理记录：，AAV注射后5-6周进行电生理学记录，方法如前所述

6-OHDA PD小鼠模型

该研究过程基于以前的研究

阿扑吗啡诱导的旋转试验

小鼠在测试前10分钟腹腔注射0.5mg/kg阿扑吗啡(A4393， Sigma-Aldrich)。之后，将它们各自放置在不透明的圆柱体(直径30cm)中，由摄像机在其上方记录20分钟。旋转的定义为全身转向，其中一个后爪作为中心并且没有切换头部朝向。计算注射一侧和对侧旋转数。将数据量化为20 分钟内的对侧逆转数。

圆筒试验

将每只小鼠轻轻放入玻璃烧杯(1000ml)中，在其前面用相机记录10分钟。分别计算注射侧和对侧爪触壁次数，并将数据量化为同侧触壁数与总触壁数的比率。

转杆试验

将所有小鼠训练2天并在第3天进行测试。在第1天，在转杆上以4圈/ 分钟的固定速度训练小鼠4次，每次300秒。在第2天和第3天，以4至40 圈/分钟的加速训练或测试小鼠4次。将小鼠在脱落前在杆上停留的时间记录为停留期，并且使用3个最长停留期的平均值进行分析。

统计分析：由s.e.m.设置误差线，以非成对双尾t检验或单因素方差分析计算统计学显着性(p<0.05)。所有实验均随机制定，未使用统计学方法预确定样本量，但我们的样本量参考了先前文献中的报道

N2a细胞的瞬时转染，qPCR和RNA-seq

将N2a细胞接种在6孔板中。依标准程序使用Lipofectamine 3000(Thermo FisherScientific)，并用7μg表达gRNA-CasRx-GFP的载体转染细胞。对照质粒不表达gRNA。转染两天后，通过荧光激活细胞分选(FACS)对每个样品收集约 50000个GFP阳性细胞，并裂解后用于qPCR分析。同时分离视网膜以测定AAV的表达。使用Trizol(Ambion)提取RNA，并使用逆转录试剂盒(用于qPCR的 HiScript Q RT SuperMix，Vazyme，Biotech)将其转变为cDNA。使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme，Biotech)追踪扩增过程。

Ptbp1 qPCR引物是：上游引物，5’-AGAGGAGGCTGCCAACACTA-3’(SEQ ID NO:7)；

下游引物，5’-GTCCAGGGTCACTGGGTAGA-3’(SEQ ID NO:8)。

CasRx qPCR引物：上游引物，5’-CCCTGGTGTCCGGCTCTAA-3’(SEQ ID NO: 9)；

下游引物，5’-GGACTCGCCGAAGTACCTCT-3’(SEQ ID NO:10).

对于RNA-seq，在15-cm培养皿中培养N2a细胞，并用70μg质粒进行瞬时转染。通过FACS收集～500000GFP阳性(前20％GFP)的N2a细胞，提取RNA，转变为 cDNA，然后用于全转录组RNA-seq。

玻璃体内注射和视网膜下注射

如前所述，分别通过玻璃体内和视网膜下注射引入NMDA和 AAV(AAV-PHP.eB)。对于视网膜下注射，在Olympus显微镜(Olympus，日本东京) 下用Hamilton注射器(32G针)向眼睛注射高滴度(>1×10

免疫荧光染色

AAV注射1个月后，取眼睛，视神经和脑，用4％多聚甲醛(PFA)固定2小时(眼睛和视神经)或24小时(脑部)，然后在30％蔗糖溶液中保存2(眼睛和视神经)或 24(脑)小时。嵌入和冷冻后，将眼睛和大脑以30μm的厚度切片。用于免疫荧光染色的一抗：小鼠抗Brn3a(1：100，MAB1585，Millipore)，兔抗RBPMS(1： 500,15187-1-AP，Proteintech)，兔抗Sox9(1：500，AB5535，Millipore)，兔抗Pax6(1：500,901301，Biolegent)，兔抗Prox1(1：500，AB5475，Millipore)，以及二抗：Cy

