一种类肽寡聚物及其制备方法、药物组合物和微流控芯片

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种类肽寡聚物、该类肽寡聚物的制备方法、含有该类肽寡聚物的药物组合物以及微流控芯片。

背景技术

微流控芯片这一名词最初源于20世纪90年代Manz与Widmer提出微全分析系统(μTAS)。Manz教授成功的把MEMS技术运用到分析化学领域，并在不久后在微芯片上实现了高速毛细管电泳，成果发表在《Science》等杂志上，从此这一领域迅速受到学界重视，并成为当今世界上最前沿的科技领域之一。芯片实验室(Lab on a chip)和微流控芯片(Microfluidic Chip)都是人们对这一领域提出的不同名称，而随着这一学科的应用从最初的分析化学拓展到多个研究与应用领域，以及研究者对这一学科的深入理解，微流控芯片已经成为对这一领域的统称。微流控学是在数十至数百微米尺度通道系统内处理和操纵微量(10

目前主流的检测方案里，微流控芯片表面都是通过偶联抗体或分子探针修饰，分子探针包括抗体、多肽、类肽和核酸适配体等肿瘤部位特定受体蛋白的靶向分子。然而偶联的功能分子需要提供足够的表面活化基团，并且为了降低非特异性吸附带来的噪音，封闭对于芯片也尤为重要。通过化学反应对玻璃基芯片进行表面功能化，能够有效地实现玻璃基芯片的表面修饰，并且使得功能分子的偶联持续有效时间大大延长，既能够保证天然活体样本的活性，有望对体外诊断带来新的启示。

发明内容

本公开至少一实施例提供一种类肽寡聚物，该类肽寡聚物包括：β-苯乙胺亚单位、3-氨基丙酸亚单位和乙二胺亚单位。

例如，在本公开至少一实施例提供的类肽寡聚物中，所述类肽寡聚物具有式I所示的结构：

其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1＝n2，n1和n2均为自然数。

本公开至少一实施例还提供所述类肽寡聚物的制备方法，其中，所述制备方法包括固相合成法。

例如，在本公开至少一实施例提供的制备方法中，所述制备方法包括以下步骤：

(1)按照所述类肽寡聚物的亚单位的连接顺序，将所述类肽寡聚物的第一个亚单位连接至固相载体上；

(2)将溴乙酸在活化剂的活化作用下与连接至所述固相载体上的第一个亚单位的氨基进行反应形成酰胺键；

(3)将所述类肽寡聚物的第二个亚单位的供体与步骤(2)得到的产物进行反应，取代溴原子完成第二个亚单位的连接；

(4)重复进行所述溴乙酸以及后续亚单位的连接，直至完成所有亚单位的连接；

(5)从所述固相载体上将合成得到的类肽寡聚物裂解下来得到该类肽寡聚物。

本公开至少一实施例还提供一种药物组合物，该药物组合物包括：上述任一种类肽寡聚物；以及药学上接受的辅料。

例如，在本公开至少一实施例提供的药物组合物中，所述辅料为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

本公开至少一实施例还提供一种上述任一种药物组合物在制备检测或者诊断与阿尔茨海默症相关的疾病的药物中的用途。

本公开至少一实施例还提供一种上述任一种药物组合物在微流控芯片修饰中的用途。

例如，在本公开至少一实施例提供的用途中，所述芯片包括玻璃基微流控芯片。

本公开至少一实施例还提供一种微流控芯片，所述芯片含有前述的寡聚物纳米片层以及功能层，所述功能层包括GPTMS引导的环氧修饰及12-巯基十二酸引导的封闭活化层修饰。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种类肽寡聚物、该类肽寡聚物的制备方法、含有该类肽寡聚物的药物组合物以及微流控芯片。通过将该类肽寡聚物组装纳米片层，并将该纳米片层用于修饰玻璃基微流控芯片，进一步利用GPTMS及12-巯基十二酸通过反应与上述类肽寡聚物纳米片层之间形成共价键，实现对玻璃基微流控芯片的表面修饰。上述方式有效降低了芯片表面的非特异性吸附，并提供了抗体及小分子的偶联基团，进一步提高了微流控芯片的检测灵敏度和准确性，为体外诊断提供了新的选择。此外，该类修饰方法简单，效率高，且制作成本低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。

