一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球及其制备方法。

背景技术

载药微球通过改变药物进入人体的方式和在体内的分布，控制药物的释放速度并将药物输送到特定的组织与器官内，实现提高药物的疗效和生物利用度，并减少毒副作用的目的。因其具有较高的药物利用率、控释缓释性、安全性和有效性等优点，载药微球被广泛用于制造可靶向释放药物的药物载体中，而成为当前生物功能材料研究的重点方向。近年来有大量研究表明血管化在骨再生过程中起着重要作用，血管化可为骨再生过程中各种细胞代谢提供持续、大量的氧气和营养物质。因此，如何赋予骨修复材料良好的成骨和成血管活性是一个迫切需要解决的热点问题。

羟基磷灰石载药微球因与骨矿物质组成相似、具有良好的生物相容性和骨传导性等优点成为医用缓释载体材料中研究和应用最广泛的一类。近年来已有制备羟基磷灰石载药微球的报道，如一种利用水热合成技术制备可以进一步装载抗肿瘤促修复药物的锌掺杂羟基磷灰石微球的方法，尽管负载的阿霉素可以持续释放，但阿霉素在60h累积释放量为1200μg远高于药物的有效浓度要求，且与骨组织的重建与再生修复在时间上存在较大的差距，难以满足临床对药物缓释的需求。还有文献报道了具有多级缓控释效果的羟基磷灰石载药微球的制备，首先制得羟基磷灰石微球，然后将微球浸入到药液中通过冷冻干燥得到载药经基磷灰石微球，最后再与PLGA与药物的混合溶液混合于低温条件下过滤得到多级缓控释效果的羟基磷灰石载药微球。尽管制备的载药羟基磷灰石微球载药量高，具有长期的缓控释效果，但是制备工艺相对复杂，且高温烧结后制备的磷灰石陶瓷硬度大，与骨组织中的主要无机成分-纳米磷灰石在微观结构和力学性能方面是有显著差异的，植入骨缺损区后力学性能与自体骨不匹配，易产生应力屏蔽效应，影响骨组织再生修复，因此上述方法难以大量工业化生产此缓释载体材料。

含Sr生物材料如用Sr取代10％钙的羟基磷灰石，已被证明能促进成骨。SIM(辛伐他汀)是一种降低胆固醇水平的药物，近年来有研究证明SIM能够通过上调血管内皮生长因子(VEGF)、促进骨形态发生-2(BMP-2)的表达等促进骨修复及改善伤口愈合。然而，辛伐他汀全身给药的平均剂量因其生物利用度低于5％不足以促进骨形成；高剂量则会产生肝毒性和肌毒性等副作用，其发生率随着剂量的增加而增加。传统的药物载体材料由于不同制备方法往往存在一些局限性，如机械混合法制备的药物释放系统往往存在药物暴释；通过表面吸附药物的载药平台通常存在低载药量；一些具有良好的载药和缓释性能的载药生物材料因合成工艺复杂造成成本过高限制了其应用。现有技术中未见有将锶和辛伐他汀结合制备羟基磷灰石载药微球的报道。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球及其制备方法，以解决现有载药微球合成过程复杂、载药量低和药物突释的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：将磷酸盐、钙盐、锶盐和辛伐他汀，通过微波水热反应一步法制备得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球。

本发明的有益效果为：本发明通过一步法制备得到双负载羟基磷灰石微球，该制备方法简单易行，克服了现有载药生物材料合成过程复杂的问题。其中，锶以取代羟基磷灰石密排六方结构中部分钙的位置，羟基磷灰石自组装成微球，其微球为中空结构，通过微波水热反应一步法，在羟基磷灰石自组装成微球过程中将辛伐他汀小分子吸附在具有中空介孔结构的微球的内部及外表面，从而实现辛伐他汀和锶的长期缓释，提高了载药量，此外合成过程简单，有利于工业化生产。辛伐他汀的长期缓释赋予了材料良好的成血管活性，有利于促进血管生成，可为骨再生过程中各种细胞代谢提供持续、大量的氧气和营养物质通道；锶的长期缓释赋予了材料良好的成骨活性，进而可以发挥两者的协同作用促进血管生成和骨再生。现有技术中，没有将辛伐他汀和锶结合起来制备微球促进骨修复的报道，主要是因为载药量的影响，本发明技术方案解决了载药微球可以拥有高包封率的技术瓶颈。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：将磷酸盐溶液、钙盐溶液和锶盐溶液混匀，得混合溶液，然后调节混合溶液pH值为9-11，再加入辛伐他汀，超声分散，最后通过微波水热反应一步法制得锶和辛伐他汀双负载骨修复微球。

进一步，微波水热反应过程中反应温度为80-160℃，反应时间为10-60min；优选反应温度为100-120℃，更优选120℃，优选反应温度为20-40min，更优选为30min。