电生理学

小鼠在安乐死前过夜暗适应。在室温的红外显微镜下,在含126mM NaCl、 2.5mMKCl、1.25mM NaH2PO4、2mM CaCl2、2mM NaHCO3和10mM葡萄糖的含氧(95％O2/5％CO2)人工脑脊液(ACSF)中进行视网膜解剖。在正置显微镜的台面上，将视网膜的RGC面向细胞记录槽放置。使用双光子(λ＝1030nm)显微镜识别神经节细胞层中的tdTomato阳性细胞,并在红外光下对它们进行细胞贴附记录。用于记录的移液器(4-7MΩ)中添加了ASCF和0.25mMAlexa488水化。使用Multiclamp 700A放大器和pClamp10软件套组(Molecular Devices)进行记录。在1kHz将信号低通滤波，在10kHz数字化。用白色LED光传送全视野光刺激。记录完毕后，注入电流脉冲填充细胞以使其形态可视化。

视觉诱发电位

在小鼠腹内注射芬太尼(0.05mg/kg)、咪达唑仑(5mg/kg)和美托咪定 (0.5mg/kg)的混合物。将小鼠头部固定在脑立体定位仪中，并通过加热毯使其体温维持在37℃。在主视皮层(V1)(AP-3.6至-3.9mm,ML 2.2mm)的两侧上方进行开颅(直径约1mm)，并去除硬脑膜。视觉刺激由17英寸液晶显示器 (Del l P170S,最大亮度69cd/m2)发出，该显示器距离记录端的眼睛8厘米，同时遮挡记录端同侧的眼部侧边免受视觉刺激影响。我们进行了100次2秒的重复闪光刺激(全视野,100％对比度)，间隔为2秒。使用多位点硅探头(A1× 16-5mm-50-177,NeuroNexus Technologies)在V1(AP-3.6至-3.9mm,ML 2.2 mm)进行记录，每次记录的电极尖端达到的皮质深度约为900μm。参考线和接地线都放置在离记录点至少3毫米的小穿颅术内。使用Cerebus 32通道系统 (Blackrock microsystems)放大并过滤神经反应。使用宽带前端滤波器(0.3～ 500Hz)在2kHz或10kHz对局部场电位(LFP)信号进行采样。LFP对全屏闪光刺激的反应被用于电流源密度(CSD)分析，以确定皮质层4

其中

黑白盒偏好测试

用于明暗箱穿梭实验的设备包括一个有门的的盒子，它被分成了小的(三分之一)暗箱部分和大的(三分之二)照明部分(550流明)。小鼠可以在两个隔室之间自由移动10分钟。小鼠在每个隔室中花费的时间会被相机记录下来并接着使用Ethovision XT进行分析。每次试验后，用70％乙醇清洗隔室以避免嗅觉提示。

统计分析

所有值均显示为平均值±s.e.m.。未配对的t检验用于确定统计学显著性 (p<0.05)。所有实验均为随机化，未使用统计学方法预计样本大小，但我们的样本大小与先前出版物中报道的相似。假设数据分布正常但未经正式测试。

实施例1使用CasRx在体外特异的敲低Ptbp1

为了确定CasRx介导的Ptbp1敲低效率，首先设计了六个靶向Ptbp1的gRNA，并在在培养的N2a细胞和星形胶质细胞中对它们的抑制效率进行了比较(图1A 和1B)。发现两个靶向Ptbp1外显子IV和VII区的gRNA(5和6组合)共转染，可以分别在N2a细胞和星形胶质细胞中实现87％±0.4％和76％±4％的降低(图 1C和1D)。RNA全转录组测序的数据进一步显示这种敲低是非常特异的(图1E， 1F和2A)。