图1为本发明一实施例提供的一种类肽寡聚物的合成方法示意图；

图2为本发明一实施例提供的一种二维纳米片层材料的形成过程示意图；

图3为本发明一实施例提供的二维纳米片层的荧光显微镜图像；

图4为本发明一实施例提供的一种芯片表面环氧修饰的流程图；

图5为本发明一实施例提供的一种玻璃基芯片表面修饰及功能层结构示意图；

图6为本发明一实施例提供的一种芯片表面修饰的非特异性结合信号降低的结果图；以及，

图7为本发明一例实施提供的针对阿尔茨海默症生物标志物Aβ42检测亲和力的结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外定义，本公开使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除其他要素。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的SPRi仪器为Plexera Kx5V2，Plexera Bioscience LLC,USA，该仪器主要装配有660nmLED光源、CCD图像采集器和带微流通道的传感芯片，仪器显示每个监测点上反射光强度随时间的变化并记录为SPR曲线。

除非特殊说明，本文中的“nM”指的是“nmol/L”，“mM”指的是“mmol/L”。

类肽分子具有免疫原性低、组织渗透性好、稳定性高、易于修饰且制造成本低等特点。但是在分子探针的应用上，类肽小分子和生物传感器的结合能力不强，从而导致类肽小分子无法作为探针分子；抗体具有与生物传感器紧密结合的特点，但是抗体分子的排列是无序的，其在传感器表面的排布方向随机难以控制，从而导致其特异性较低，且抗体的成本较高。本公开的发明人发现，由类肽小分子和类抗体形成的寡聚物能够很好的结合类肽小分子和抗体的特点，即该类肽寡聚物既具有抗体能够与生物传感器结合紧密的特点，又可以将类肽小分子有序地形成在传感器的表面。此外，该寡聚物形成的分子探针与靶标的亲和作用强，且该寡聚物不能被酶解，能够保证天然活体样本的活性。

类肽(peptoid)与多肽相比，多肽以α氨基酸为结构单元，类肽以N-取代甘氨酸为结构单元。类肽化合物具有良好的生物活性和药理性质，它能够有效地检测或者抑制活体实验中的恶化情况并且具有良好的细胞膜穿透性。目前，已有成熟的类肽合成技术为“亚单位合成”技术。

本公开至少一实施例还提供一种类肽寡聚物，该寡聚物的分子结构式为：

其中，10≥n1≥3，10≥n2≥3，n1＝n2，n1和n2均为自然数。

例如，该寡聚物包括：β-苯乙胺亚单位、3-氨基丙酸亚单位和乙二胺亚单位。

例如，各亚单位的结构式如下所示：

例如，在本公开至少一实施例提供的寡聚物中，该寡聚物包含的亚单位按照以下顺序进行排列：[β-苯乙胺亚单位—3-氨基丙酸亚单位]n

本公开至少一实施例还提供一种寡聚物的制备方法，该制备方法包括固相合成法合成亚单位。

例如，图1为本公开一实施例提供的类肽寡聚物的制备方法的流程图，该制备方法包括以下步骤：

步骤S1：按照该寡聚物的亚单位的连接顺序，将寡聚物的第一个亚单位连接至固相载体上；

步骤S2：将溴乙酸在活化剂的活化下与连接至固相载体上的第一个亚单位的氨基反应形成酰胺键；

步骤S3：将类肽寡聚物的第二个亚单位的供体与步骤S2得到的产物进行反应，取代掉溴原子，完成第二个亚单位的连接；

步骤S4：重复进行溴乙酸以及后续亚单位的连接，直至完成所有亚单位的连接；

步骤S5：从固相载体上将合成得到的寡聚物裂解下来得到该类肽寡聚物。

例如，该寡聚物包括上述左右两侧类肽化合物形成的助链，还包括在该类肽化合物中嵌入的用于检测的各类探针，该左侧助链上均含有氨基，右侧助链上均含有羧基，该助链有助于该寡聚物形成二维层状结构，这样可以使得中间的探针暴露在传感器的表面对各种靶标进行检测，该助链还可以使得该寡聚物的排列更加整齐。

