用于调节C9ORF72表达的组合物

本申请是申请号为201680016814.1、申请日为2016年4月15日、发明名称为“用于调节C9ORF72表达的组合物”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2016/027747的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2015年4月16日，申请号为62/148,691的美国申请；申请日为2015年9月25日，申请号为62/232,941的美国申请；申请日为2015年10月9日，申请号为62/239,400的美国申请的优先权。

序列表

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领域

提供用于调节细胞和动物中的C9ORF72 mRNA和蛋白质表达的组合物和方法。此类组合物和方法可用于治疗、预防、改善神经退行性疾病或减缓其进展，所述神经退行性疾病包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征和橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)。

背景

肌萎缩性侧索硬化(ALS)是一种致命的神经退行性疾病，其临床特征在于进行性麻痹，从而导致通常在症状发作的二至三年内因呼吸衰竭而死亡(Rowland和Shneider,N.Engl.J.Med.,2001,344,1688-1700)。ALS是西方世界第三大常见的神经退行性疾病(Hirtz等人，Neurology,2007,68,326-337)，并且目前没有有效的疗法。大约10％的病例在本质上是家族性的，而被诊断患有所述疾病的大多数患者被分类为散发性的，因为他们似乎在整个群体中随机发生(Chio等人，Neurology,2008,70,533-537)。基于临床、遗传和流行病学数据，越来越认识到ALS和额颞叶痴呆(FTD)代表疾病的重叠连续体，其病理学特征在于中枢神经系统中TDP-43阳性包涵体的存在(Lillo和Hodges,J.Clin.Neurosci.,2009,16,1131-1135；Neumann等人，Science,2006,314,130-133)。

迄今为止，许多基因已被发现为是典型家族性ALS的原因，例如SOD1、TARDBP、FUS、OPTN和VCP(Johnson等人，Neuron,2010,68,857-864；Kwiatkowski等人，Science,2009,323,1205-1208；Maruyama等人，Nature,2010,465,223-226；Rosen等人，Nature,1993,362,59-62；Sreedharan等人，Science,2008,319,1668-1672；Vance等人，Brain,2009,129,868-876)。最近，涉及ALS、FTD和ALS-FTD的多种病例的亲缘连锁分析表明，9号染色体短臂上存在疾病的重要基因座(Boxer等人，J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry,2011,82,196-203；Morita等人，Neurology,2006,66,839-844；Pearson等人J.Nerol.,2011,258,647-655；Vance等人，Brain,2006,129,868-876)。C9ORF72基因中的突变是ALS和FTD的最常见遗传病因。导致突变的ALS-FTD是C9ORF72基因的第一个内含子中的较大六核苷酸(GGGGCC)重复序列扩增(Renton等人，Neuron,2011,72,257-268；DeJesus-Hernandez等人，Neuron,2011,72,245-256)。涵盖C9ORF72基因的建立者单倍型存在于大多数与此区域相关的病例中(Renton等人，Neuron,2011,72,257-268)。染色体9p21上的此基因座在405名芬兰患者的组中占家族性ALS的近一半，且占所有ALS病例的近四分之一(Laaksovirta等人，LancetNeurol.,2010,9,978-985)。

涵盖C9ORF72基因的建立者单倍型存在于大多数与此区域相关的病例中。

目前没有用于治疗此类神经退行性疾病的有效疗法。因此，目的是提供用于治疗此类神经退行性疾病的组合物和方法。

概述

某些实施方案提供用于抑制细胞、组织和动物中的C9ORF72mRNA和蛋白质表达的方法、化合物和组合物。某些实施方案提供用于降低细胞、组织和动物中的C9ORF72 mRNA和蛋白质水平的方法、化合物和组合物。某些实施方案提供靶向C9ORF72核酸的反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物是修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸是单链的。

在某些实施方案中，减少C9ORF72相关的重复序列相关非ATG翻译(RAN翻译)产物。在某些实施方案中，C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)。在某些实施方案中，优先减少某些C9ORF72 mRNA变体。在某些实施方案中，优先减少的C9ORF72 mRNA变体是从含有内含子1的前体mRNA加工的变体。在某些实施方案中，内含子1含有六核苷酸重复序列扩增。在某些实施方案中，优先减少的C9ORF72 mRNA变体是C9ORF72致病相关mRNA变体。在某些实施方案中，C9ORF72致病相关mRNA变体是NM_001256054.1(SEQ ID NO：1)。在某些实施方案中，六核苷酸重复序列扩增与C9ORF72相关疾病相关。在某些实施方案中，六核苷酸重复序列扩增与C9ORF72六核苷酸重复序列扩增相关疾病相关。在某些实施方案中，六核苷酸重复序列扩增包含至少30个GGGGCC重复序列、超过30个GGGGCC重复序列、超过100个GGGGCC重复序列、超过500个GGGGCC重复序列或超过1000个GGGGCC重复序列。在某些实施方案中，六核苷酸重复序列扩增与核灶相关。在某些实施方案中，C9ORF72相关RAN翻译产物与核灶相关。在某些实施方案中，C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)。在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于降低C9ORF72 mRNA水平、C9ORF72蛋白质水平、C9ORF72 RAN翻译产物和核灶。在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法适用于选择性地减少C9ORF72致病相关mRNA变体。所述减少可以时间依赖性方式或以剂量依赖性方式出现。