实施例2在成熟视网膜中将穆勒胶质细胞转化为视神经节细胞

以往的研究发现通过shRNA敲低Ptbp1可以将培养的小鼠成纤维细胞和N2a 细胞转化为功能性神经元，接下来研究了在成熟视网膜中，Ptbp1敲低是否会在体内将穆勒胶质细胞转化为视神经节细胞。为了特异性和永久性地标记视网膜穆勒胶质细胞，我们将AAV-GFAP-GFP-Cre注入眼睛Ai9小鼠 (Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE)的特异性诱导tdTomato在穆勒胶质细胞中的表达(图2B和2C)。我们还构建了由穆勒胶质细胞特异性启动子GFAP驱动的 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1(gRNA 5+6)，希望能特异性敲低穆勒胶质细胞中的Ptbp1 和我们同时构建了不靶向Ptbp1的对照病毒AAV-GFAP-CasRx(图3A和2D)。我们首先在年龄大约为5周的Ai9小鼠视网膜下共注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1和 AAV-GFAP-Cre-GFP，1个月后，我们发现许多tdTomato阳性的细胞与视神经节细胞特异性的抗体Brn3a或Rbpms在视网膜神经节细胞层(GCL)中共标，但注射了对照AAV载体的视网膜中我们没有发现这样的细胞(图3B–3E)。这些结果表明了在成熟视网膜中敲低Ptbp1可以将穆勒胶质细胞转化为视神经节细胞。值得注意的是，转化的视神经节细胞细胞由于不再是穆勒胶质细胞，所以由GFAP驱动的GFP 的表达也在诱导的视神经节细胞里表达降低(图2E)。我们同时还通过其它方法证明了这种存在(图4)。除了视神经节细胞，我们还发现了无长突神经细胞(图5)。

实施例3视网膜损伤小鼠模型中MG到RGC的转换

为了探讨MG诱导的RGC是否可以在视网膜损伤小鼠模型中补充丢失的RGC，我们向(NMDA，200mM)4至8周龄的Ai9小鼠玻璃体内注射了NMDA(200mM)，造成了绝大部分RGC的死亡和以及内部丛状层(IPL)厚度的减少。注射NMDA两到三周后，对眼睛注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1加AAV-GFAP-GFP-Cre或对照AAV病毒 (图6A和6B)。AAV注射后一个月，我们发现视神经节细胞层的Brn3a或Rbpms 阳性细胞的数量在注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1的视网膜中明显增加。有意思的是这些细胞大部分都是tdTomato阳性的。而在注射对照AAV的视神经节细胞层我们没有发现增加(图6C-6F)。为了确定MG诱导的RGC是否整合到视网膜环路中并具有接收视觉信息的能力，我们在双光子显微镜下对MG诱导的RGC进行了细胞外记录，以监测光刺激诱发的反应(图6G)。我们发现，在检查的8个细胞中，有6个细胞显示出光刺激诱导的动作电位(图6H)。在这些细胞中，有五个是ON细胞，一个是OFF细胞(图6H)。这些结果表明功能性RGCs可以通过在受损视网膜中降低穆勒细胞中Ptbp1的表达从而将MG转化而来。

