一种降钙素原检测试剂盒、制备方法及用途

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种降钙素原检测试剂盒、制备方法及用途。

背景技术

降钙素原(procalcitonin，PCT)是降钙素(calcitonin，CT)的前体物质，是一种由116个氨基酸的残基组成，相对分子质量为13000的糖蛋白；不具有激素活性，是11号染色体上的Calci基因的编码产物。自1993年Assicot等首次报道出PCT可作为细菌感染的早期的标志物以来，已作为一个新的炎症指标，广泛应用在感染性疾病的诊断及鉴别诊断，目前被公认为是最敏感、最有特异性的脓毒血症诊断的指标。

在正常情况下，人体甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)内转录生成CalcimRNA后，翻译成PCT前体，经糖基化和特异性酶切除后生成PCT，再经过不同蛋白水解酶酶解，形成成熟的CT和抗钙素(katacalcin，KC)，成熟的CT的C末端酰胺化才会形成有活性的CT。除生理情况下，C细胞内的合成分泌，PCT还存在异位分泌现象。甲状腺切除术后合并严重感染患者血浆PCT仍然升高。甲状腺髓样细胞癌和小细胞肺癌可同时合成CT和PCT，使血浆CT和PCT升高。LPS、白介素(IL)-1、IL-2、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对PCTmRNA表达呈正刺激效应，可以在短时间内诱导PCT的大量生成。严重细菌感染或者脓毒症时，血浆PCT显著升高，其升高的程度与感染的严重程度呈显著的正相关；而CT并无显著变化，提示在炎症条件下PCT和CT的产生是两个相对独立的过程。

PCT是一种次级炎症因子，其本身不能启动脓毒症反应，但是PCT可放大并加重脓毒症病理过程。脓毒症时血浆PCT水平异常升高，提示PCT在急性免疫反应方面具有某些病理生理功能，但目前尚未完全明了。

PCT产物仅在黏附的单核细胞以及脂肪细胞中出现，在循环粒细胞中并没有发现。系统性炎症会影响组织和单核细胞的黏附，影响其PCT的产生，PCT升高的程度取决于机体发生炎症的范围以及其严重程度，而病毒感染以及自身免疫性疾病则不能诱导PCT的产生。

PCT在体内被特异的蛋白水解酶所降解，其半衰期约为25～30h，很少经肾排出，血浆PCT的肾脏清除率小于1mL/min。对于肾衰竭患者，其血浆PCT水平并无明显升高，血浆PCT水平与尿液PCT水平比例约为4：1，该比例保持相对恒定。持续静脉血液滤过或者血液透析虽然可以清除部分PCT，但血浆PCT水平并无显著的变化。因此，血浆PCT的检测也适用于肾衰竭或接受人工肾治疗的患者。

临床常用PCT检测方法主要包括定量法及半定量法：

半定量法主要包括胶体金比色法，采用专门制备好的PCT-Q检测卡，简便快捷，整个检测过程不超过30min，结果分为4级：正常<0.5ng/mL；轻度升高>0.5ng/mL；明显升高>2ng/mL；显著升高>10ng/mL。此法不依赖仪器、操作简便、快速，适合床旁监测或即时检验(POCT，point-of-care testing)。缺点是不能准确定量。

定量检测包括放射免疫学分析法、化学发光法、透射免疫浊度法等。其中，放射免疫学分析法：检测的是游离降钙素原、结合型降钙素原和降钙素基因相关肽前体的混合物，而不能区分上述3种物质。其检测灵敏度为4ng/L，线性范围为10-77ng/L。该法检测耗时长(19-22h)，而且有放射性元素的污染，使用受到限制。

双抗夹心免疫化学发光法：使用2个单克隆体，分别结合到降钙素原分子的2个部位，这样可排除交叉反应。其检测低限值为0.02ng/mL。该法操作简便、无污染、特异性强、敏感性高，可批量进行检测。

透射免疫浊度法：该测定方法简便、快速，可自动化，适合于批量检测。但是相比前两种方法，灵敏度较低。

酶联免疫吸附法(ELISA)：以双抗体夹心法为例，是在固相载体上包被一种特异性抗体，加入待测样本后，再加入酶标记的另一种抗体，形成双抗体夹心复合物，再通过发光底物的显色作用，使仪器可以定量检测出的免疫反应。因其存在着操作繁琐、灵敏度低、线性范围窄和检测周期长等缺点，一些情况下无法及时有效的帮助医生判断病人的情况，尤其是危重病人，因此限制了该类产品的使用范围。