还提供适用于预防、治疗、改善与C9ORF72相关的疾病且减缓所述疾病的进展的方法。在某些实施方案中，所述C9ORF72相关疾病是神经退行性疾病。在某些实施方案中，神经退行性疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征和橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)。

所述疾病可具有一个或多个共同的风险因素、成因或结果。发展神经退行性疾病且具体地说ALS和FTD的某些风险因素和成因包括遗传素质和老龄。

在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用C9ORF72反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物是单链修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，单链修饰的寡核苷酸与C9ORF72核酸互补。

详述

应理解，以上概述和以下详述二者都仅为示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。在本文中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。如本文所使用，除非另外说明，否则“或”的使用是指“和/或”。此外，除非另外说明，否则如本文所用，“和”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。此外，除非另外明确陈述，否则如“要素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的要素和组分与包含一个以上亚单元的要素和组分两者。

本发明的化合物包括所公开的化合物的变体，其中一个或多个氢、碳、氮、氧或硫原子被同一元素的稳定同位素置换。

本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本公开中引用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、公开的专利申请、文章、书籍、论文和GENBANK登录号和可通过数据库如国家生物技术信息中心(NCBI)获得的相关序列信息以及在本文的公开内容通篇所涉及的其他数据关于本文所论述的文件部分以及其全部内容以引用的方式特此明确并入。

定义

除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学所用的命名以及本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学的工序和技术为本领域中熟知且常用的。标准技术可用于化学合成和化学分析。

除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：

“2'-O-甲氧基乙基”(又为2’-MOE和2’-OCH

“2'-MOE核苷”(又为2'-O-甲氧基乙基核苷)是指包含MOE修饰的糖部分的核苷。

“2'-取代的核苷”是指在呋喃糖环的2'位处包含除H或OH以外的取代基的核苷。在某些实施方案中，2'-取代的核苷包括具有双环糖修饰的核苷。

“5-甲基胞嘧啶”是指使用连接至5’位置的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。

“伴随施用”是指在相同时间以任何方式对两种药剂同时施用，其中两种药剂的药理作用均在患者中显现。同时施用不要求以单一的药物组合物、以相同剂型或通过相同的施用途径来施用两种药剂。两种药剂的作用本身不需要同时显现出来。这些作用仅需要一段时间重叠并且不需要共延。

“施用”是指向动物提供药剂，且包括但不限于由医学专业人员施用及自行施用。

“改善”是指减轻、减缓、停止或逆转病状或疾病严重性的至少一个指标。指标的严重性可通过本领域的技术人员已知的主观或客观度量来确定。

“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非人灵长类，包括但不限于猴子和黑猩猩。

“抗体”是指特征在于与抗原以某种方式特异性反应的分子，其中抗体与抗原各自利用另一者来定义。抗体可指完全抗体分子或其任何片段或区域，如重链、轻链、Fab区和Fc区。

“反义活性”是指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为靶核酸或由此靶核酸所编码的蛋白质的量或表达的减少。

“反义化合物”是指能够经历通过氢键合与靶核酸进行杂交的低聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，诸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA和占位型化合物。

“反义抑制”是指与在不存在与靶核酸互补的反义化合物的情况下的靶核酸水平相比，在存在反义化合物的情况下靶核酸水平的降低。

“反义机制”是所有涉及化合物与靶核酸的杂交的那些机制，其中杂交的结果或效果是靶标降解或靶标占位，伴随阻碍涉及例如转录或剪接的细胞机器。

“反义寡核苷酸”是指具有允许与靶核酸的对应片段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。

“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核酸碱基与靶核酸中的相应核酸碱基进行准确碱基配对(即杂交)的能力，且由相应核酸碱基之间的沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏氢键结合介导。

“双环糖”是指通过两个原子桥接而修饰的呋喃糖基环。双环糖是修饰的糖。

“双环核苷”(也称为BNA)指具有如下核苷，所述核苷所具有的糖部分包含连接糖环的两个碳原子的桥，从而形成双环系统。在某些实施方案中，所述桥连接糖环的4’碳与2’碳。