例如，在该寡聚物中，n1＝n2＝3，n1＝n2＝4，n1＝n2＝6，n1＝n2＝8，或者n1＝n2＝10。

需要说明的是，当n1和n2小于3时，会出现链长太短无法组装的问题；当n1和n2大于10时，形成的链太长，该寡聚物中间插入的类肽化合物的密度太低，会出现亲和力减弱，从而无法实现与靶标分子的特异性结合。

示例一

分子结构为：

n1＝n2＝4、n1＝n2＝6或n1＝n2＝8的寡聚物的制备方法具体包括以下步骤：

(1)将Rink amide AM树脂(多肽合成的起始树脂，取代水平0.3mmol/g)溶胀后用六氢吡啶脱保护，将β-苯乙胺与1-羟基苯并三唑等摩尔混合，在N-甲基吗啡啉的活化下进行偶联。

(2)将10mL浓度为2mol/L的溴乙酸和10mL浓度为3.2mol/L的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入Rink amide AM树脂中，在38℃下反应30min，将树脂末端的氨基酰化；

(3)加入2mol/L伯胺在37℃下反应90min，通过亲核取代反应替换溴原子，完成一个亚单位的合成；

(4)重复步骤(2)和(3)直至完成其余单位的合成；

(5)待合成完毕后，侧链保护基团被除去，并用质量百分含量分别为95％的三氟乙酸、2.5％的超纯水和2.5％的三异丙基硅烷将寡聚物从树脂上裂解下来备用。

形成上述结构的寡聚物的过程中，亚单位投入顺序为：

β-苯乙胺、3-氨基丙酸、β-苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、β-苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、β-苯乙胺、3-氨基丙酸；β-苯乙胺、3-氨基丙酸、β-苯乙胺、3-氨基丙酸；乙酸胺、丁二胺、α-甲基苄胺、丁二胺、丁二胺、异丁胺、胡椒基胺、丁二胺；β-苯乙胺、乙二胺、联苯乙胺、乙二胺；β-苯乙胺、乙二胺、联苯乙胺、乙二胺；β-苯乙胺、乙二胺、联苯乙胺、乙二胺；β-苯乙胺、乙二胺、联苯乙胺、乙二胺。

例如，该寡聚物可以溶解到物质的量之比为二甲基亚砜：水＝2:1的二甲基亚砜(DMSO)和水(H

本发明的实施例提供的二维纳米片层材料的制备方法，具体制备方法包括以下步骤：

(1)上述类肽寡聚物通过两亲性在气液界面分布；

(2)通过对其施加侧向压力，使得类肽寡聚物分子链形成致密的单分子层；

(3)通过进一步增大侧向施加压力至临界点，使得单分子层向水溶液中坍塌形成双分子层。

例如，图2为本公开一实施例提供的二维寡聚物的形成过程示意图，如图2所示，形成二维的寡聚物的过程为：将本公开的实施例提供的寡聚物放置于朗格缪尔槽中，该寡聚物包括亲水的一端和疏水的一端，在无外界作用力的情况下，该寡聚物无序的排列在气液的界面处；然后对该无序排列的寡聚物施加外力，该寡聚物在气液界面处有序地排列；进一步地对该有序排列的寡聚物施加外力，该寡聚物被挤压至气液界面之下，在气液界面之下，亲水的一端暴露在外侧，疏水的一端形成在内侧，从而形成二维结构。