在POCT检测方面，胶体金免疫层析法作为POCT检验的一种方法，具有上样量少、简便快速的优点，适用于床旁检验。但由于该法的灵敏度差，进一步限制了其在降钙素原临床检测上的应用。

时间分辨荧光免疫测定作为目前市场上较为流行的一种POCT检测方法，拥有作为POCT检验技术的基本优点。但由于为人工操作，因此操作误差大，精密度偏差较高，灵敏度和线性范围不能同时保证，检测结果易受外界环境影响。

目前，市面上虽然存在检测降钙素原的试剂盒，但其中很多试剂盒存在着线性范围不宽、灵敏度不足、成本过高等缺点。例如，CN101029897A标记物过多，反应过程较复杂；CN107367620A试剂反应体系较为复杂，高通量测试较难实现。与此同时，对于校准品，在提高稳定性、降低基质效应等方面还有改善空间。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于，提供一种降钙素原检测试剂盒，该试剂盒包括存储稳定性高的校准品，该试剂盒基质效应低且能够快速的得到检测结果。

本发明的另一目的在于，提供一种前述降钙素原检测试剂盒的制备方法。

本发明的另一目的在于，提供一种前述钙素原检测试剂盒的用途。

具体来说，本发明记载了如下技术方案。

【1】一种降钙素原检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一株抗体、标记有示踪标记物的第二株抗体和校准品；所述第一株抗体和所述第二株抗体所识别的降钙素原的特异性结合位点不同；所述校准品包括降钙素原抗原A和稀释液，所述降钙素原抗原A为如SEQ ID NO:1所示的序列，所述稀释液包括缓冲液和蛋白稳定剂。

【2】根据【1】所述的降钙素原检测试剂盒，其中，所述缓冲液选自浓度为0.03～0.06M的HEPES缓冲液，所述蛋白稳定剂选自牛血清蛋白。

【3】根据【1】或【2】所述的降钙素原检测试剂盒，其中，所述第一株抗体为如SEQ IDNO:4所示的序列，所述第二株抗体为如SEQ ID NO:8所示的序列。

【4】根据【1】-【3】任一项技术方案所述的降钙素原检测试剂盒，其中，所述磁性微球和第一株抗体的质量比为100:1.5～2.5。

【5】根据【1】-【4】任一项技术方案所述的降钙素原检测试剂盒，其中，所述示踪标记物和第二株抗体的摩尔比不小于15:1。

【6】根据【1】-【5】任一项技术方案所述的降钙素原检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括磁珠清洗液和底物液A和底物液B，优选地，所述磁性微球清洗液含有PBST缓冲液，所述底物液A为H

【7】根据【1】-【6】任一项技术方案所述的降钙素原检测试剂盒，其中，所述示踪标记物选自由鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯和金刚烷所组成的组中的一种或多种；优选的，所述示踪标记物为吖啶酯。

【8】根据【1】-【7】任一项技术方案所述的降钙素原检测试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：

磁性微球包被步骤：将所述第一株抗体包被于所述磁性微球上；

示踪标记物标记步骤：将所述示踪标记物标记于所述第二株抗体上；

配制校准品步骤。

【9】根据【8】所述的制备方法，其中，在所述磁珠微球包被步骤中第一株抗体和磁性微球的偶联时间为1～1.5小时。

【10】根据【1】-【7】任一项技术方案所述的降钙素原检测试剂盒在制备用于诊断感染性疾病的试剂中的应用。

使用本发明的试剂盒，能够以极高的灵敏度快速检测出样本的降钙素原的浓度。本发明提供的校准品存储稳定性好，基质效应低。配合本申请人化学发光免疫分析仪，可以实现全自动、快速、灵敏、定量检测样本的PCT的浓度。本发明所述试剂采用一步反应，反应时间仅需6min，加样，清洗，检测等时间约需3.5min，出报告时间可以控制在10min以内。使用本发明的试剂盒能够用于尽早准确的诊断出感染的严重程度，并为感染的治疗提供充足的时间，以及对感染患者的预后检测提供充分的支持。

在另一个实施方式中，本试剂操作简单，可通过设备进行批量试验，通量足以满足大多数用户需求。

在另一个实施方式中，本发明提供的降钙原素检测试剂盒能够在节约成本的同时，降低了非特异性结合，提高了检测灵敏度和检测稳定性。此外，本发明具有相对宽的线性范围，检测上限可达100ng/mL。在5000ng/mL的高浓度下，抗HOOK能力依旧能够满足使用要求。这表明即使当患者体内的PCT抗原含量极高时，也不会出现误诊的可能。