“C9ORF72反义转录物”是指从C9ORF72基因的非编码链(又为反义链和模板链)产生的转录物。C9ORF72反义转录物不同于从C9ORF72基因的编码链(又为有义链)产生的规范转录的“C9ORF72有义转录物”。在某些实施方案中，C9ORF72反义转录物是SEQ ID NO：18。

“C9ORF72反义转录物特异性抑制剂”是指能够在分子水平特异性地抑制C9ORF72反义转录物和/或其表达产物的表达的任何试剂。如本文所用，“特异性”是指降低或抑制C9ORF72反义转录物的表达而不将非靶标转录物降低至明显的程度(例如，C9ORF72反义转录物特异性抑制剂降低C9ORF72反义转录物的表达，但不将C9ORF72有义转录物的表达降低至明显程度)。C9ORF72特异性反义转录物抑制剂包括反义化合物、siRNA、适体、抗体、肽、小分子和其他能够抑制C9ORF72反义转录物和/或其表达产物(如C9ORF72反义转录物相关的RAN翻译产物)的表达的试剂。

“C9ORF72相关疾病”是指与任何C9ORF72核酸或其表达产物相关的任何疾病。此类疾病可包括神经退行性疾病。此类神经退行性疾病可包括ALS和FTD。在某些实施方案中，C9ORF72相关疾病是由六核苷酸重复序列扩增引起的(或与其相关)。在某些实施方案中，六核苷酸重复序列扩增可包括重复至少30次、超过30次、超过100次、超过500次或超过1000次的GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC或GGGGCG。

“C9ORF72相关的RAN翻译产物”是指通过RAN翻译(即，重复序列相关的，和非-ATG-依赖性翻译)而翻译的异常肽或二肽聚合物。在某些实施方案中，C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)中的任一种。

“C9ORF72核酸”是指编码C9ORF72的任何核酸。例如，在某些实施方案中，C9ORF72核酸包括编码C9ORF72的DNA序列，从编码C9ORF72的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA(即，前体mRNA))转录的RNA序列，和编码C9ORF72的mRNA序列。“C9ORF72 mRNA”是指编码C9ORF72蛋白的mRNA。

“C9ORF72致病相关mRNA变体”是指从含有六核苷酸重复序列的C9ORF72前体mRNA变体加工的C9ORF72 mRNA变体。当前体mRNA的转录在从外显子1A的起始位点至外显子1B的起始位点的区域，例如，基因组序列(SEQ ID NO：2，从核苷酸27535000至27565000截短的GENBANK登录号NT_008413.18的补体)的核苷酸1107至1520中开始时，C9ORF72前体mRNA包含六核苷酸重复序列。在某些实施方案中，测量C9ORF72致病相关mRNA变体的水平以测定样品中含有六核苷酸重复序列的C9ORF72前体mRNA的水平。

“C9ORF72特异性抑制剂”是指能够在分子水平上特异性地抑制C9ORF72 mRNA和/或C9ORF72蛋白的表达的任何试剂。例如，C9ORF72特异性抑制剂包括核酸(包括反义化合物)、siRNA、适体、抗体、肽、小分子和其他能够抑制C9ORF72 mRNA和/或C9ORF72蛋白的表达的试剂。类似地，在某些实施方案中，C9ORF72特异性抑制剂可影响动物中的其他分子过程。

“帽结构”或“端帽部分”是指已在反义化合物的任一末端并入的化学修饰。

“cEt”或“限制性乙基”是指具有包含连接4'-碳与2'-碳的桥的糖部分的双环核苷，其中所述桥具有下式：4’-CH(CH

“限制性乙基核苷”(又为cEt核苷)是指包含含有4’-CH(CH

“化学上不同的区域”是指以某种方式化学上不同于同一反义化合物的另一区域的反义化合物的区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷的区化学上不同于具有无2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷的区。

“嵌合反义化合物”是指具有至少两个化学上不同的区的反义化合物，每一位置具有多个亚单位。

“共同施用”是指对个体施用两种或更多种药剂。两种或更多种药剂可在单一药物组合物中，或可在分开的药物组合物中。两种或更多种药剂中的每一种可通过相同或不同的施用途经进行施用。共同施用包括平行或相继施用。

“互补性”是指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。

“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为意指包括所述步骤或要素或步骤或要素的群组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的群组。

“连续核碱基”是指彼此紧邻的核碱基。

“设计”或“被设计来”是指设计与所选核酸分子特异性杂交的低聚化合物的方法。

“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上是必需的或期望的成分。例如，在注射的药物中，稀释剂可以是液体，例如盐水溶液。