实施例4诱导的视神经节细胞部分恢复视觉功能

在视觉系统中，视觉信息通过RGC投射到大脑的背外侧膝状核和上丘(图8A)。在永久性损伤的视网膜中，通过治疗我们在视网膜和视神经中观察到大量的 tdTomato阳性的轴突，但在对照组中未见此类轴突(图8B和8C)。值得注意的是，我们还在背侧膝状核和上丘中发现了大量的tdTomato阳性轴突，而且在大脑对侧的分布要比的同侧要丰富得很多(图8D和8E)，这符合RGC的在正常小鼠粒的正确投射。为了研究受损的视觉功能能否通过诱导的RGC得到改善。在注射AAV病毒1 个月后，我们在麻醉小鼠的初级视觉皮层(V1)中记录了视觉诱发电位(VEP)(图 8F)。在经过AAV-GFPA-CasRx-Ptbp1和AAV-GFAP-mCherry处理的视网膜损伤的小鼠中，我们发现了非常明显的诱发电位，而且幅度与在未损伤的小鼠中发现的相似。在对照组中，我们仅观察到了非常微弱的反应(图8G和8H)。这些结果支持了诱导视神经细胞大概是通过与大脑中现有的功能性背侧膝状核神经元建立了突触连接，从而部分恢复了视觉信息向初级视觉皮层的传递。在行为学角度，我们探讨了 CasRx介导的MG向RGC的转化能否恢复因视网膜损伤而丧失的视力行为(图8I)。首先我们在小鼠的双眼中注射了NMDA，之后注射了AAV病毒。在明/暗偏好测试中，没有经过治疗的小鼠没有明显的待在暗室的倾向，这与视网膜损伤导致的视力丧失相一致。相比之下，而经过治疗的小鼠待在暗室中的持续时间明显增加，甚至接近健康对照小鼠的水平(图8J)，暗示着诱导的视神经细胞改善了视力损伤小鼠的视觉行为。

实施例5视神经节细胞向大脑的投射进程

为了探索什么时间点能开始看的穆勒胶质细胞诱导的视神经节细胞，我们设置了五个不同的时间点(1周，1.5周，2周，3周，和1个月)。我们发现，在AAV 注射后1.5周时，首次在视网膜中发现tdTomato+Rbpms+和tdTomato+Brn3a+细胞，且这些细胞的数量随时间而逐渐增加(图7A和7B)。我们的结果同时表明表明在 AAV注射后1.5周，存在一个中间阶段，诱导的RGC从INL迁移到视神经细胞层(图 7C)。这些发现也在NMDA诱导的永久性损伤的视网膜中得到了证实(图7D)。对于什么时候开始投射到正确的脑区，我们首先发现视神经中的tdTomato阳性轴突随着时间显着增加(图9A)。在大脑中，在1周时在我们没有在脑内发现任何投射，而在AAV注射1.5周的时候我们开始在对侧背侧膝状核中发现了tdTomato阳性的轴突，这种投射不出现在同侧(图9B)。AAV注射2周的时候，我们开始在对侧的下丘发现诱导视神经节细胞的投射(图5C)，AAV注射3周的时候，我们在对侧和同侧背侧膝状核和上丘都发现了诱导的视神经节细胞的投射，而且这种投射的密度在1个月时进一步增加(图9B-9D)。在注射NMDA的受损视网膜中我们也观察到了类似的结果(图10A–10C)。

实施例6星形胶质细胞向神经元的转化

为了进一步挖掘CasRx诱导的胶质-神经元转化在其他系统中的潜在用途，我们进一步研究了在纹状体中星形胶质细胞中敲低Ptbp1的表达是否可以将星形胶质细胞局部转化为多巴胺神经元，一种与帕金森疾病(PD)发生紧密相关的细胞类型。我们首先向野生型小鼠的纹状体中注射了AAV-GFAP-mCherry用来标记星形胶质细胞，同时共注了AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1(gRNA：5+6)以下调星形胶质细胞中 Ptbp1的表达(图11A和11B)。作为对照，我们使用了不包含Ptbp1 gRNA的 AAV-GFAP-CasRx。我们发现，mCherry和CasRx均在星形胶质细胞中大量表达，并在纹状体中显示出较高的共感染效率，其中99％±1％的mCherry+细胞表达CasRx (82％±2％的GFAP

