自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用
文献发布时间:2023-06-19 11:44:10
技术领域
本发明属于植物学和生物技术领域,具体涉及自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。
背景技术
水稻是世界上种植范围最为广泛也是最为重要的粮食作物之一,也是植物基因组学研究的模式生物之一,为全球超过30亿人口提供食物及能量。随着人口的日益增长,全球气候变化和环境胁迫等,培育高产优质水稻新品种显得尤为重要。水稻的籽粒大小是影响其产量和品质的最重要因素之一。发掘调控籽粒大小的新基因和分子机制,可为将来遗传改良水稻产量品质提供重要的理论基础。
细胞自噬是一种生物进化过程中高度保守的降解机制,主要是将细胞内的组分如受损的细胞器、变性或未折叠的蛋白等转运至液泡或溶酶体中进行降解,继而促使营养物质得以循环利用,达到协助植物在逆境中生存和生长发育的目的。已有的研究表明,细胞自噬广泛参与了植物各个方面的调控,包括花粉育性,水稻分蘖,氮利用和各种胁迫等。值得一提的是,目前尚未发现细胞自噬直接参与产量性状的调控,如籽粒大小。现在有关自噬的研究进展基本上是关于自噬基因的抗衰老、抗逆性和促进植物氮素循环的功能。但有关自噬基因ATG9对于水稻粒型的调控并未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供自噬基因ATG9的应用,特别是自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现:
自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用。
所述的自噬基因ATG9的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
所述的自噬基因ATG9的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述的水稻育种优选包括对水稻粒型改良的调控。
所述的调控为正调控。
所述的正调控是指在水稻中过表达自噬基因ATG9,促进水稻ATG9过表达植株株高和穗长显著提高,粒宽、粒长以及百粒重明显增加。自噬基因ATG9正调控了籽粒等水稻各组织的大小变化,因此,自噬基因ATG9过表达对增加籽粒大小具有重要意义,为水稻产量的提高提供了重要的基因资源。
所述的水稻优选为粳稻。
所述的粳稻优选为中花11。
与现有技术相比,本发明具有以下优点及有益效果:
(1)本发明利用PCR的方法从水稻中克隆出自噬基因ATG9(所对应基因座位号与Rice Genome Annotation Project中公布的LOC_Os10g07994相对应)。自噬基因ATG9对提高水稻产量和品质具有非凡的意义,可以作为水稻籽粒品质改良的新靶点。
(2)本发明通过CRISPR/Cas9敲除ATG9,获得atg9突变体植株。对atg9突变体植株的表型进行详细分析。结果表明,与野生型(WT)相比,atg9突变体植株的株高明显降低,穗长变短、籽粒变小以及百粒重减少。通过深入研究,构建了ATG9过表达植株,发现与WT相比,ATG9过表达植株株高和穗长显著提高,粒宽粒长以及百粒重亦明显增加,ATG9正调控了籽粒等水稻各组织的大小变化。
(3)本发明可以通过深入的研究探索ATG9基因的表达调控,结合基因编辑技术,有望创制优异的ATG9等位基因,如敲除该基因的沉默子进而提高其表达水平,最终产生与ATG9过表达类似的表型(籽粒变大,产量提高)。此外,还可以通过分子操作粒长基因和ATG9(如基因聚合),进一步培育超长粒高产优质水稻。鉴于以往研究,可能可以提高植株的抗逆性,提高水稻对环境的适应性,尤其是对不良环境的适应性。综上所述,我们认为ATG9基因是一个潜在的协同水稻产量和抗逆的候选新靶点。
附图说明
图1为ATG9的基因编辑:野生型(WT)和突变体(atg9)的序列分析图;其中,该序列分析图通过chromas软件查看比对,GAGTGGAAGCGCTCGAGTC代表靶位点,PAM代表crRNA互补序列邻近基序,箭头所指代表突变位点,箭头所指字体T代表插入碱基T。
图2为ATG9表型分析结果图;其中,图A从左到右,分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的株高结果图,标尺等于15cm;图B从左到右,分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的穗型结果图,标尺等于2cm;图C从上到下,分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的粒宽结果图,标尺等于0.5cm;图D从上到下,分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的粒长结果图,标尺等于0.5cm;图E从左到右,分别为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株的百粒重结果图,标尺等于1cm。
图3分别为WT、atg9和ATG9过表达表型数据统计结果图;其中,图A为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的株高结果图;图B为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的穗长结果图;图C为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的粒宽结果图;图D为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的粒长结果图;图E为野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达(OE)植株的百粒重结果图。图中数据为平均值±标准差,a、b、c分别代表互相具有显著性差异。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。实施例中所使用的实验方法如无说明,均为常规方法。
植物材料:本研究供试材料为粳稻背景(Oryza sativa L.)。野生型(WT)为中花11(ZH11)(公开使用的水稻品种,市售)。atg9突变体植株由本实验室联合中国水稻研究所王克剑课题组利用CRISPR/Cas9方法所创制(具体CRISPR/Cas9方法见参考文献Wang C,ShenL,Fu Y,et al.A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice[J].Journal of Genetics and Genomics,2015,42(12):703-706.)。ATG9过表达植株OE水稻由百格基因科技(江苏)有限公司构建。菌株和质粒:实验所用的菌株大肠杆菌DH5α购自广州春泥有限公司;植物过表达载体pRHVcGFP由中国农业科学院王国梁课题组提供(植物过表达载体pRHVcGFP在He F,Zhang F,Sun W,et al.A Versatile Vector Toolkit forFunctional Analysis of Rice Genes[J].Rice,2018,11(1):27.的补充数据中已公开);pC1300-Cas9和SK-gRNA载体由中国水稻研究所王克剑课题组提供(pC1300-Cas9载体和SK-gRNA载体已在申请号为:2015104855732,名称为:植物多基因敲除载体的构建及应用的发明专利中公开)。
化学试剂:限制性核酸内切酶KpnI、NotI、BamHI、BglII和T4DNA连接酶购自NewEngland Biolabs公司;限制性核酸内切酶AarI购自Ferment公司;高保真酶KOD FX购自TOYOBO公司;abm反转录试剂盒购自爱必梦生物科技有限公司;胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自济凡生物科技(北京)有限公司;2×Taq PCR StarMix购自北京康润诚业生物科技有限公司。
实施例1:水稻atg9突变体的获得
atg9突变体是根据Wang C,Shen L,Fu Y,et al.A simple CRISPR/Cas9 systemfor multiplex genome editing in rice[J].Journal of Genetics and Genomics,2015,42(12):703-706.中记载的CRISPR/Cas9技术构建的。
1、靶序列选择及引物设计
以野生型植株ATG9基因取19bp大小GAGTGGAAGCGCTCGAGTC为靶位点,根据靶位点设计引物,如表1。
表1:靶位点引物
2、中间载体构建
ATG9-2-g++与ATG9-2-g--引物用水稀释至浓度100μM,前引物和后引物各20μL,混合在一起,引物混合后变性退火,100℃变性5分钟,室温冷却,形成带有粘性末端的片段。中间载体SK-gRNA进行AarI酶切,37℃酶切3-6h,试剂盒纯化酶切产物,形成带有粘性末端的载体,酶切体系如表2所示。
表2:AarI酶切SK-gRNA载体体系