附图说明

图1示出了本发明实施例二的四组抗体配组符合率曲线图；

图2示出了本发明实施例十的八点线性相关图；

图3示出了本发明实施例十的61例罗氏样本样本符合率图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

需要说明的是：

本说明书中，术语“磁性微球”与“磁珠”具有相同的含义，是指具有细小粒径的超顺磁微球，一般具有超强的顺磁性。其表面可包被上特异性抗体、受体等，用于分离纯化样品中的靶体。磁珠已被广泛应用于免疫分析、核酸分离提取、细胞分选、酶的固定等多个领域。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

在描述本发明的上下文中(尤其在所附权利要求的上下文中)，术语“一个”、“一种”和“该(所述，the)”和类似的语言将被解释为覆盖单数和复数，除非本文另外指示或与上下文明显矛盾。

本说明书中，使用“数值A～数值B”或“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含一系列步骤或单元的过程、方法或系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

<第一方面>

本发明提供了一种降钙素原(PCT)检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被于磁性微球的第一株抗体、标记有示踪标记物的第二株抗体和校准品；所述第一株抗体和所述第二株抗体所识别的降钙素原的特异性结合位点不同；所述校准品包括降钙素原抗原A和稀释液，所述降钙素原抗原A为如SEQ ID NO:1所示的序列，所述稀释液包括缓冲液和蛋白稳定剂。

本发明采用双抗体夹心法，该法主要是使用两株不同的特异性抗体，其中被标记于示踪标记物的抗体的结合位点与包被于磁性微球上的抗体结合位点不同。选择这些结合位点不仅有利于示踪物的标记或磁性微球的包被，也不会阻碍抗体与抗原结合形成夹心复合物，因此，提高了反应的特异性和灵敏度。

在本发明的一些具体实施方式中，本发明中的第一株抗体和第二株抗体均为抗PCT的单克隆抗体。在一个技术方案中，为了提高检测样品的信号值和检测样本的符合率，优选地，本发明所述第一株抗体所识别的降钙素原的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:4所示的序列，所述第二株抗体所识别的降钙素原的氨基酸位点的序列为如SEQ ID NO:8所示的序列。

本发明对于适用于本发明的示踪标记物的种类不作特定限定。举例而言，所述示踪标记物可以是鲁米诺、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯和金刚烷等。作为优选，所述示踪标记物为吖啶酯，相对而言将其应用于化学发光检测背景发光低、信噪比高、光释放快速集中、发光效率高、发光强度大，易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少，标记物稳定(在2-8℃下可保存数月之久)，另外吖啶酯在水中溶解性好，稳定且不易水解。

本发明对于适用于本发明的磁性微球的种类不作特定限定，可以是本领域常用的磁珠。作为本发明实施方式之一，本发明所使用的磁珠为纳米级Fe

本发明所使用的磁珠粒径应在1-5μm，作为本发明实施方案之一，上述磁珠可以通过表面改性而添加多个活性基团，本发明中的活性基团的种类包括但不限于-OH和-COOH。

在本发明的一些具体实施方式中，为了提高检测样品信号，所述磁性微球和第一株抗体的质量比为100:1.5～2.5，为了操作的稳定性和便捷性，进一步优选的，所述磁性微球与第一株抗体的质量比为100:1.8～2.2。在本发明的另一些具体实施方式中，所述示踪标记物和第二株抗体的摩尔比不小于15:1，如果低于15:1该值时会影响检测信号。

在本发明的一些具体实施方案中，试剂盒使用时将第一株抗体包被磁性微球按磁性微球使用浓度稀释到0.03～0.08mg/mL，将示踪标记物标记第二株抗体稀释到0.5～2μg/mL，优选1μg/mL。

本发明的校准品包括降钙素原抗原A和稀释液。为了提高校准品的稳定性并进一步降低基质效应，本发明人对校准品所使用的抗原、稀释液和蛋白稳定剂进行了深入研究。目前降钙素原抗原(PCT抗原)包括PCT(全长)、NPCT、CT以及PCT(去除NPCT)等多个产品，不同厂家的降钙素原抗原氨基酸序列也各有不同。本发明人通过研究发现，在本发明中当采用具有SEQID NO：1所示的序列的降钙素原抗原A时可以获得很高的抗原结合效价。在相同的测试浓度下，使用降钙素原抗原A相比于其他降钙素原抗原具有更高的信号。