寡聚物纳米片层的形成过程如下：将以上示例一得到的浓度为2mM的寡聚物溶于含有10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、100mM氯化钠，pH＝8.0的溶液中，稀释到片层形成缓冲液，至最终浓度为1-100μM，例如，为20μM，然后采用手动摇晃法：将类肽溶液在室温下稳定存放22小时，然后手动轻轻摇晃30秒，再稳定1分钟，重复摇晃-稳定过程5次；或者机器摇晃法：将类肽溶液在管中自水平至垂直缓慢旋转(0.6rpm)，每隔450秒旋转一次；将得到的类肽纳米片层溶液加入尼罗红，至最终浓度为1μM，将溶液放在1％的琼脂上，使用荧光显微镜(Vert.A1,Carl Zeiss Far East,Germany)观察，结果如图3所示，可以观察到明显的纳米片层结构。

微流控芯片用于生物医学检测及诊断，除了其非特异性结合是造成假阳性或假阴性的最主要因素之一，因此屏蔽非特异性吸附极具科研及商业意义。传统意义上的封闭试剂，如BSA、乙醇胺等，虽然能够降低部分非特异性结合，但效果并不理想，特别是对于含量极低的靶标，对于灵敏度和特异性的要求就更加严格，因此通过芯片表面修饰技术来提高检测的灵敏度和特异性具有极为重要的科学意义。

本公开的实施例提供3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷(GPTMS)及12-巯基十二酸通过三步反应形成完整的功能分子层，结合上述类肽纳米片层通过共价连接的方式完成玻璃芯片的表面修饰。

其中，GPTMS结构式为：

12-巯基十二酸结构式为：

如图4所示，本发明玻璃芯片表面进行环氧修饰的主要步骤如下：

(1)在水溶液体系，GPTMS的甲基与水分子发生水解反应，生成Si-OH；

(2)含有Si-OH的GPTMS分子与玻璃芯片表面的Si-OH发生缩合反应，形成Si-O-Si键。

利用12-巯基十二酸对环氧修饰后的玻璃芯片进行质密的单分子层修饰，有效封闭芯片表面，并提供类肽纳米片层偶联需要的-COOH，具体步骤如下：

(1)将环氧修饰后的芯片置于纯水中充分清洗；

(2)将芯片置于1M 12-巯基十二酸的水溶液中充分反应24小时，形成质密的单分子层；

(3)将芯片分别用10×PBS、1×PBS、超纯水深度清洗备用。

利用上述带有探针的类肽寡聚体组装的纳米片层进行功能层修饰，形成完整的芯片结构，如图5所示，具体的步骤如下：

(1)将环氧修饰及封闭好的芯片利用10×PBS、1×PBS、超纯水依次进行深度清洗；

(2)1:1加入EDC/NHS进行羧基活化；

(3)进行类肽纳米片层点样，充分过夜孵育过夜后清洗芯片。

上述芯片结构如图5所示，从上往下依次为寡聚物纳米片层、GPTMS及12-巯基十二酸修饰的功能分子层、结构层、PVX层、Gate(集成电路版图)层和玻璃衬底层。其中结构层、PVX层、Gate层和玻璃衬底层为生物芯片的基本结构。

本公开的实施例提供的寡聚物的合成过程简单并且与Aβ42的结合能力较强，具有极高的亲和力修饰在玻璃基芯片表面可以有效地实现对Aβ42的捕获，进而实现对阿尔茨海默症的血液诊断。

例如，图6为本发明实施例和对比例芯片的非特异性结合信号随时间变化的结果图，其中bio-chip为本发明上述实施例提供的含有类肽寡聚物和修饰功能分子层的芯片，control为含有类肽寡聚物未采用GPTMS及12-巯基十二酸修饰的芯片。可以看出修饰后的芯片大幅度降低了非特异性结合信号，提高了特异性和信噪比。利用酶标仪对芯片修饰后对于非特异性结合信号降低的测试步骤如下：