采用上述进一步技术方案的有益效果为：反应温度和反应时间对材料的物相、尺寸和形貌具有显著的影响。当微波水热反应温度为120℃时，可以制得纳米花状结构微球，而随着反应温度的升高，在140℃制得的羟基磷灰石微球表面呈纳米棒状结构，继续升高温度至160℃，纳米棒状结构排列的更规整，呈有序的介孔结构。由此可知，通过调节微波反应温度可以调控介孔羟基磷灰石的结构。然而保持反应温度不变，改变微波水热的时间，并不会明显改变羟基磷灰石微球的形貌结构，说明此一步法制备工艺中，反应时间对MHA的尺寸和形貌无明显的影响，而当反应时间优选为30min时可以完成自组装，使载药量达到最大。上述制备方法中，以微波水热反应制得纳米花状结构微球时，所述的微波水热反应温度可选用如120℃、160℃等作为反应温度，其中可优选120℃。

进一步，混合溶液中磷酸盐的浓度为0.01-0.05mol/L。

进一步，辛伐他汀含量为微球总质量的10-75wt％，锶含量为羟基磷灰石微球质量的1-60wt％，钙含量为羟基磷灰石微球质量的1-40wt％。

进一步，混合溶液中锶盐的浓度为1-25mM。

进一步，混合溶液中钙盐的浓度为1-25mM。

进一步，磷酸盐为磷酸二氢钠、磷酸氢二纳、磷酸钠、磷酸铵、磷酸钾和磷酸肌酸中的至少一种，优选磷酸盐为磷酸肌酸。

进一步地，钙盐为氯化钙、磷酸二氢钙、碳酸氢钙、硝酸钙和氯酸钙中的至少一种，优选钙盐为氯化钙。

进一步地，锶盐为氯化锶、硝酸锶、高氯酸锶、氯酸锶和溴酸锶中的至少一种，优选锶盐为氯化锶。

进一步地，加入辛伐他汀时先将辛伐他汀溶到有机溶剂或水中，可以选择的有机溶剂为卤化烃类、醇类或酯类，如二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙醚、醋酸甲酯、醋酸乙酯等中的至少一种。优选性能安全稳定、价格低廉的乙醇。溶剂的使用是保证辛伐他汀的均匀分散以及增大辛伐他汀在溶液中的溶解度，因此乙醇的使用量以使辛伐他汀达到完全溶解为佳。

进一步地，微波水热反应结束后将产物冷却至室温，然后离心、洗涤、干燥，制得锶和辛伐他汀双负载骨修复微球。

本发明具有以下有益效果：

本发明以水热反应一步合成法制备锶和辛伐他汀双负载羟基磷灰石微球的方法简单易行，特别是克服了载药生物材料合成过程复杂、载药量低和药物突释等问题，实现了锶和辛伐他汀的长期缓释。其中辛伐他汀的包封率可达70wt％以上；所制备的双负载羟基磷灰石微球能持续释放Sr和SIM 35天以上。辛伐他汀的长期缓释赋予了材料良好的成血管活性，有利于促进血管生成，可为骨再生过程中各种细胞代谢提供持续、大量的氧气和营养物质通道；同时锶的长期缓释赋予了材料良好的成骨活性，有利于同时促进血管生成和骨生成。该一步法制备锶和辛伐他汀双负载羟基磷灰石微球为进一步改善骨组织再生修复提供良好的治疗策略，为其他载药微球的制备提供参考，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明一步法制备锶和辛伐他汀双负载羟基磷灰石微球过程的示意图。

图2为锶和辛伐他汀双负载羟基磷灰石微球的扫描电子显微镜(SEM)照片及粒径分布图片。

图3为锶和辛伐他汀双负载羟基磷灰石微球的电子能谱(EDS)照片。

图4为SIM微波辅助水热处理前(SIM)与处理后(SIMM)的傅里叶变换红外光谱图(FTIR)(a)和核磁共振波谱图(NMR)(b)。

图5为锶和辛伐他汀双负载羟基磷灰石微球中SIM和Sr释放情况：(a)SIM的累积释放曲线，插图为包封率；(b)Sr的累积释放曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

将10mL 93mM的磷酸肌酸溶液缓慢滴入到30mL含29.00mM CaCl

实施例2：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，然后加入1mL 50mg/mL辛伐他汀-水溶液，超声分散5分钟，然后放入高压釜中，在微波水热反应器中加热至120℃，保持反应30分钟，使其完成自组装。冷却至室温，使用去离子水洗涤60min，然后3000rpm离心10min，冷冻干燥得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球即介孔羟基磷灰石微球。

实施例3：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，然后加入1mL100mg/mL辛伐他汀-乙醇溶液，超声分散3分钟，然后放入高压釜中，在微波水热反应器中加热至140℃，保持反应60分钟，使其完成自组装。冷却至室温，使用去离子水洗涤30min，然后3000rpm离心10min，冷冻干燥得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球即介孔羟基磷灰石微球。