实施例7多巴胺神经元的诱导

为了探索CasRx介导的纹状体中神经元转化潜在的临床应用，我们通过将6- 羟基多巴胺(6-OHDA)单侧输注到黑质中从而诱导产生帕金森小鼠模型。这种输注会引起黑质中多巴胺神经元的死亡以及同侧纹状体中多巴胺能投射的退化(图 13A-13C)。注射6-OHDA后三周，将AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1(或AAV-GFAP-CasRx 作为对照)与AAV-GFAP-mCherry共注入同侧的纹状体中。同时在不同时间点对纹状体细胞的转化进行分析(图12A和12B)。在注射病毒一个月后，，我们发现在 6-OHDA诱导损伤的小鼠中注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1和AAV-GFAP-mCherry的纹状体中出现很高比例的mCherry细胞表达多巴胺神经元的标记物TH，并且在AAV 注射3个月的时候该百分比会增加(19％±0.4％，SEM，n＝5只小鼠，一个月时；32 ％±7％，SEM，n＝3只小鼠，3个月时)(图12C，12D，13D和13E)。而在对照组中，很少在观察到此类细胞(图12C，12D和13D–13F)。另外，在病毒注射区约 80％的TH

实施例8帕金森疾病模型小鼠的运动功能改善

我们进一步检查了纹状体中诱导的多巴胺神经元是否可以缓解6-OHDA诱导的帕金森疾病小鼠模型的运动症状(图14A)。我们同时对运动功能进行了药物和无药物诱导的评估。对于药物诱导的活动，我们首先研究了阿扑吗啡诱导的对侧旋转行为，该行为广泛用于测试单侧多巴胺神经元丢失导致的行为变化。我们发现，与对照小鼠(AAV-GFAP-CasRx和AAV-GFAP-mCherry或注射生理盐水)相比，Ptbp1 敲低小鼠(注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1和AAV-GFAP-mCherry)的阿扑吗啡诱导的净旋转数(计为对侧剪同侧旋转数)显着降低，其水平与未损伤的健康小鼠相当(图 14B，13O和13P)。在另一种全身性安非他明给药引起的同侧旋转行为测试中，通过抑制纹状体中DAT摄取多巴胺来增加细胞间多巴胺浓度。与对照组小鼠相比，注射AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1的小鼠的净旋转数(以同侧对侧旋转数计)和同侧旋转比(以同侧/总旋转数计)显著降低(图14C，14D和13Q)。这些结果表明纹状体中诱导的神经元可以释放出足够的多巴胺，以减轻药物引起的PD模型小鼠的运动功能障碍。此外，我们分别检测两种无药物的运动功能是否改善，即前肢使用不对称性和运动协调性。我们发现，与对照小鼠相比，注射了AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1的小鼠的圆柱体同侧触碰百分比显着降低，并且在旋转脚架上的持续时间更长(图 14E和14F)。总之，这些结果表明纹状体中星形胶质细胞Ptbp1敲低介导的多巴胺神经元转转化减轻了帕金森疾病模型小鼠的运动功能障碍。

实施例9体外Ptbp1敲低工具脱靶的检测

为了探究后续Cas13Rx和Cas13e是否能应用于临床体内的治疗中，本发明尝试用体外系统对这些RNA编辑工具在敲低Ptbp1过程中进行了脱靶检测。首先构建了含有CasRx-sgRNA(该sgRNA组合来源于Cell, DOI:10.1016/j.cell.2020.03.024)、Cas13e-sgRNA(该sgRNA组合为新筛选获得的组合，分别为sgRNA1：TGTGGTTGGAGAACTGGATGTAGATGGGCT(SEQID NO.15)，sgRNA2：GAGCCCATCTGGATCAGTGCCATCTTGCGG(SEQ ID NO.:16)；sgRNA3：AGTCGATGCGCAGCGTGCAGCAGGCGTTGT(SEQ ID NO.: 17))的质粒以及含有Cas13e-NT、CasRx-NT、U6-shPTB(shPTB来源于Nature, DOI:10.1038/s41586-020-2388-4)和U6-shNT的质粒作为对照组(图15)。并且通过脂质体转染的方法分别转入N2a细胞中，由于这些载体质粒上都带有mcherry 报告基因，因此在转染后48小时，我们用流式分选出mcherry阳性细胞，每组收集大约50000个细胞，并进行RNA全转录组测序。通过分析RNA全转录组测序结果可以发现，Cas13e-sgRNA的脱靶率低于CasRx-sgRNA，并且Cas13e-sgRNA 和CasRx-sgRNA的脱靶率均远低于U6-shPTB组。结果表明，CRISPR介导的RNA 编辑工具，尤其是Cas13e在脱靶效应上是优于传统的shRNA工具的。