将带有粘性末端的载体和带有粘性末端的片段进行连接(摩尔浓度1:3-10),得到重组质粒1,命名为SK-gRNA-ATG9重组载体。如表3配制体系完成后,用移液器轻轻吸打混匀各组分,短暂离心将反应液收集至管底,置于室温0.5-1h。反应产物转化感受态细胞DH5α,将菌液涂布棒在含有Amp抗性的平板上轻轻涂匀,将平板倒置,于37℃过夜培养。
表3:重组反应体系
克隆鉴定可用公共引物T3与ATG9-2-g--搭配进行菌落PCR阳性检测,利用公共引物T7或T3进行测序检测,验证是否正确。
T7:5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’
T3:5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3’
3、构建至最终载体
pC1300-Cas9载体用KpnI和BamHI进行酶切回收。SK-gRNA-ATG9重组载体用KpnI和BglII进行酶切并回收片段。pC1300-Cas9和SK-gRNA-ATG9载体各反应体系如表4-1和4-2所示,37℃双酶切1h。
表4-1:pC1300-Cas9载体酶切反应体系
表4-2:SK-gRNA-ATG9重组载体酶切反应体系
并将回收片段连接到线性化的pC1300-Cas9载体上,得到重组载体2。连接体系如表5所示,用移液器轻轻吸打混匀各组分,短暂离心将反应液收集至管底,置于室温0.5-1h。反应产物转化感受态细胞DH5α,将菌液涂布棒在含有Kan抗性的平板上轻轻涂匀,将平板倒置,于37℃过夜培养。
表5:终载体连接体系
利用测序引物pC1300-F进行测序检测,验证重组载体是否正确。
pC1300-F:5’-ACACTTTATGCTTCCGGCTC-3’
4、转农杆菌转化水稻愈伤,获得转基因植株
转农杆菌转化水稻愈伤,获得转基因植株T
5、水稻基因组总DNA的提取
提取待测水稻植株叶片基因组DNA,在敲除靶位点序列附近设计引物,经PCR扩增后,产物进行测序分析,鉴定其基因靶序列是否发生了改变。
(1)取少量叶片置2mL管子中,加入钢珠,加入400-500μLTPS溶液;
(2)粉碎机粉碎,75℃水浴30min;
(3)12000rpm离心10min;
(4)取上清(500μL)至1.5mL管子中,加冰冻的等体积无水乙醇,上下混匀;
(5)放置-20℃0.5h以上;
(6)12000rpm离心5min,去上清;
(7)静置0.5h以上,去酒精,干燥;
(8)加100μL ddH
6、PCR扩增鉴定
以提取的DNA为模板,引物为表6的ATG9-F/R,进行PCR扩增,PCR扩增反应体系如表7所示。
表6:PCR扩增的目的片段引物
表7:PCR反应体系
扩增程序为:94℃预变性5min;98℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸60s/1kb,25个循环;68℃总延伸5min,16℃保持1min。反应结束后,取5μL扩增产物加到含核酸染料的1%琼脂糖凝胶中电泳;电泳结束后在紫外成像仪上照胶,检测条带是否扩增出来,如果条带扩增出来,说明该片段是可能包含突变点的目的基因片段。其余PCR产物则送去测序公司进行测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)。
7、测序比对
将测序结果放入华南农业大学刘耀光院士DSDecodeM(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)网站进行比对,根据峰图判断纯杂合位点,单峰则代表纯合位点,双峰则代表杂合位点。结果如图1所示,突变位点插入T的并为单峰则表示该植株即纯合的atg9突变体植株。
实施例2:ATG9过表达植株的构建
植物过表达载体pRHVcGFP由中国农业科学院王国梁课题组提供(植物过表达载体pRHVcGFP已在He F,Zhang F,Sun W,et al.A Versatile Vector Toolkit forFunctional Analysis of Rice Genes[J].Rice,2018,11(1):27.的补充数据中公开)
1、pRHVcGFP-ATG9过表达载体的构建
(1)目的基因扩增
取WT叶片的cDNA为模板(根据abm反转录试剂盒说明书操作),根据目的基因设计引物(表8),经过PCR扩增得到目的基因,扩增PCR体系如表9所示:
表8:PCR扩增的目的片段引物
表9:目的基因PCR反应体系
扩增程序为:94℃预变性5min;98℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸60s,32个循环;68℃总延伸5min,16℃保持1min。反应结束后,取50μL扩增产物加到含核酸染料的1%琼脂糖凝胶中电泳,电泳结束后在紫外成像仪上照胶,检测条带是否扩增出来。如果目的条带扩增出来,说明扩增片段中可能含有目的基因。将目的条带切割起来,继续胶回收纯化产物(根据胶回收试剂盒说明书操作)以及浓度测定。
(2)制备线性化载体
分别取过表达载体pRHVcGFP和目的基因各3μg(根据质粒抽提试剂盒说明书操作),两个反应体系都加入相应限制性核酸内切酶37℃双酶切20min。过表达载体pRHVcGFP和目的基因各反应体系如表10所示:
表10:酶切反应体系
取50μL反应产物加到含核酸染料的1%琼脂糖凝胶中电泳,电泳结束后在紫外成像仪上照胶,目的条带分离出来后,将目的条带切割起来,继续胶回收纯化产物以及浓度测定。
(3)重组反应
用T4 DNA连接酶将插入片段和载体按比例重组在起来,得到pRHVcGFP-ATG9过表达载体。最适载体与插入片段摩尔比为1:(2-3)。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得:最适载体使用量X=[0.02×载体碱基对数]ng(0.03pmol)。最适插入片段使用量Y=[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)或=[0.06×插入片段碱基对数]ng(0.09pmol)。重组反应体系如表11:
表11:重组反应体系
体系配制完成后,用移液器轻轻吸打混匀各组分,短暂离心将反应液收集至管底。置于16℃反应6-8h。反应产物可直接进行转化,也可储存于-20℃,待需要时解冻转化。
(4)重组产物转化、涂板
在冰上解冻克隆感受态细胞DH5α。取10μL冷却重组产物(pRHVcGFP-ATG9过表达载体),加入到100μL感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30min;42℃热激60秒,冰浴孵育2min,加入900μL LB培养基,37℃,200rpm,摇菌30min,5000rpm离心3min,弃掉上清。用剩余培养基将菌体重悬,用无菌涂布棒在含有kan抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收,将平板倒置,于37℃过夜培养。
(5)克隆鉴定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至500μL LB培养基中混匀,直接取1μL作为PCR模板,剩余菌液后续做测序鉴定。所用引物如表6,进行PCR反应,反应体系如表12:
表12:菌落PCR反应体系
扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s,25个循环;72℃总延伸5min,16℃保持1min。反应结束后,取20μL扩增产物加到含核酸染料的1%琼脂糖凝胶中电泳;电泳结束后在紫外成像仪上照胶,检测条带是否扩增出来。如果条带扩增出来,则将克隆送去测序公司进行测序(测序由广州睿博生物技术有限公司完成)。
2、转基因植物遗传转化与鉴定
将构建好的pRHVcGFP-ATG9过表达载体送去百格基因科技(江苏)有限公司做遗传转化,至得到T
表13:HYG鉴定引物
实施例3:ATG9表型分析
本发明人在广东省增城实验基地试验田和广东省广州市华南农业大学农场播种粳稻品种野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株(OE),在水稻生长过程中统计成熟期的株高、穗长,待到收种时,测量粒宽、粒长和百粒重。
待测植株:野生型(WT)、突变体(atg9)和ATG9过表达植株(OE)。
分别取待测植株,详细分析成熟期的株高、穗长、粒宽、粒长和百粒重,并对其进一步的测量统计。结果如图2和图3所示。表型分析发现,与野生型(WT)相比,atg9突变体表现出多种生长发育缺陷的表型,包括株型变矮,穗长变短,籽粒长度变短以及百粒重减少。与WT相比,OE的株高和穗长显著提高,粒宽粒长以及百粒重亦明显增加。以上结果表明,ATG9过表达正调控了多个水稻重要农艺性状,是潜在的改良水稻产量和品质的新靶点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2784
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<223> 自噬基因ATG9的核苷酸序列
<400> 1
atgatgtcct tccttccgaa gggcaaaact acacaaacag cgtttaagtg gccatggaga 60
ggtgaatcgc agctatcggc gcatcttctc attgatattc cacctgaaat cgaattgtcg 120
gactaccgaa gattgccaag ccctggtaat gagagcccat cagggctact tcatggagaa 180