本发明校准品的稀释液包括缓冲液和蛋白稳定剂。本发明的缓冲液选自浓度为0.03～0.06M的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(HEPES)，优选的，所述HEPES缓冲体系的pH值为8.0。相比较与其他的缓冲体系，例如磷酸缓冲盐溶液(PBS)或三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液(Tris-HCl)，使用HEPES作为缓冲液的体系加速破坏七天发光值下降幅度小，校准品稳定性高。本发明采用的蛋白稳定剂选自牛血清蛋白(BSA)，牛血清白蛋白具有低温保护剂和脱水保护剂的作用，能够对PCT抗原起到很好的保护作用。进一步优选地，BSA占缓冲液的质量百分数为2～3wt％，有助于进一步提高稳定性。在本发明的另一些实施方案中，牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为2.5％时，能够最大程度地提高PCT冻干校准品的稳定性。本发明的校准品包括低点校准品和高点校准品，低点校准品是指将PCT工作液使用含2～3wt％牛血清蛋白的HEPES溶液稀释至300pg/mL得到的标准品溶液后冻干，高点校准品是指将PCT工作液使用含2～3wt％牛血清蛋白的HEPES溶液稀释至25000pg/mL得到的标准品溶液后冻干。

在本发明中，所述试剂盒还包括：磁性微球清洗液、底物液A和底物液B。

本发明中的磁性微球清洗液为磷酸盐吐温缓冲液(PBST)；优选的，所述磁性微球清洗液中还包括防腐剂。本发明所适用的防腐剂可以是本领域常用的防腐剂，例如山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、叠氮钠、proclin-300(主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3酮)和抗生素中的一种或多种。

本发明中所述底物液A为H

<第二方面>

本发明还提供了一种根据<第一方面>所述的降钙素原PCT检测试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：

磁性微球包被步骤：将所述第一株抗体包被于所述磁性微球上；

示踪标记物标记步骤：将所述示踪标记物标记于所述第二株抗体上；

配制校准品步骤。

作为本发明的实施方案之一，在所述磁珠微球包被步骤中第一株抗体和磁性微球的偶联时间为1～1.5小时。

作为本发明的实施方案之一，在第一株抗体包被磁性微球步骤中使用2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。

作为本发明的实施方案之一，在第一株抗体包被磁性微球步骤中还使用封闭液，所述封闭液为含酪蛋白(casein)的磷酸盐缓冲液(PBS)。封闭试剂的浓度范围优选0.01～0.05M，封闭试剂的用量为100～300μL。

作为本发明的实施方案之一，示踪标记物标记步骤中使用的抗体偶联缓冲液选自HEPES缓冲液或碳酸盐缓冲液(CB)，在本发明的一个具体实施方式中，选自CB缓冲液(pH＝9.2)。

作为本发明的实施方案之一，示踪标记物标记第二株抗体的标记时间(即室温避光反应的时间)为1.5～3小时；可选的，所述第二株抗体标记示踪标记物的标记时间为2小时。

作为本发明的实施方案之一，配制校准品的步骤包括取含有本发明所述降钙素原抗原A的工作液，使用含2～3％牛血清白蛋白的HEPES溶液稀释得到高、低点标准品溶液后冻干。

<第三方面>

本发明还提供了一种根据<第一方面>所述的降钙素原检测试剂盒在制备用于诊断感染性疾病的试剂中的应用。

感染性疾病具有高发生率，随着病情发展会导致病原菌扩散，并引发患者出现各种相关的临床症状，若不及时对症治疗则会影响患者的预后。细菌和病毒是导致感染性疾病发生的主要病原菌。一般而言，感染性疾病患者的降钙素原水平波动会十分异常。在正常的机体内部，含有的降钙素原相对较低，但是若发生内部炎症情况则会导致降钙素原水平上升，因此，降钙素原能够有效反映出感染性疾病的病症程度，可以作为临床检测指标进行监测。降钙素原尤其对细菌感染性疾病有十分优良的诊断特异性。

本发明的降钙素原检测试剂盒与适配的全自动化学发光分析仪(曜旋风系列)配套使用能快速有效检测待测样本中降钙素原水平，有助于临床判断患者是否存在感染性疾病。

本发明的待测样本为直接获得血清、血浆和全血，也可以是通过抽取人体血样进行分离得到的样本。

具体检测过程包括：将试剂盒中第一株抗体包被磁性微球和示踪标记物标记第二株抗体分别进行稀释，在本发明的一些具体实施方式中，第一株抗体包被磁性微球按磁性微球使用浓度稀释到0.03～0.08mg/mL，将示踪标记物标记第二株抗体稀释到0.5～2μg/mL；在反应杯中依次加入稀释后的试剂以及待测样本或/和校准品，整个加样过程约0.5分钟；将反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6分钟；之后将反应杯置于磁性条件下，使用磁性微球清洗液清洗三次，整个过程需要2分钟；向反应杯中加入化学发光激发液并检测光子值；根据反应杯中检测的光强度，仪器自动计算待测样本中PCT的浓度，检验计算过程需要1分钟。由此可见，使用本发明提供的试剂盒在10分钟即可得到检测结果。