实施例10体内Ptbp1敲低后转分化效率的检测

为了进一步探究Cas13e在诱导胶质细胞向神经元分化过程中的潜在用途，检查了Cas13e在纹状体内敲低星形胶质细胞中的Ptbp1后是否能将其转化为多巴胺神经元，并且将其与CasRx和shRNA这两种工具进行了比较。为此，构建了GFAP 启动子驱动表达的Cas13e-sgRNA(该sgRNA组合为新筛选获得的组合，分别为 sgRNA1：TGTGGTTGGAGAACTGGATGTAGATGGGCT(SEQ ID NO.15)， sgRNA2：GAGCCCATCTGGATCAGTGCCATCTTGCGG(SEQ ID NO.:16)； sgRNA3：AGTCGATGCGCAGCGTGCAGCAGGCGTTGT(SEQ ID NO.:17))、 CasRx-sgRNA(该sgRNA组合来源于Cell,DOI:10.1016/j.cell.2020.03.024)的质粒以及含有Cas13e-NT、CasRx-NT、U6-shPTB(shPTB来源于Nature, DOI:10.1038/s41586-020-2388-4)和U6-shNT的质粒作为对照组(图16)。随后将这些质粒进行了腺相关病毒AAV的包装和纯化。我们在注射病毒实验的三周前将 6-羟基多巴胺(6-OHDA)单侧输注到黑质中从而诱导产生帕金森小鼠模型，然后向这些帕金森小鼠的纹状体中分别注射了这些AAV病毒，并且共注了 AAV-GFAP-mCherry病毒用于标记星形胶质细胞(图16)。在病毒注射28天和90 天后，分别进行DAT/TH染色、电生理和小鼠行为学的检测，从多方面来对体内转分化效率进行验证。我们发现，利用Cas13e-sgRNA的组合也能够有效的在小鼠体内进行Ptbp1的敲低，并且导致了星形胶质细胞向多巴胺神经元的分化，并且改善了帕金森疾病模型小鼠的运动功能，在运用到临床治疗方面也有潜在的前景。

讨论

在这项工作中，我们的研究表明神经胶质细胞可以通过CasRx介导的Ptbp1 下调被有效地转化为神经元。在NMDA诱导的视网膜损伤模型中，Ptbp1敲低可以诱导受伤的视网膜中的MG转化为RGC，部分恢复了视觉反应和视力依赖性行为。在6-OHDA诱导的帕金森疾病小鼠模型中，它可以将纹状体中星形胶质细胞诱导成多巴胺神经元，并减轻因黑质多巴胺神经元丢失有关的运动功能障碍。这些结果表明，下调单个RNA结合蛋白Ptbp1的表达足以在不同的神经系统中将胶质细胞转化为丢失的特异类型的神经元，这为今后的治疗应用提供了一种新方法。短发夹RNA (shRNA)技术能够切割或抑制所需的转录本，但是它具有非常严重的脱靶作用。 Cas13介导的敲低不仅比RNAi效率更高，还能在很大程度上降低脱靶效应，在其在治疗应用中具有更大的潜力。此外，CasRx在Cas13蛋白质家族中是最小的一个，可以与CRISPR阵列(编码多个引导RNA)被包装在一个AAV中。在基因编辑领域，靶向RNA的CRISPR系统CasRx可以避免由DNA靶向的CRISPR-Cas9编辑系统引起的永久DNA改变的风险，使其在临床应用中具有更大的安全性。

