个性化基因修饰肿瘤DC疫苗的制备方法

文献发布时间：2023-06-19 11:30:53

技术领域

本发明涉及一种肿瘤DC疫苗及其制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

癌症是全球第二大死亡原因。在全球范围内，每6例死亡中就有1例死于癌症。对于早期没有扩散到淋巴结和没有转移的癌症，手术切除是一种非常有效的治疗方法。然而，对于更严重的病例，使用标准的、非特异性的癌症治疗，比如化疗和放疗，会对体内的健康细胞产生影响并形成毒性。由于癌症的分子异质性，通常只有不到25%的接受治疗的个体从批准的治疗中获益。

目前以DC为基础的肿瘤疫苗策略，主要有5种。一是通过肿瘤细胞或肿瘤细胞提取物冲击DC，得到肿瘤DC疫苗，如CN102793912A、CN104815323A。二是利用肿瘤抗原肽冲击DC，得到肿瘤DC疫苗。三是利用水溶性蛋白质作为抗原冲击DC，得到肿瘤DC疫苗。四是采用肿瘤抗原DNA/RNA负载到DC细胞中，得到肿瘤DC疫苗，如CN107583042A、CN102153658A。五是利用肿瘤抗原在体内冲击DC，得到肿瘤DC疫苗。由于每个患者肿瘤的特异性抗原尚未明确且易发生抗原位点变异,另外肿瘤细胞株在体外传代过程中表面抗原可能发生改变,DC细胞不能将该肿瘤的所有抗原有效呈递给效应T细胞,从而限制了效应T细胞在体内的抗肿瘤效应。

目前肿瘤抗原DNA/RNA冲击DC，主要利用的是肿瘤中已经公开的相关抗原，而没有针对每个患者的肿瘤特异性。基于患者个性化治疗的个体化药物被认为是解决药物研发创新低疗效、高成本的潜在解决方案。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种高效的个体化肿瘤DC疫苗，实现以下发明目的：

制备针对患者肿瘤的个体化特异性疫苗，与免疫细胞共培养后，IFN-γ的释放量、CD8

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

个性化基因修饰肿瘤DC疫苗的制备方法，所述制备方法，包括筛选肿瘤患者的抗原位点；所述筛选肿瘤患者的抗原位点，包括全基因的突变位点的筛选和肿瘤标志物基因抗原表位的筛选；将全基因的突变位点的筛选得到的突变多肽、肿瘤标志物基因抗原表位的筛选得到的肿瘤抗原表位进行连接，得到突变肽，在突变肽的N端连接MHC I类信号分子，在C端连接MHC I类转运信号MITD，MITD通过T2A与增强型细胞因子GM-CSF连接，得到重组抗原肽片段；将全基因的突变位点的筛选得到的突变多肽、肿瘤标志物基因抗原表位的筛选得到的肿瘤抗原表位进行连接时，肿瘤抗原表位在前，突变多肽在后进行连接。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述全基因的突变位点的筛选，穿刺抽取癌症患者的组织，进行全基因测序，根据全基因测序结果筛选出与该癌症患者所患癌相关联的错义突变的突变位点，查询各突变位点的上下游序列，得到突变多肽；

所述突变多肽的长度为25-35个氨基酸，突变位点位于其对应的突变多肽的氨基酸序列的1/3到2/3处。

所述肿瘤标志物基因抗原表位的筛选，对该癌症患者自身携带的其所患癌的肿瘤标志物基因对应的氨基酸序列，与病人的HLAI、HLAII进行匹配，根据匹配结果，选择%Rank值小于0.5且BindLevel为SW的肽段，筛选得到的肽段，如果有氨基酸重合的，将重合的肽段整合成一个肽段，如有相邻的两个肽段，间隔10个氨基酸以内，则将相邻的这两个肽段和中间间隔的氨基酸一起整合成一个肽段，得到肿瘤抗原表位。

所述肿瘤标志物基因对应的氨基酸序列，与病人的HLAI、HLAII进行匹配，使用的软件为NetMHCpan、SYFPEITHI或免疫表位数据库。

所述DC疫苗的制备方法还包括重组表达载体的构建、腺相关病毒的包装、肿瘤DC疫苗制备；

所述重组表达载体的构建，将表达重组抗原肽片段的目的基因序列与载体连接，得到重组表达载体；

所述腺相关病毒的包装，将重组表达载体转染HEK293细胞，转染后使细胞充分裂解，得到腺相关病毒；

所述肿瘤DC疫苗制备，将腺相关病毒感染imDC，得到肿瘤DC疫苗。

本发明基于对病人特定的癌症突变的识别。具体地说，本发明涉及基于个体化免疫治疗方法的基因组，优选外显子组或转录组测序，旨在免疫治疗地靶向癌症中的多个个体突变。使用下一代测序(NGS)可以快速和经济有效地识别患者特定的癌症突变。