gactttaagg aggaggtgat ccctgacttg gatattttct ttgagaggct ctatgagtat 240
ttctgcgcga aaggtctgcg gtgcatcatc accaagtgga taattgagat cctcaatgtg 300
acgtttatgg tttgctgtat cgggtttttc ttcttgtttg ttgattggcc tgcccttggc 360
gatttgaaat gtggagtgga agcgctcgag tcaggggcaa aaccttgtga cctaatgaaa 420
ctcattaagt atcgtcccct agatcctttc acatttacaa agtttatcac tattggatcc 480
atggttatac tctcaactta cggaatcatt aactttgtga agttttttgt aaaactgaga 540
agcacactca aggtccgtga cttctactgt aacagtctca aggttacaga tctcgaaatt 600
cagactatat catggcctag agtagttgag aaggtcgtac ttctgcagaa gtcacaacga 660
ctttgtgtcg ttaaagatct cacggagcat gatataatca tgcgaataat gcgtaaacaa 720
aactacctga ttgggatggt taataaaggt atcatcgcat tgccaatccc ctcttggctt 780
cctggagttg gcccaactgt cagctcacgt atgcatggaa aaaaaagcta tctgatgctt 840
ccaaaggccc tggagtggac attgaattgg tgcatcttcc aaaccatgtt tgataggaaa 900
ttttgtgtta gaaaagacat tctgacaagt ccgtctttat tgaagaaacg gcttgtattt 960
atgggtattg ccatgtttct tctgtcacct tgtcttgtta tcttcccatt ggtataccta 1020
tttctgagat atgcagaaga attctacaat caccccagta cggcatcatc tcgaaaatgg 1080
tcgaatcttt caaagtggat tttgagggaa tacaatgagg ttgaccattt cttcaaacat 1140
aggttgaaca acagtagtgt caactcacta aattatttga agcagtttcc aactccacta 1200
gtatctatta ttgcaaaatt catatcgttt gtatctggtg gattggctgg aattcttctc 1260
atccttggat ttctaggtga atccatcctt gagggtcatg tatttggccg aaatcttctc 1320
tggtatacta ttgtttttgg aacaatagca actgttagtc ggaatgttgt ggttgatgaa 1380
ctccaagtga ttgatccaga aggagctatg tcctttgttc tgcagcagac acactacatg 1440
cctaaaaggt ggcgcggtaa agagggcagt gaacttgtac gaagggactt tgaatctctg 1500
tttcagtata ccataacgat gctactagaa gagatggcct caattttcat cactccatat 1560
ctgctaatat ttgtggttcc aaagcgtgtt gatgatattc tacgcttcat atcagacttc 1620
acagtttatg ttgatggagt gggagatgtg tgcagcttaa gcatgttcga cttaagaaga 1680
catggaaata gaaactacgg ttcaccacat aatgcagtta aaagcatgag aagctcccaa 1740
ggaaaaatgg agaaatcact attaagtttc caaagcacct acacatcatg ggagccaaac 1800
gcagatggca agaaatttat ttgcaacctc cagaaattca aggagaaaca aatccgtcaa 1860
catacctttc aaacaacgga atcatcacag cttgggttga gttgtagagg tcaaactgca 1920
gttttccatc gactgctccc tagaaacatc tatcctggca atggggtcat ttttaacttt 1980
gatccattag gactgctcga cacagatcaa agagcttgtc catatatcct ggattggtat 2040
tacacacacc aacacacaaa tagagaagcg ggctcatctt cccaccttaa tgaagcatca 2100
cctgagcaac aggaggagat atggccacct ctgagcaaac cattaacaga aattgaagat 2160
gagcaaatct gggattctga tttatataga agagctcgaa gctacctgga ggcatcaaca 2220
tcaagtgcat tctttcgaca ggccaccacc ttcaagcgcc atggcaggga acaaaattct 2280
accagccatc aatggtgggc tcaggcctcg aggcagcagg ctgatccacg aaacagtttt 2340
caagggcctc ctcaagacag ttttcttgag cctccggact tccgaaatca tttggaagct 2400
agccatgatt ccagccatca aagtgattgt aggctgacct ccagaaggtc aactgatcca 2460
caagacagct tcgttgagcc tcctgatttt ggtgattaca tgtcctgtca tagctctagc 2520
tatcatggcg atgaaacgtc ggatggaaac tcagaactag atcaaagcaa caatagttgg 2580
cgaagccccc atgccctgtc aaagacaagg tacatgggtg atgatgatct tgacctagaa 2640
caaggcccga gtttccattt tactgatgcc cctcagaagg acagtggaag tgaaggagat 2700
ggacatggtg tagccaatat ttacagctct acgccagcca gccttcctgt acggataata 2760
cctagaagca gtgacccagt ttag 2784
<210> 2
<223> 自噬基因ATG9的氨基酸序列
<400> 2
Met Met Ser Phe Leu Pro Lys Gly Lys Thr Thr Gln Thr Ala Phe Lys
1 5 10 15
Trp Pro Trp Arg Gly Glu Ser Gln Leu Ser Ala His Leu Leu Ile Asp
20 25 30
Ile Pro Pro Glu Ile Glu Leu Ser Asp Tyr Arg Arg Leu Pro Ser Pro
35 40 45
Gly Asn Glu Ser Pro Ser Gly Leu Leu His Gly Glu Asp Phe Lys Glu
50 55 60
Glu Val Ile Pro Asp Leu Asp Ile Phe Phe Glu Arg Leu Tyr Glu Tyr
65 70 75 80
Phe Cys Ala Lys Gly Leu Arg Cys Ile Ile Thr Lys Trp Ile Ile Glu
85 90 95
Ile Leu Asn Val Thr Phe Met Val Cys Cys Ile Gly Phe Phe Phe Leu
100 105 110
Phe Val Asp Trp Pro Ala Leu Gly Asp Leu Lys Cys Gly Val Glu Ala
115 120 125
Leu Glu Ser Gly Ala Lys Pro Cys Asp Leu Met Lys Leu Ile Lys Tyr
130 135 140
Arg Pro Leu Asp Pro Phe Thr Phe Thr Lys Phe Ile Thr Ile Gly Ser
145 150 155 160
Met Val Ile Leu Ser Thr Tyr Gly Ile Ile Asn Phe Val Lys Phe Phe
165 170 175
Val Lys Leu Arg Ser Thr Leu Lys Val Arg Asp Phe Tyr Cys Asn Ser
180 185 190
Leu Lys Val Thr Asp Leu Glu Ile Gln Thr Ile Ser Trp Pro Arg Val
195 200 205