在本发明中第一株抗体包被磁性微球、吖啶酯标记抗体以及待测抗原在反应杯充分混匀后可获得磁性微球(即磁微粒)-抗体-抗原-吖啶酯复合物。之后经过清洗、加入化学发光激发液，检测光信号强度，从而获得样本中的PCT浓度。

使用本发明提供的试剂盒能够以极高的灵敏度检测样本的PCT浓度，本发明检测限不高于10pg/mL，天内精密度可保持在5％以内，这对感染诊断的判别具有极大的意义。线性相关度R>0.990，检测回收率应在85％～115％以内，准确度良好，与罗氏PCT试剂盒有较好的相关性。本发明具有宽的线性范围，检测上限可达100ng/mL。钩状效应即HOOK效应，是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，而本发明在5000ng/mL的高浓度下，抗HOOK能力依旧能够满足使用要求。

使用本发明提供的试剂盒检测样本中的PCT浓度，总检测时间短，仅需约10分钟即可得到检测结果，可以实现全自动、快速检测样本的PCT的浓度，便于尽早准确的诊断出感染性疾病。

实施例

实施例一

本实施例提供了一种PCT检测试剂盒的制备方法和人血液中降钙素原检测方法。

制备1：第一株抗体包被磁性微球

(1)量取10mg磁性微球(平均粒径1.5μm，采购于Bangs Laboratories公司，固含量2.54％)，并混悬于1mL 0.1M的MES缓冲液中，磁铁吸附5～10min后，弃去上清后，重复上述清洗步骤3～5次，加入1mL上述缓冲液(0.1M MES缓冲液)，涡旋混匀。

(2)加入200μg第一株PCT单克隆抗体(第一株抗体所识别的降钙素原的氨基酸位点为21-40，即序列为如SEQ ID NO:4所示的序列)，使磁性微球与抗体的质量比为50:1，涡旋混匀，37℃孵育1h。

(3)加入10μL 10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐(EDC)，涡旋混匀，37℃孵育1.5h。

(4)取200μL含1％casein的PBS溶液(0.02M)进行封闭，封闭2h。

(5)向封闭后的磁珠混悬液中添加1mL发光恢复液1(5g的牛血清白蛋白+400mL的0.025M的Tris-HCl缓冲液溶解+0.1-2‰的Tween-80+100mL新生牛血清)，磁铁吸附，去上清后，重复上述清洗步骤3～5次。

(6)将上述制备好的磁珠置于1mL的发光恢复液1中，2～8℃保存。

制备2：标记吖啶酯的PCT单抗溶液的制备

(1)将1mg第二株PCT单克隆抗体(第二株抗体所识别的降钙素原的氨基酸位点为102-111,即序列为如SEQ ID NO:8所示的序列)置于透析袋中，使用不少于2L的0.05M CB缓冲液(pH＝9.2)透析24h，中途换液四次。透析完成后将抗体加入Millipore Amicon Ultra超滤离心管进行浓缩，使抗体浓度大于5mg/mL。

(2)将经过浓缩的PCT单克隆抗体置于0.5mL的离心管内，加入100μL溶于DMF的5mg/mL吖啶酯酸-NHS酯溶液(NSP-SA-NHS)，使NSP-SA-NHS与PCT单克隆抗体摩尔比不小于15:1，混匀后，室温避光反应2h，加入100μL浓度为100mg/mL赖氨酸溶液，反应30min，终止反应。

(3)将标记物置于透析袋中，用不少于2L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.01mol/L，pH＝4.5)透析24h，中间换液四次，分离游离的NSP-SA-NHS。

(4)收集透析过后的标记物，加入5％BSA溶液使BSA终浓度为1％，然后等体积加入甘油，-20℃保存。

制备3：校准品的制备

取PCT工作液(具有SEQ ID NO：1所示的序列的降钙素原抗原A)，使用含2.5％牛血清白蛋白的0.05M HEPES溶液稀释至300pg/mL和25000pg/mL的高低点标准品溶液后冻干。

使用制备1中的制备得到的包被有第二株抗PCT的抗体的磁性微球混悬液，制备2中标记有吖啶酯的第一株PCT抗体，制备3高低点校准品分别构成试剂盒的组分。

制备4：化学发光底物液的配制

化学发光预底物液A为H

化学发光预底物液B为Triton X-100和NaOH的混合液，其中TritonX-100的质量分数为0.01-2.0％，NaOH的浓度为0.05-1mol/L。