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心

<120> Ptbp1抑制剂在预防和/或治疗功能性神经元死亡相关的神经系统疾病中的应用

<130> P2020-1614

<150> CN 201910760367.6

<151> 2019-08-16

<150> CN 201911046435.9

<151> 2019-10-30

<150> PCT/CN2020/081489

<151> 2020-03-26

<150> CN 202010740568.2

<151> 2020-07-28

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttgtaccga ctgctatgtc tgggacgat 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggctggctgt ctccagaggg caggtcaggt 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtatagtagt taaccatagt gttggcagcc 30

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtagatggg ctgtccacga agcactggcg 30

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<211> 30

<212> DNA

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<400> 6

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<211> 20

<212> DNA

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agaggaggct gccaacacta 20

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<211> 20

<212> DNA

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ggactcgccg aagtacctct 20

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<211> 555

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Met Asp Gly Ile Val Pro Asp Ile Ala Val Gly Thr Lys Arg Gly Ser

1 5 10 15

Asp Glu Leu Phe Ser Thr Cys Val Ser Asn Gly Pro Phe Ile Met Ser

20 25 30

Ser Ser Ala Ser Ala Ala Asn Gly Asn Asp Ser Lys Lys Phe Lys Gly

35 40 45

Asp Asn Arg Ser Ala Gly Val Pro Ser Arg Val Ile His Val Arg Lys

50 55 60

Leu Pro Ser Asp Val Thr Glu Gly Glu Val Ile Ser Leu Gly Leu Pro

65 70 75 80

Phe Gly Lys Val Thr Asn Leu Leu Met Leu Lys Gly Lys Asn Gln Ala

85 90 95

Phe Ile Glu Met Asn Thr Glu Glu Ala Ala Asn Thr Met Val Asn Tyr

100 105 110

Tyr Thr Ser Val Ala Pro Val Leu Arg Gly Gln Pro Ile Tyr Ile Gln

115 120 125

Phe Ser Asn His Lys Glu Leu Lys Thr Asp Ser Ser Pro Asn Gln Ala

130 135 140

Arg Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ala Val Asn Ser Val Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Ala Ala Val Asp Ala Gly Met Ala Met

165 170 175

Ala Gly Gln Ser Pro Val Leu Arg Ile Ile Val Glu Asn Leu Phe Tyr

180 185 190

Pro Val Thr Leu Asp Val Leu His Gln Ile Phe Ser Lys Phe Gly Thr

195 200 205

Val Leu Lys Ile Ile Thr Phe Thr Lys Asn Asn Gln Phe Gln Ala Leu

210 215 220

Leu Gln Tyr Ala Asp Pro Val Ser Ala Gln His Ala Lys Leu Ser Leu

225 230 235 240

Asp Gly Gln Asn Ile Tyr Asn Ala Cys Cys Thr Leu Arg Ile Asp Phe

245 250 255

Ser Lys Leu Thr Ser Leu Asn Val Lys Tyr Asn Asn Asp Lys Ser Arg

260 265 270

Asp Tyr Thr Arg Pro Asp Leu Pro Ser Gly Asp Ser Gln Pro Ser Leu

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Asp Gln Thr Met Ala Ala Ala Phe Gly Ala Pro Gly Ile Met Ser Ala