Val Glu Lys Val Val Leu Leu Gln Lys Ser Gln Arg Leu Cys Val Val
210 215 220
Lys Asp Leu Thr Glu His Asp Ile Ile Met Arg Ile Met Arg Lys Gln
225 230 235 240
Asn Tyr Leu Ile Gly Met Val Asn Lys Gly Ile Ile Ala Leu Pro Ile
245 250 255
Pro Ser Trp Leu Pro Gly Val Gly Pro Thr Val Ser Ser Arg Met His
260 265 270
Gly Lys Lys Ser Tyr Leu Met Leu Pro Lys Ala Leu Glu Trp Thr Leu
275 280 285
Asn Trp Cys Ile Phe Gln Thr Met Phe Asp Arg Lys Phe Cys Val Arg
290 295 300
Lys Asp Ile Leu Thr Ser Pro Ser Leu Leu Lys Lys Arg Leu Val Phe
305 310 315 320
Met Gly Ile Ala Met Phe Leu Leu Ser Pro Cys Leu Val Ile Phe Pro
325 330 335
Leu Val Tyr Leu Phe Leu Arg Tyr Ala Glu Glu Phe Tyr Asn His Pro
340 345 350
Ser Thr Ala Ser Ser Arg Lys Trp Ser Asn Leu Ser Lys Trp Ile Leu
355 360 365
Arg Glu Tyr Asn Glu Val Asp His Phe Phe Lys His Arg Leu Asn Asn
370 375 380
Ser Ser Val Asn Ser Leu Asn Tyr Leu Lys Gln Phe Pro Thr Pro Leu
385 390 395 400
Val Ser Ile Ile Ala Lys Phe Ile Ser Phe Val Ser Gly Gly Leu Ala
405 410 415
Gly Ile Leu Leu Ile Leu Gly Phe Leu Gly Glu Ser Ile Leu Glu Gly
420 425 430
His Val Phe Gly Arg Asn Leu Leu Trp Tyr Thr Ile Val Phe Gly Thr
435 440 445
Ile Ala Thr Val Ser Arg Asn Val Val Val Asp Glu Leu Gln Val Ile
450 455 460
Asp Pro Glu Gly Ala Met Ser Phe Val Leu Gln Gln Thr His Tyr Met
465 470 475 480
Pro Lys Arg Trp Arg Gly Lys Glu Gly Ser Glu Leu Val Arg Arg Asp
485 490 495
Phe Glu Ser Leu Phe Gln Tyr Thr Ile Thr Met Leu Leu Glu Glu Met
500 505 510
Ala Ser Ile Phe Ile Thr Pro Tyr Leu Leu Ile Phe Val Val Pro Lys
515 520 525
Arg Val Asp Asp Ile Leu Arg Phe Ile Ser Asp Phe Thr Val Tyr Val
530 535 540
Asp Gly Val Gly Asp Val Cys Ser Leu Ser Met Phe Asp Leu Arg Arg
545 550 555 560
His Gly Asn Arg Asn Tyr Gly Ser Pro His Asn Ala Val Lys Ser Met
565 570 575
Arg Ser Ser Gln Gly Lys Met Glu Lys Ser Leu Leu Ser Phe Gln Ser
580 585 590
Thr Tyr Thr Ser Trp Glu Pro Asn Ala Asp Gly Lys Lys Phe Ile Cys
595 600 605
Asn Leu Gln Lys Phe Lys Glu Lys Gln Ile Arg Gln His Thr Phe Gln
610 615 620
Thr Thr Glu Ser Ser Gln Leu Gly Leu Ser Cys Arg Gly Gln Thr Ala
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Val Phe His Arg Leu Leu Pro Arg Asn Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Val
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Ile Phe Asn Phe Asp Pro Leu Gly Leu Leu Asp Thr Asp Gln Arg Ala
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Cys Pro Tyr Ile Leu Asp Trp Tyr Tyr Thr His Gln His Thr Asn Arg
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Glu Glu Ile Trp Pro Pro Leu Ser Lys Pro Leu Thr Glu Ile Glu Asp
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Glu Gln Ile Trp Asp Ser Asp Leu Tyr Arg Arg Ala Arg Ser Tyr Leu
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Glu Ala Ser Thr Ser Ser Ala Phe Phe Arg Gln Ala Thr Thr Phe Lys
740 745 750
Arg His Gly Arg Glu Gln Asn Ser Thr Ser His Gln Trp Trp Ala Gln
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Ala Ser Arg Gln Gln Ala Asp Pro Arg Asn Ser Phe Gln Gly Pro Pro
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Tyr Met Ser Cys His Ser Ser Ser Tyr His Gly Asp Glu Thr Ser Asp
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<223> 靶位点
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cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa 3240
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<400> 6
aattcgagct cggtaccaag gatccgtacc cctactccaa aaatgtcaaa gatacagtct 60
cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt aatttcggga aacctcctcg 120
gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcgaaaggac agtagaaaag gaaggtggct 180
cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcat tcaagatgcc tctgccgaca 240
gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa 300
ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg acatctccac tgacgtaagg gatgacgcac 360
aatcccaccc ctactccaaa aatgtcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg 420
agacttttca acaaagggta atttcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 480
gtcacttcat cgaaaggaca gtagaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 540