制备5：清洗液的配制

本发明所述清洗液为pH值7.0-9.0、浓度为0.02mol/L的PBST溶液，其中含质量分数为0.5％的Tween-20。

使用制备1中得到的第一株抗体包被磁性微球，制备2得到的第二株抗体标记吖啶酯，制备3的高低点校准品、制备4的化学发光底物液和制备5的磁性微球清洗液制备降钙素原检测试剂盒。

使用该试剂盒与全自动化学发光分析仪，检测样本中的PCT浓度。

具体的，按照如下步骤使用全自动化学发光分析仪器测量待测样本中的PCT浓度：

1.将制备1中制备的第一株抗体包被磁性微球按磁性微球使用浓度稀释到0.05mg/mL(试剂1)，将制备2制备的吖啶酯标记第二株抗体稀释到1μg/mL(试剂2)；

2.反应杯中依次加入50μL的试剂1和50μL的试剂2；

3.将50μL的待测样本或/和校准品加入反应杯中，整个加样过程需要0.5分钟；

4.反应杯中溶液充分混匀后，37℃温育6分钟；

5.置于磁性条件下，使用磁性微球清洗液清洗三次，整个过程需要2分钟；

6.向反应杯中加入100μL的化学发光激发液A后，再加入100μL的化学发光激发液B，并立即检测光子值；

7.根据反应杯中检测的光强度，仪器自动计算待测样本中PCT的浓度，整个检验，计算过程需要1分钟。

实施例二

PCT检测试剂盒中使用的抗体的配组筛选

本实施例制备1和制备2过程中PCT单克隆抗体有四种：体1识别氨基酸位点为21-40(序列为如SEQ ID NO:4所示的序列)，抗体2识别氨基酸位点为60-69(序列为如SEQ IDNO:5所示的序列)，抗体3识别氨基酸位点为72-81(序列为如SEQ ID NO:6所示的序列)，抗体4识别氨基酸位点为96-105(序列为如SEQ ID NO:7所示的序列)，抗体5识别氨基酸位点为102-111(序列为如SEQ ID NO:8所示的序列)。将抗体1包被于磁性微球上，形成抗体1-磁性微球混悬液，将抗体2、3、4、5分别标记于吖啶酯上，获得抗体2-吖啶酯、抗体3-吖啶酯、抗体4-吖啶酯、抗体5-吖啶酯。将以上抗体进行组合配对，获得配组1(磁性微球-抗体1和吖啶酯-抗体2)、配组2即实施例1(磁性微球-抗体1和吖啶酯-抗体3)和配组3(磁性微球-抗体1和吖啶酯-抗体4)，配组4(磁性微球-抗体1和吖啶酯-抗体5)。将制备得到的试剂盒配合全自动化学发光分析仪检测血清和EDTA血浆结果见表1、表2，图1，其中信号1、信号2、信号3、信号4指的是光强度。

表1试剂盒抗体配组筛选16例血浆样本结果

表2试剂盒抗体配组血清血浆样本对比

表1和图1的结果显示，四个配组检测血清样本的符合率(R值)配组4最高，且整体信号值最高，故最终选定配组4。表2使用配组4检测14份同源样本，整体无太大偏差，故本发明试剂盒在制备过程中优选使用的抗体为配组4(磁性微球-抗体1和吖啶酯-抗体5)。

实施例三

本实施例提供了第一株抗体包被磁性微球的制备过程中第一株PCT单克隆抗体和磁性微球偶联时间的筛选过程。

实施例3采用与实施例1基本相同的制备1过程。与实施例1的制备1过程相比，实施例3主要改变制备1中步骤(2)的孵育时间。实施例3在制备1的步骤(2)中分别采用30min或1h或1.5h作为孵育时间。将实施例3中制备所得的三种第一株抗体包被磁性微球，分别和实施例1制备2所得的第二株抗体标记吖啶酯组合，获得三种试剂盒，再分别配合全自动化学发光分析仪进行检测，其检测结果见表3。

表3第一株PCT单克隆抗体和磁性微球偶联时间的筛选结果

由表3的结果显示，第一株PCT单克隆抗体和磁性微球的偶联时间除30min外，1h与1.5h的偶联结果较为接近。因而，在本发明试剂盒的第一株抗体包被磁性微球的制备过程中，可选择1h和1.5h，但为了保留一定的误差控制空间，优选的偶联时间为1h。