290 295 300

Ser Pro Tyr Ala Gly Ala Gly Phe Pro Pro Thr Phe Ala Ile Pro Gln

305 310 315 320

Ala Ala Gly Leu Ser Val Pro Asn Val His Gly Ala Leu Ala Pro Leu

325 330 335

Ala Ile Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Arg Ile Ala Ile

340 345 350

Pro Gly Leu Ala Gly Ala Gly Asn Ser Val Leu Leu Val Ser Asn Leu

355 360 365

Asn Pro Glu Arg Val Thr Pro Gln Ser Leu Phe Ile Leu Phe Gly Val

370 375 380

Tyr Gly Asp Val Gln Arg Val Lys Ile Leu Phe Asn Lys Lys Glu Asn

385 390 395 400

Ala Leu Val Gln Met Ala Asp Gly Ser Gln Ala Gln Leu Ala Met Ser

405 410 415

His Leu Asn Gly His Lys Leu His Gly Lys Ser Val Arg Ile Thr Leu

420 425 430

Ser Lys His Gln Ser Val Gln Leu Pro Arg Glu Gly Gln Glu Asp Gln

435 440 445

Gly Leu Thr Lys Asp Tyr Gly Ser Ser Pro Leu His Arg Phe Lys Lys

450 455 460

Pro Gly Ser Lys Asn Phe Gln Asn Ile Phe Pro Pro Ser Ala Thr Leu

465 470 475 480

His Leu Ser Asn Ile Pro Pro Ser Val Ser Glu Asp Asp Leu Lys Ser

485 490 495

Leu Phe Ser Ser Asn Gly Gly Val Val Lys Gly Phe Lys Phe Phe Gln

500 505 510

Lys Asp Arg Lys Met Ala Leu Ile Gln Met Gly Ser Val Glu Glu Ala

515 520 525

Val Gln Ala Leu Ile Glu Leu His Asn His Asp Leu Gly Glu Asn His

530 535 540

His Leu Arg Val Ser Phe Ser Lys Ser Thr Ile

545 550 555

<210> 12

<211> 1668

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

atggacggca tcgtcccaga catagcagtc ggtacaaagc ggggatccga cgagctcttc 60

tccacgtgtg tcagcaacgg ccccttcatc atgagcagct ctgcctcagc agccaatgga 120

aacgatagca agaagttcaa aggtgacaac aggagcgcag gagtcccttc cagagtcatc 180

catgtcagaa agctgcccag cgatgtcact gagggcgagg tcatctccct agggctgccc 240

tttggaaagg ttaccaacct tctcatgctg aaggggaaga accaggcctt cattgagatg 300

aacacagagg aggctgccaa cactatggtt aactactata catcggtggc gccagtgctt 360

cgtggacagc ccatctacat ccagttctcc aaccacaaag agctcaagac cgacagctcg 420

cccaaccagg cacgtgccca ggcagccctg caggctgtaa actccgtcca gtctggaaac 480

ctggccttgg cagcgtccgc tgctgccgtg gatgcaggaa tggcaatggc agggcagagc 540

ccagtgctca ggatcattgt ggaaaacctt ttctacccag tgaccctgga cgtgctgcac 600

cagatcttct ctaagtttgg caccgtcctg aagatcatca cgttcaccaa gaacaaccag 660

ttccaggcgc tgctgcagta tgctgaccct gtgagcgccc agcatgccaa gctgtccctg 720

gatggccaga acatctacaa cgcctgctgc acgctgcgca tcgacttctc caagctcacc 780

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gctgctgctg ctgctgcggc cagccgcatt gccatcccag ggttggcagg tgctgggaat 1080

tctgtccttt tggtcagcaa tctgaaccct gagagagtca caccccaaag cctctttatt 1140

ctcttcggcg tctacggtga tgtgcagcgg gtgaagatcc tgttcaataa gaaggagaac 1200

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cacaagctgc acgggaagtc agtgcgcatt acactgtcca agcatcagag tgtgcagctg 1320

cctcgggagg gtcaggagga ccagggcctg accaaggact atggcagctc cccgctgcac 1380

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cacctctcca acatcccgcc ctctgtgtca gaggacgacc tcaagagcct cttctccagc 1500

aacggtggtg tggtcaaagg cttcaagttc ttccagaagg accgcaagat ggcactgatc 1560

cagatgggct ctgtggagga ggctgtgcag gcgctgattg aactgcacaa ccatgacctg 1620

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgtggttgga gaactggatg tagatgggct 30

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