ataaaggaaa ggctatcatt caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 600
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 660
attgatgtga catctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 720
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacagcccaa gctagatcca 780
tggcccctaa gaagaagaga aaggtcggta ttcacggcgt tcctgcggcg atggacaaga 840
agtatagtat tggtctggac attgggacga attccgttgg ctgggccgtg atcaccgatg 900
agtacaaggt cccttccaag aagtttaagg ttctggggaa caccgatcgg cacagcatca 960
agaagaatct cattggagcc ctcctgttcg actcaggcga gaccgccgaa gcaacaaggc 1020
tcaagagaac cgcaaggaga cggtatacaa gaaggaagaa taggatctgc tacctgcagg 1080
agattttcag caacgaaatg gcgaaggtgg acgattcgtt ctttcataga ttggaggaga 1140
gtttcctcgt cgaggaagat aagaagcacg agaggcatcc tatctttggc aacattgtcg 1200
acgaggttgc ctatcacgaa aagtacccca caatctatca tctgcggaag aagcttgtgg 1260
actcgactga taaggcggac cttagattga tctacctcgc tctggcacac atgattaagt 1320
tcaggggcca ttttctgatc gagggggatc ttaacccgga caatagcgat gtggacaagt 1380
tgttcatcca gctcgtccaa acctacaatc agctctttga ggaaaaccca attaatgctt 1440
caggcgtcga cgccaaggcg atcctgtctg cacgcctttc aaagtctcgc cggcttgaga 1500
acttgatcgc tcaactcccg ggcgaaaaga agaacggctt gttcgggaat ctcattgcac 1560
tttcgttggg gctcacacca aacttcaaga gtaattttga tctcgctgag gacgcaaagc 1620
tgcagctttc caaggacact tatgacgatg acctggataa ccttttggcc caaatcggcg 1680
atcagtacgc ggacttgttc ctcgccgcga agaatttgtc ggacgcgatc ctcctgagtg 1740
atattctccg cgtgaacacc gagattacaa aggccccgct ctcggcgagt atgatcaagc 1800
gctatgacga gcaccatcag gatctgaccc ttttgaaggc tttggtccgg cagcaactcc 1860
cagagaagta caaggaaatc ttctttgatc aatccaagaa cggctacgct ggttatattg 1920
acggcggggc atcgcaggag gaattctaca agtttatcaa gccaattctg gagaagatgg 1980
atggcacaga ggaactcctg gtgaagctca atagggagga ccttttgcgg aagcaaagaa 2040
ctttcgataa cggcagcatc cctcaccaga ttcatctcgg ggagctgcac gccatcctga 2100
gaaggcagga agacttctac ccctttctta aggataaccg ggagaagatc gaaaagattc 2160
tgacgttcag aattccgtac tatgtcggac cactcgcccg gggtaattcc agatttgcgt 2220
ggatgaccag aaagagcgag gaaaccatca caccttggaa cttcgaggaa gtggtcgata 2280
agggcgcttc cgcacagagc ttcattgagc gcatgacaaa ttttgacaag aacctgccta 2340
atgagaaggt ccttcccaag cattccctcc tgtacgagta tttcactgtt tataacgaac 2400
tcacgaaggt gaagtatgtg accgagggaa tgcgcaagcc cgccttcctg agcggcgagc 2460
aaaagaaggc gatcgtggac cttttgttta agaccaatcg gaaggtcaca gttaagcagc 2520
tcaaggagga ctacttcaag aagattgaat gcttcgattc cgttgagatc agcggcgtgg 2580
aagacaggtt taacgcgtca ctggggactt accacgatct cctgaagatc attaaggata 2640
aggacttctt ggacaacgag gaaaatgagg atatcctcga agacattgtc ctgactctta 2700
cgttgtttga ggatagggaa atgatcgagg aacgcttgaa gacgtatgcc catctcttcg 2760
atgacaaggt tatgaagcag ctcaagagaa gaagatacac cggatgggga aggctgtccc 2820
gcaagcttat caatggcatt agagacaagc aatcagggaa gacaatcctt gactttttga 2880
agtctgatgg cttcgcgaac aggaatttta tgcagctgat tcacgatgac tcacttactt 2940
tcaaggagga tatccagaag gctcaagtgt cgggacaagg tgacagtctg cacgagcata 3000
tcgccaacct tgcgggatct cctgcaatca agaagggtat tctgcagaca gtcaaggttg 3060
tggatgagct tgtgaaggtc atgggacggc ataagcccga gaacatcgtt attgagatgg 3120
ccagagaaaa tcagaccaca caaaagggtc agaagaactc gagggagcgc atgaagcgca 3180
tcgaggaagg cattaaggag ctggggagtc agatccttaa ggagcacccg gtggaaaaca 3240
cgcagttgca aaatgagaag ctctatctgt actatctgca aaatggcagg gatatgtatg 3300
tggaccagga gttggatatt aaccgcctct cggattacga cgtcgatcat atcgttcctc 3360
agtccttcct taaggatgac agcattgaca ataaggttct caccaggtcc gacaagaacc 3420
gcgggaagtc cgataatgtg cccagcgagg aagtcgttaa gaagatgaag aactactgga 3480
ggcaactttt gaatgccaag ttgatcacac agaggaagtt tgataacctc actaaggccg 3540
agcgcggagg tctcagcgaa ctggacaagg cgggcttcat taagcggcaa ctggttgaga 3600
ctagacagat cacgaagcac gtggcgcaga ttctcgattc acgcatgaac acgaagtacg 3660
atgagaatga caagctgatc cgggaagtga aggtcatcac cttgaagtca aagctcgttt 3720
ctgacttcag gaaggatttc caattttata aggtgcgcga gatcaacaat tatcaccatg 3780
ctcatgacgc atacctcaac gctgtggtcg gaacagcatt gattaagaag tacccgaagc 3840
tcgagtccga attcgtgtac ggtgactata aggtttacga tgtgcgcaag atgatcgcca 3900
agtcagagca ggaaattggc aaggccactg cgaagtattt cttttactct aacattatga 3960
atttctttaa gactgagatc acgctggcta atggcgaaat ccggaagaga ccacttattg 4020