实施例四

本实施例提供了第一株抗体包被磁性微球制备过程中抗体包被比例的筛选过程。

实施例4采用与实施例1基本相同的制备1过程。与实施例1的制备1过程相比，实施例4主要改变制备1中步骤(2)的磁性微球与抗体的质量比。实施例4在制备1的步骤(2)中分别采用100：2、100：1.5或100：1，作为磁性微球与抗体的质量比。将实施例4中制备所得的三种第一株抗体包被磁性微球，分别和实施例1制备2所得的第二株抗体标记吖啶酯组合，获得三种试剂盒，再分别配合全自动化学发光分析仪进行检测，其检测结果见表4。

表4磁性微球与第一株抗体的质量比的筛选结果

由表4的结果显示，筛选磁性微球与抗体的质量比时，100：1.5和100:2的比例检测校准品信号较高，结果较为接近。当质量比低于100：1.5时，信号明显降低。为了操作的稳定性和简便性，以及保留一定的误差控制空间，本发明试剂盒在制备过程中优选的磁性微球与抗体的质量比为100：2。

实施例五

本实施例提供了第二株抗体标记吖啶酯制备过程中缓冲液的筛选过程。

实施例5采用与实施例1基本相同的制备2过程。与实施例1的制备2过程相比，实施例5主要改变制备2的步骤(1)的缓冲液种类。实施例5在制备2的步骤(1)中分别采用0.05MCB缓冲液(pH＝9.2)，0.05M CB缓冲液(pH＝9.6)或0.05M HEPES缓冲液(pH＝8.0)，0.05MHEPES缓冲液(pH＝8.5)。将实施例5中制备所得的四种第二株抗体标记吖啶酯，分别和实施例1制备1所得的第一株抗体包被磁性微球组合，获得四种试剂盒，对校准品进行检测，其检测结果见表5。

表5第二株抗体标记吖啶酯制备过程中缓冲液的筛选结果(校准品)

由表5的结果显示，使用HEPES稀释液或使用CB稀释液作为缓冲液(pH8.0～9.6)时，四组检测结果并无太大差异，为了保留一定的误差控制空间，故选择CB(pH＝9.2)。故本发明试剂盒在制备吖啶酯标记抗体过程中优选的缓冲液为0.05M CB缓冲液(pH＝9.2)。

实施例六

本实施例提供了校准品制备过程中PCT抗原的筛选过程。

实施例6采用加入1％牛血清白蛋白的0.01M PBS溶液，按相同的比例，分别将三种不同的PCT抗原——PCT抗原A(序列为如SEQ ID NO:1所示的序列)，PCT抗原B(序列为如SEQID NO:2所示的序列)，PCT抗原C(序列为如SEQ ID NO:3所示的序列)稀释为不同浓度的抗原稀释液。其余同实施例1。检测结果见表6。

表6不同来源PCT抗原效价对比

由表6结果可知，抗原A的效价远远高于其他两组，因此本试剂盒校准品的配制优选的使用抗原A。

实施例七

本实施例提供了校准品稀释液制备过程中缓冲液的筛选过程。

实施例7采用常规缓冲液0.02M PBS(pH＝7.1)，0.05M HEPES(PH＝8.0)，0.05MTris-HCl(pH＝9.0)作为稀释液，分别将PCT抗原A稀释释为不同浓度的抗原稀释液，进行37℃破坏七天对比试验。检测结果见表7。

表7不同缓冲体系下抗原稳定性对比

由表7结果可知，在不加入任何蛋白、糖类的情况下，抗原使用0.05MHEPES后加速破坏七天，发光值下降幅度最小，因此本试剂盒优选使用0.05M HEPES作为抗原稀释液。

实施例八

本实施例提供了校准品稀释液制备过程中蛋白稳定剂的筛选过程。

实施例8采用0.05M HEPES缓冲液，分别向缓冲体系中加入2.5％的牛血清白蛋白(BSA)，20％的新生牛血清，2.5％的酪蛋白，按相同的比例，将PCT抗原稀释液释为不同浓度的抗原稀释液，进行37℃破坏七天对比试验。检测结果见表8。

由表8结果显示，使用牛血清蛋白作为蛋白稳定剂，稳定性整体优于其他两组，破坏七天，发光值下降幅度小，因此本试剂盒优选的使用牛血清蛋白作为抗原稀释液的蛋白稳定剂。

表8加入不同蛋白稳定剂后抗原加速稳定性表现

实施例九

本实施例提供了本试剂盒抗HOOK能力的评价结果。实施例9采用校准品稀释液(0.05M HEPES+2.5％BSA)，将抗原按照5000，3000，2000，1000，500ng/mL的浓度，配制五个高浓度点，按照100，50，10，1，0.1ng/mL的浓度，配制校准品。其余同实施例1，其检测结果见表9。