本发明涉及提供在癌症患者中诱导有效和特异性免疫反应的个体化重组癌症疫苗并潜在靶向原发肿瘤和肿瘤转移的有效方法。所述疫苗能够诱导或促进毒性T细胞活性，针对以呈现具有I类和II类MHC的一个或多个癌症表达抗原为特征的癌症疾病。

本发明中的突变肽来自于患者中能够被肿瘤特异性CTL系识别的抗原表位，用于制备肿瘤疫苗。这种疫苗代表了一种免疫原性成分，可用于癌症患者，从而诱导CTL特异性识别肿瘤细胞表达的突变序列，并导致癌细胞死亡。因此，该疫苗组合物包括由本发明所述方法识别的肿瘤特异性新抗原所对应的突变多肽。

本发明中DC疫苗包含至少一个突变肽序列，优选包含多个突变肽序列，如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多，突变肽抗原能够在疫苗制备中被选中，是由于它们能够与接受疫苗的肿瘤患者表达的MHC抗原结合。这些多肽能够被肿瘤特异性的CTL系识别或可以诱导肿瘤特异性的CTL系。

在本发明中，编码各种突变肽序列的载体还可以编码所包含的一种蛋白质以增强免疫原性。例如有益增强免疫反应的蛋白质或多肽，包括细胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)，细胞因子诱导分子或共刺激分子。为了提高抗原呈递效率，在N端将MHC I类信号分子与免疫原性抗原连接，并将MHC I类转运信号（MITD，MHC I类跨膜和胞浆结构域）粘附在免疫原性抗原的C端。

上述技术方案取得以下有益效果：

本发明提供了一种高效的个性化肿瘤DC疫苗，与免疫细胞共培养后，IFN-γ的释放量、CD8

附图说明

图1为本发明实施例1所述三种突变肽的设计结构；

其中1a为EC-MAGE的设计结构；

1b为EC-LMJ的设计结构；

1c为EC-13的设计结构；

图2为本发明基因序列的设计结构；

图3为双酶切验证质粒的电泳图；

图4为pAAV-EC-LMJ感染DC细胞的免疫荧光图；

图5为流式细胞术检测DC细胞标志物的流式图；

其中5a为流式细胞术检测DC细胞标志物CD80的流式图；

5b为流式细胞术检测DC细胞标志物CD83的流式图；

5c为流式细胞术检测DC细胞标志物CD86的流式图；

图6为pAAV-EC-LMJ感染DC细胞后GFP的表达率的流式图；

图7为免疫细胞中CD8

图8为免疫细胞中CD4

具体实施方式

实施例1 筛选食道癌患者的抗原位点

以食道癌患者为例，穿刺抽取组织，送到华大基因利用二代测序方法进行全基因测序，部分突变位点如下表1所示。碱基的突变不一定会导致氨基酸的突变，根据全基因测序结果筛选出与食道癌相关联的错义突变的5个突变位点，在NCBI上查询上下游序列，选择25-35个氨基酸，使其突变位点位于氨基酸序列的1/3到2/3处。本发明中，选择的突变多肽为RYR2、ERCC1、UGT1A1、UMPS、NQ01。其中RYR2的突变位点位于该基因氨基酸序列的1/2（31个氨基酸第16位）处，ERCC1的突变位点位于该基因氨基酸序列的13/29（29个氨基酸第13位）处，UGT1A1的突变位点位于该基因氨基酸序列的1/2（34个氨基酸第17位）处，UMPS的突变位点位于该基因氨基酸序列的9/17（34个氨基酸第18位）处，NQ01的突变位点位于该基因氨基酸序列的1/2（30个氨基酸第15位）处。

同时对食道癌的肿瘤标志物基因MAGE4对应的氨基酸序列利用NetMHCpan 4.1软件与病人的HLAI、HLAII进行匹配，根据匹配结果，选择%Rank值小于0.5且BindLevel为SW的肽段，这种肽段与MHC I型分子亲和力较强，筛选得到的肽段，如果有氨基酸重合的，将重合的肽段整合成一个肽段，如有相邻的两个肽段，间隔10个氨基酸以内，则将相邻的这两个肽段和中间间隔的氨基酸一起整合成一个肽段，一个肽段作为一个肿瘤新抗原表位。

本发明中，选择了4个不同的肿瘤新抗原表位，分别为MAGE4-1、MAGE4-2、MAGE4-3、MAGE4-4。

将筛选出的9个抗原肽利用常规的Linker连接，Linker的氨基酸序列为GGSGGGGSGG，如图1所示。

在突变肽的N端连接MHC I类信号分子，在C端连接MHC I类转运信号MITD。同时利用T2A与增强型细胞因子GM-CSF连接，如图2所示。本发明中的核苷酸全长序列为SEQ IDNO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.4，其基因序列命名为EC-LMJ，送到南京金斯瑞公司合成。