(1)将修饰好的芯片利用10×PBS、1×PBS、超纯水依次进行深度清洗；

(2)1:1加入EDC/NHS进行羧基活化；

(3)进行类肽纳米片层点样，充分孵育过夜后清洗芯片，并利用探针直接包被的芯片且经过2.5％BSA、5％乙醇胺封闭的芯片作为对照；

(4)配置FITC-HSA的PBS溶液，以流速2μL/s通入步骤(3)的测试芯片和对照芯片，每分钟采集一次荧光信号。

例如，利用表面等离子体共振成像技术对寡聚物与Aβ42间结合能力进行测试的步骤如下：

(1)将寡聚物组装的纳米片层溶解到ddH

(2)将上述寡聚物溶液点在一张环氧修饰后且封闭好的芯片的表面上，每种样品重复3个点，在4℃下放置12小时后，依次用10×PBS、1×PBS、超纯水清洗干净，然后将芯片用1M的盐酸氨基乙醇封闭30分钟，然后用超纯水清洗5次，最后用氮气吹干；

(3)将芯片安装在SPRi仪器上，测定SPRi角并调节至最佳光学位置，在检测区域选取相关的检测点，包括样品点与空白点，设置实验流速为3μL/s；

(4)选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通过浓度为5.68nM、11.4nM、22.8nM、45.6nM和91.2nM进行检测，结合时间为300秒，解离时间为300秒，每个浓度间通入磷酸进行重生。

例如，图7为本公开的示例一中的寡聚物与浓度分别为5.68nM、11.4nM、22.8nM、45.6nM和91.2nM的Aβ42结合的表面等离基元共振检测的结果图，其中，a.u.代表流动相通过阵列后的结合信号减去初始PBS缓冲液的基线信号，曲线是PlexArray HT的测试结果，拟合直线是BIAevalution 4.1拟合得到，从上往下依次为91.2nM的检测线、45.6nM的检测线、22.8nM的检测线、11.4nM的检测线和5.68nM的检测线。a.u.是在表面等离子体共振成像中用来反映结合信号强度的单位，是一种无量纲单位。经拟合，平衡解离常数KD为1.57×10

例如，该寡聚物为二维纳米片层材料，这样可以实现寡聚物耦合在传感器上，并将具有亲和作用的类肽寡聚物展示在传感器的表面。

二维的类肽纳米材料在生物学和电子学上扮演着越来越重要的角色，例如传感、模板的生长和过滤以及作为蛋白质的模拟物测试蛋白质的分子识别和催化能力。通过朗缪尔槽实验装置揭示了类肽纳米片层的形成是一个类肽分子的自组装和把外界机械能转换为类肽分子化学能的一个不寻常的热力学平衡过程。

例如，该药物组合物还包括：上述任一项所述的类肽寡聚物；以及药学上接受的辅料。

例如，该辅料包括赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂和填充剂中的任意一种或至少两种的组合。

例如，赋形剂可以例如是乳剂或油性混悬剂，或聚亚烷二醇类如聚丙二醇。

本发明的实施例提供一种类肽寡聚物、该类肽寡聚物的制备方法、含有该类肽寡聚物的药物组合物以及微流控芯片。具有以下至少一项有益效果：

(1)在本公开至少一实施例提供的类肽纳米片层中，带有探针的类肽纳米片层与靶标分子的结合能力较强，通过表面等离基元共振技术得到该纳米片层与靶标分子的结合动力学常数中的平衡解离常数KD为10

(2)在本公开至少一实施例提供的芯片修饰技术中，可以有效地进行芯片环氧化和羧基化；

(3)在本公开至少一实施例提供的芯片修饰技术中，以该修饰技术为基础的芯片可以有效降低对靶标以外物质的非特异性结合；

(4)本公开至少一实施例提供的类肽寡聚物的合成方法简单，制备的效率高，且制作成本低；

(5)本公开至少一实施例提供的类肽纳米片层的组装方法简单，制备的效率高，且制作成本低。

有以下几点需要说明：

(1)本发明实施例附图只涉及到与本发明实施例涉及到的结构，其他结构可参考通常设计。

(2)为了清晰起见，在用于描述本发明的实施例的附图中，层或区域的厚度被放大或缩小，即这些附图并非按照实际的比例绘制。

(3)在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合以得到新的实施例。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。