实施例4：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，其中磷酸肌酸溶液加入量为10mL 186mM。然后加入1mL 25mg/mL辛伐他汀-乙醇溶液，超声分散3分钟后放入高压釜中，在微波水热反应器中加热至140℃，保持反应30分钟，使其完成自组装。冷却至室温，使用去离子水洗涤60min，然后3000rpm离心10min，冷冻干燥得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球即介孔羟基磷灰石微球。

实施例5：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，然后加入1mL 25mg/mL辛伐他汀-乙醇溶液，超声分散3分钟后放入高压釜中，在微波水热反应器中加热至140℃，保持反应30分钟，使其完成自组装。冷却至室温，使用去离子水洗涤30min，然后3000rpm离心10min，冷冻干燥得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球即介孔羟基磷灰石微球。

实施例6：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，其中用溶液Sr(NO

实施例7：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，然后加入1mL 50mg/mL辛伐他汀-水溶液，超声分散3分钟后放入高压釜中，在微波水热反应器中加热至140℃，保持反应30分钟，使其完成自组装。冷却至室温，使用去离子水洗涤30min，然后3000rpm离心10min，冷冻干燥得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球即介孔羟基磷灰石微球。

实施例8：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，然后加入1mL 50mg/mL辛伐他汀-水溶液，超声分散3分钟后放入高压釜中，在马弗炉中加热至120℃，保持反应30分钟，使其完成自组装。冷却至室温，使用去离子水洗涤30min，然后3000rpm离心10min，冷冻干燥得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球即介孔羟基磷灰石微球。

实施例9：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，然后加入1mL 50mg/mL辛伐他汀-水溶液，超声分散3分钟后放入高压釜中，在马弗炉中加热至160℃，保持反应60分钟，使其完成自组装。冷却至室温，使用去离子水洗涤30min，然后3000rpm离心10min，冷冻干燥得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球即介孔羟基磷灰石微球。

对比例1：

一种锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备方法，包括以下步骤：

按照实施例1的方法制备得到载锶羟基磷灰石微球预反应液，直接放入高压釜中，在微波水热反应器中加热至120℃，保持反应30分钟，使其完成自组装。冷却至室温，使用去离子水洗涤30min，然后3000rpm离心10min，倒弃上清液，然后加入1mL 50mg/mL辛伐他汀-水溶液并混合均匀，于恒温振荡器200rpm振动载药60分钟后3000rpm离心10min，最后冷冻干燥得到锶和辛伐他汀双负载骨修复微球。

本发明锶和辛伐他汀双负载骨修复微球的制备过程示意图如图1所示，在所得到的双负载羟基磷灰石微球产品中，存在促成骨和促成血管的锶和辛伐他汀。

图2和图3分别显示的是实施例1所制得的微球产品的SEM图片和EDS照片，花状微球表面上的锶等元素均匀分布显示羟基磷灰石微球成功合成并且均匀负载上锶元素。

图4显示的是实施例1微波辅助水热处理前后SIM的化学结构表征：(a)FTIR，(b)NMR。由于双负载微球是在120℃下微波辅助水热一步法制备，在该条件下SIM的稳定性至关重要。FTIR光谱显示微波辅助水热处理前后SIM在1697、2969、2871和3550cm

图5是实施例1制得的微球中锶和辛伐他汀的累积释放曲线，锶和辛伐他汀在35天内持续缓慢释放以及辛伐他汀的包封率。

其中，包封率测定过程为：采用紫外-可见分光光度计(UV/V-1000；上海翱艺仪器有限公司)于波长238nm处测得振动载药前后溶液中辛伐他汀的浓度。

图5中(a)图中的插图为本发明一步法制得的微球的辛伐他汀包封率，辛伐他汀掺加量为50mg时，微球包封率为62.03±0.14％；辛伐他汀掺加量为100mg时，微球此时包封率最高，达到71.90±1.29％。而对比例1制得的微球中，辛伐他汀掺加量为50mg时，微球包封率为7.04±1.24％，远低于本发明一步法制备的微球的载药效果。

累计释放试验具体步骤为：取一定量的微球，设三个平行样，置于加有10mL PBS的离心管中，置于37℃恒温摇床中。分别于12h、1、3、7、14、21和35d各时间点吸出4mL PBS，并加入4mL新鲜的PBS。用紫外分光光度计和电感耦合等离子体质谱仪检测各时间点收集的缓释溶液在特征吸收波长处的吸光度值，根据标准曲线计算药物释放量，并绘制累计释放曲线。微球在实验第1天分别累积释放锶和辛伐他汀34.79±0.16μg、1.63±0.02mg，35天累积释放量分别为74.60±1.44μg、4.00±0.08mg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。