以肿瘤标志物基因MAGE4筛选出的4个抗原表位连接成的突变肽作为其中一种，命名为EC-MAGE，其核苷酸全长序列为SEQ ID NO.2，氨基酸序列为SEQ ID NO.5。根据检测的突变基因位点，可以选择13个抗原表位连接成的突变肽作为其中一种，是在EC-LMJ的基础上再添加CBR3、GSTP1、MTHFR、XRCC1四个抗原位点，命名为EC-13，其核苷酸全长序列为SEQID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.6，结构如图1所示，送到南京金斯瑞公司合成。

表1部分突变位点的检测结果

实施例2 重组表达载体的构建

以EC-LMJ序列为例，构建重组腺相关病毒载体，其余两种序列构建方法一样。将委托合成的EC-LMJ序列进行BamHI、EcoRI双酶切，获得具有粘性末端的目的片段。同时将载体pAAV-IRES（购自Agilent公司）进行BamHI、EcoRI双酶切，获得线性化载体片段，用T4连接酶连接目的片段和线性化载体片段，转化到E.coli(Top10)，经酶切验证后（见图3）和测序验证后，使用OMEGA公司的去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pAAV-EC-LMJ、pAAV-EC-MAGE、pAAV-EC-13。本发明中提取到的重组表达载体pAAV-EC-LMJ的浓度为1.02mg/mL、pAAV-EC-MAGE的浓度为0.85mg/mL、pAAV-EC-13的浓度为0.94mg/mL。

实施例3 腺相关病毒的包装及滴度测定

1）包装细胞系的复苏

本发明使用的包装细胞系为HEK293细胞。从液氮罐中取出冻存的HEK293细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到50mL离心管中，加入生理盐水清洗DMSO，混匀后离心，1500 rpm 5 min。去掉上清，加入5mL新鲜的高糖DMEM（含10% FBS）培养基重悬细胞，转入T75瓶中，每个瓶中补足到10mL高糖DMEM（含10% FBS）培养基。将培养瓶平稳放入37℃、5 %CO

2）腺相关病毒的包装及滴度测定

以pAAV-EC-LMJ为例，其余两种重组腺相关病毒的包装及滴度测定方法一样，不再重复。

当传代后HEK293细胞铺板达到80%-90%时，用于转染。

转染试剂的准备：在5mL离心管中，分别配制A管与B管试剂（Tube A and Tube B）

配好后，放置5min，然后将A管缓慢加入B管，混合均匀。室温放置20min，形成脂质体-DNA混合物。将混合物加入培养瓶中，轻微混匀。置于37℃，5%CO

实施例4 肿瘤DC疫苗制备

采集该食道癌患者外周静脉血50mL，加入50mL生理盐水进行稀释，在50mL离心管里先加入淋巴细胞分离液（购自天津灏阳生物科技有限公司，LTS10770125）20mL，然后缓慢加入25mL上述稀释后的血液，两者明显分层，900g离心25min。液面分为四层，从上到下依次为血浆、白细胞层、分离液层、红细胞层，吸取中间的白细胞层，加入DC培养基。37℃，5% CO

取出制备好的pAAV-EC-LMJ病毒，以MOI＝100感染上述imDC，感染8-12h后，用PBS洗涤细胞2-3次，加入成熟因子TNF-α（终浓度为10ng/mL）继续培养诱导得到成熟的DC细胞（mDC），通过免疫荧光显微镜观察DC的感染情况（如图4）。流式细胞仪分析DC细胞成熟标志CD80、CD83、CD86的表达情况和腺相关病毒感染DC细胞的效率。如图5和6所示，本发明中，DC细胞CD80的表达率为75.1%，CD83的表达率为70.7%，CD86的表达率为70.3%，pAAV-EC-LMJ感染DC细胞后GFP的表达率为57.9%。

以相同方法制备其余两种肿瘤DC疫苗，其中pAAV-EC-MAGE感染DC细胞后GFP的表达率为63.5%，pAAV-EC-13感染DC细胞后GFP的表达率为50.8%。

实施例5 肿瘤DC疫苗对免疫细胞的活化及增殖影响

1）免疫细胞的培养

采集患者30mL外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用免疫细胞培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1500IU/mL的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/mL的OKT-3和5%的患者自体血浆诱导继续培养。

每隔三天倍比加液，培养至第6天，流式细胞术检测T细胞中的CD8

2）肿瘤DC疫苗与免疫细胞联合培养

实验分组为：

A组、免疫细胞

B组、免疫细胞+普通DC细胞

C组、免疫细胞+DC-EC-MAGE

D组、免疫细胞+DC-EC-LMJ

E组、免疫细胞+DC-EC-13

B-E实验组中免疫细胞和DC细胞的数量为10：1，将两种细胞在免疫细胞培养基（购自CORNING的KBM551淋巴细胞无血清培养基）中，37℃、5%CO

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 个性化基因修饰肿瘤DC疫苗的制备方法

<130> 2021

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1854

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

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