agaccaacgg cgagacaggg gaaatcgtgt gggacaaggg gagggatttc gccacagtcc 4080
gcaaggttct ctctatgcct caagtgaata ttgtcaagaa gactgaagtc cagacgggcg 4140
ggttctcaaa ggaatctatt ctgcccaagc ggaactcgga taagcttatc gccagaaaga 4200
aggactggga cccgaagaag tatggaggtt tcgactcacc aacggtggct tactctgtcc 4260
tggttgtggc aaaggtggag aagggaaagt caaagaagct caagtctgtc aaggagctcc 4320
tgggtatcac cattatggag aggtccagct tcgaaaagaa tccgatcgat tttctcgagg 4380
cgaagggata taaggaagtg aagaaggacc tgatcattaa gcttccaaag tacagtcttt 4440
tcgagttgga aaacggcagg aagcgcatgt tggcttccgc aggagagctc cagaagggta 4500
acgagcttgc tttgccgtcc aagtatgtga acttcctcta tctggcatcc cactacgaga 4560
agctcaaggg cagcccagag gataacgaac agaagcaact gtttgtggag caacacaagc 4620
attatcttga cgagatcatt gaacagattt cggagttcag taagcgcgtc atcctcgccg 4680
acgcgaattt ggataaggtt ctctcagcct acaacaagca ccgggacaag cctatcagag 4740
agcaggcgga aaatatcatt catctcttca ccctgacaaa ccttggggct cccgctgcat 4800
tcaagtattt tgacactacg attgatcgga agagatacac ttctacgaag gaggtgctgg 4860
atgcaaccct tatccaccaa tcgattactg gcctctacga gacgcggatc gacttgagtc 4920
agctcggggg ggataagaga ccagcggcaa ccaagaaggc aggacaagcg aagaagaaga 4980
agtagcaatt cggtacgctg aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctctatt 5040
ttctccataa ataatgtgtg agtagtttcc cgataaggga aattagggtt cttatagggt 5100
ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact 5160
tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tactaaaatc cagatctcct 5220
aaagtcccta tagatctttg tcgtgaatat aaaccagaca cgagacgact aaacctggag 5280
cccagacgcc gttcgaagct agaagtaccg cttaggcagg aggccgttag ggaaaagatg 5340
ctaaggcagg gttggttacg ttgactcccc cgtaggtttg gtttaaatat gatgaagtgg 5400
acggaaggaa ggaggaagac aaggaaggat aaggttgcag gccctgtgca aggtaagaag 5460
atggaaattt gatagaggta cgctactata cttatactat acgctaaggg aatgcttgta 5520
tttataccct atacccccta ataacccctt atcaatttaa gaaataatcc gcataagccc 5580
ccgcttaaaa attggtatca gagccatgaa taggtctatg accaaaactc aagaggataa 5640
aacctcacca aaatacgaaa gagttcttaa ctctaaagat aaaagatctt tcaagatcaa 5700
aactagagtc gacctgcagg catgcaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 5760
actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 5820
gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 5880
atggcgaatg ctagagcagc ttgagcttgg atcagattgt cgtttcccgc cttcagttta 5940
aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 6000
agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 6060
atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc tccgctgcta 6120
tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 6180
gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 6240
ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 6300
gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac 6360
caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 6420
cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 6480
cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat 6540
tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga 6600
caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga 6660
gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt 6720
gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat 6780
cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac 6840
cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg 6900
tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg 6960
ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc 7020
gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc 7080
tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg 7140
ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt 7200
gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa 7260
atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca 7320
agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt 7380
tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac 7440
cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc 7500
ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga 7560
tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag cccttacgac atatgggcca 7620
ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 7680
cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg 7740
cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 7800
caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 7860
gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 7920
agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 7980
caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca 8040
gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat 8100
taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag taaatgagca aatgaataaa 8160
tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca 8220
ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct 8280
gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac 8340
ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 8400
aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 8460
gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 8520
ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 8580
atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 8640
ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 8700
gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 8760
atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 8820
cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 8880
ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 8940
gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 9000
gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag 9060
atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg 9120
acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg 9180
gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 9240
agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 9300
aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 9360
atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag 9420
atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 9480
agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 9540
ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 9600
ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 9660
tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 9720
tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 9780
aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 9840
ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 9900
aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 9960
gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 10020
gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 10080
attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 10140
taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 10200
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 10260
gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 10320
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 10380
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 10440
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 10500
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 10560
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 10620
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 10680
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 10740
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 10800
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 10860
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 10920
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 10980
cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 11040
tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 11100
tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 11160
tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 11220
atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 11280
tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 11340
caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 11400
aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 11460
gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 11520
acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 11580
acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 11640
tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 11700
cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 11760
ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 11820
cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 11880
attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 11940
tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 12000
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 12060
tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 12120
ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 12180
gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 12240
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 12300
aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 12360
ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 12420
gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 12480
gaactactca cacattatta tggagaaact cgagcttgtc gatcgacaga tccggtcggc 12540
atctactcta tttctttgcc ctcggacgag tgctggggcg tcggtttcca ctatcggcga 12600
gtacttctac acagccatcg gtccagacgg ccgcgcttct gcgggcgatt tgtgtacgcc 12660
cgacagtccc ggctccggat cggacgattg cgtcgcatcg accctgcgcc caagctgcat 12720
catcgaaatt gccgtcaacc aagctctgat agagttggtc aagaccaatg cggagcatat 12780
acgcccggag tcgtggcgat cctgcaagct ccggatgcct ccgctcgaag tagcgcgtct 12840
gctgctccat acaagccaac cacggcctcc agaagaagat gttggcgacc tcgtattggg 12900
aatccccgaa catcgcctcg ctccagtcaa tgaccgctgt tatgcggcca ttgtccgtca 12960
ggacattgtt ggagccgaaa tccgcgtgca cgaggtgccg gacttcgggg cagtcctcgg 13020
cccaaagcat cagctcatcg agagcctgcg cgacggacgc actgacggtg tcgtccatca 13080
cagtttgcca gtgatacaca tggggatcag caatcgcgca tatgaaatca cgccatgtag 13140
tgtattgacc gattccttgc ggtccgaatg ggccgaaccc gctcgtctgg ctaagatcgg 13200
ccgcagcgat cgcatccata gcctccgcga ccggttgtag aacagcgggc agttcggttt 13260
caggcaggtc ttgcaacgtg acaccctgtg cacggcggga gatgcaatag gtcaggctct 13320
cgctaaactc cccaatgtca agcacttccg gaatcgggag cgcggccgat gcaaagtgcc 13380
gataaacata acgatctttg tagaaaccat cggcgcagct atttacccgc aggacatatc 13440
cacgccctcc tacatcgaag ctgaaagcac gagattcttc gccctccgag agctgcatca 13500
ggtcggagac gctgtcgaac ttttcgatca gaaacttctc gacagacgtc gcggtgagtt 13560
caggcttttt catatctcat tgccccccgg gatctgcgaa agctcgagag agatagattt 13620
gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 13680
gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca gtggagatat 13740
cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc acgatgctcc 13800
tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga acgatagcct 13860
ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact gtccttttga 13920
tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt accctttgtt 13980
gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc ttggagtaga 14040
cgagagtgtc gtgctccacc atgttatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg 14100
gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt 14160
cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc 14220
caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga 14280
ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga 14340
ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttggcaagct 14400
gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 14460
gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta 14520
gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg 14580
aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acg 14633
<210> 7
<223> ATG9-2-g++引物
<400> 7
ggcagagtgg aagcgctcga gtc 23
<210> 8
<223> ATG9-2-g--引物
<400> 8
aaacgactcg agcgcttcca ctc 23
<210> 9
<223> pC1300-F
<400> 9
acactttatg cttccggctc 20
<210> 10
<223> ATG9-F
<400> 10
ggctacttca tggagaagac tt 22
<210> 11
<223> ATG9-R
<400> 11
ttcgagatct gtaaccttga ga 22
<210> 12
<223> ATG9-cGFP-F
<400> 12
ggggtaccat gatgtccttc cttccgaag 29
<210> 13
<223> ATG9-cGFP-R
<400> 13
ttgctcacca tagcggccgc aactgggtca ctgcttctag 40
<210> 14
<223> HYG-F
<400> 14
aagatgttgg cgacctcgta ttgg 24
<210> 15
<223> HYG-R
<400> 15
gatcgttatg tttatcggca ctttgc 26
<210> 16
<223> T7
<400> 16
taatacgactcactatagg 19
<210> 17
<223> T3
<400> 17
attaaccctcactaaaggga 20
- 自噬基因ATG9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用
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