表9抗HOOK能力检测结果

由表9结果可知，当抗原浓度高值5000ng/mL时，检测结果发光值依旧高于线性上限，说明本试剂盒抗HOOK能力满足使用要求。

实施例十

本发明检测试剂盒的性能测试

(1)检测限的检测

检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1588-2018《降钙素原测定试剂盒》的试验方法进行测试，检测结果见表10-12。

表10初始校准曲线的检测结果

表11空白限的检测结果

表12低值样本检测结果

空白限测试：以空白(零值企业校准品)作样品对试剂盒进行测试，重复测试20次，计算空白响应量的均值X1和空白响应量标准差(SD)，X1(空白响应量的均值)+2SD(空白响应量标准差)即为空白限。

使用企业校准品稀释5份浓度近似检出限(0.02ng/mL)的低值样本进行检测，每份样本检测5次，检测结果按照大小进行排序，结果应符合以下要求：

小于检测限(0.02g/mL)的检测结果数量应小于或等于三个。根据20孔空白样本(S0)检测获得的Mean+2SD，然后使用企业校准品稀释5份浓度近似检出限(0.02ng/mL)的低值样本进行检测，每份样本检测5次，检测所得结果无一大于空白限结果，证明本产品检测限不高于10pg/mL，这对于感染诊断的判别具有极大的意义。

(2)天内精密度的检测

重复检测高、低标准品各10次，根据检测结果计算CV，结果见表13。

表13天内精密度的检测结果

本发明的天内精密度可保持在5％以内，这对于感染的诊断准确性具有极大的意义。

(3)线性相关性的检测

检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1588-2018《降钙素原测定试剂盒》的试验方法进行测试。

用接近线性范围上限(100ng/mL)的高浓度样品和接近线性范围下限(0.02ng/mL)的低浓度的样品，按照一定的比例混合不少于5个浓度，每个浓度至少重复测试2次，分别求出检测结果的均值(yi)。将测定浓度的平均值和理论浓度或稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性回归的相关系数γ，相关系数γ≥0.990。结果见表14及图2。

本发明的线性相关性R>0.990。其中，理论浓度为高低样本浓度值计算浓度，而实测值为利用校准曲线计算所得浓度。图2表明线性相关性良好。

表14线性相关性的检测结果

(4)准确度的检测

检测方法参考国家食品药品监督管理总局发布的YY/T 1588-2018《降钙素原测定试剂盒》的试验方法进行测试。

将已知浓度的高水平待测物(A)加入到低浓度的血清(或其它体液成分)B中，所加待测物A与血清(或其它体液成分)B之间的体积比例为不大于1:9，各重复检测3次，取平均值，根据公式：

计算出回收率(式中：R-回收率；C-向B液中加入A液后的检测浓度平均值；V

表15回收率检测结果

检测回收率结果在85％～115％以内，准确度良好。

(5)方法学比对

使用罗氏诊断生产的降钙素原检测试剂盒(电化学发光法)检测部分血清或血浆样本后，使用本发明的试剂盒检测上述样本，检测结果见图3，表16。使用本发明的试剂盒检测61例罗氏样本，将罗氏试剂盒检测的浓度值(ng/mL)与本发明试剂盒的检测浓度值做散点图，发现符合率较好，整体符合率R值可达0.9943。可见，本发明的试剂盒与国内外公认的罗氏PCT试剂盒有较好的相关性，能较为准确地从健康人群中筛查出患病个体。

表16罗氏测值符合率

本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 上海奥普生物医药有限公司

<120> 一种降钙素原检测试剂盒、制备方法及用途

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr

1 5 10 15

Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp

20 25 30

Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu

35 40 45

Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser

50 55 60

Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr

65 70 75 80

Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp

85 90 95

Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro

100 105 110

Gln Asn Ala Asn

115

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met His His His His His His Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser

1 5 10 15

Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu

20 25 30

Leu Ala Ala Leu Val Gln Asn Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu

35 40 45

Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser

50 55 60

Lys Arg Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln

65 70 75 80

Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly

85 90 95

Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His

100 105 110

Arg Pro His Val Ser Met Pro Gln Asn Ala Asn

115 120

<210> 3

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Pro Ala Asp Pro Ala Thr Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Leu Val Gln Asp Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu

20 25 30

Gln Glu Gln Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys

35 40 45

Arg Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp

50 55 60

Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala

65 70 75 80

Pro Gly Lys Lys Arg Asp Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg

85 90 95

Pro His Val Ser Met Pro Gln Asn Ala Asn

100 105

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp Tyr Val Gln Met

1 5 10 15

Lys Ala Ser Glu

20

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His

1 5 10

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met

1 5 10