“剂量”是指在单个施用中或在指定时间内提供的指定量的药剂。在某些实施方案中，剂量可在一个、两个或多个大丸剂、片剂或注射剂中施用。例如，在某些实施方案中，当期望皮下施用时，所需剂量需要不易由单次注射调节的体积，因此，两个或多个注射可用于实现所需剂量。在某些实施方案中，药剂通过在延长的时段内或连续地输注来施用。剂量可被规定为每小时、每天、每周或每月药剂的量。

“有效量”在调节活性或治疗或预防病状的情况下是指向需要这种调节、治疗或防治的受试者以单次剂量或一系列剂量的一部分形式施用有效调节所述效应，或治疗或防治或改善所述病状的药剂的量。有效量可在个体间变化，取决于待治疗个体的健康和身体条件、待治疗个体的分类群、组合物的制剂、个体的医疗条件的评价以及其他相关因素。

“功效”是指产生所需效应的能力。

“表达”包括基因密码信息借以转化成细胞中存在且起作用的结构的所有功能。此类结构包括但不限于转录和翻译的产物。

“灶(Focus)”或“灶(foci)”是指包含C9ORF72转录物的核或细胞质体。在某些实施方案中，灶包含至少一种C9ORF72转录物。在某些实施方案中，C9ORF72灶包含转录物，所述转录物包含以下六核苷酸重复序列中的任一种：GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC和/或GGGGCG。

“完全互补”或“100％互补”是指第一核酸的每个核碱基在第二核酸中均具有互补核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物且靶核酸是第二核酸。

“缺口聚物(Gapmer)”是指其中具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中包含内部区域的核苷化学上不同于包含外部区域的核苷。内部区域可被称为“缺口”，且外部区域可被称为“翼”。

“六核苷酸重复序列扩增”是指重复至少两次的一系列六个碱基(例如，GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC)。在某些实施方案中，六核苷酸重复序列扩增可位于C9ORF72核酸的内含子1中。在某些实施方案中，致病性六核苷酸重复序列扩增包括C9ORF72核酸中GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC的至少30个、超过30个、超过100个、超过500个或超过1000个重复序列并且与疾病相关。在某些实施方案中，重复序列是连续的。在某些实施方案中，重复序列被1个或多个核碱基间断。在某些实施方案中，野生型六核苷酸重复序列扩增包括C9ORF72核酸中GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC的23个或更少重复序列。在某些实施方案中，重复序列是连续的。在某些实施方案中，重复序列被1个或多个核碱基间断。

“杂交”是指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和靶核酸。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸与核酸靶标。

“鉴别患有C9ORF72相关疾病的动物”是指鉴别已被诊断为患有C9ORF72相关疾病或易发展C9ORF72相关疾病的动物。易发展C9ORF72相关疾病的个体包括那些具有发展C9ORF72相关疾病的一种或多种风险因素的个体，所述风险因素包括具有一种或多种C9ORF72相关疾病的个人或家族病史或遗传易感性。这种鉴别可通过包括评估个体的医疗史和标准临床测试或评估(诸如遗传测试)的任何方法来实现。

“紧邻”是指在紧邻的要素之间没有插入要素。

“个体”是指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。

“抑制C9ORF72”是指降低C9ORF72 mRNA和/或蛋白质的水平或表达。在某些实施方案中，相较于在不存在C9ORF72反义化合物(诸如反义寡核苷酸)下C9ORF72 mRNA和/或蛋白质的表达水平，C9ORF72 mRNA和/或蛋白质水平在靶向C9ORF72的反义化合物(包括靶向C9ORF72的反义寡核苷酸)存在下得到抑制。

“抑制表达或活性”是指表达或活性的降低或阻断并且不一定表示表达或活性的完全消除。

“核苷间键联”是指核苷之间的化学键。

“连接的核苷”是指由核苷间键联连接在一起的相邻核苷。

“锁核酸”或“LNA”或“LNA核苷”是指在核苷糖单位的4'位置与2'位置之间具有连接两个碳原子、从而形成双环糖的桥的核酸单体。这种双环糖的实例包括但不限于A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH

如本文所述，LNA化合物包括但不限于，在所述糖的4’与2’位置之间具有至少一个桥的化合物，其中所述桥各自独立地包含1或2至4个独立地选自以下的连接基团：-[C(R

涵盖于LNA的定义内的4’-2’桥连基团的实例包括但不限于下式中的一个：-[C(R

根据本发明的LNA的定义内还包括如下LNA，其中核糖基糖环的2'-羟基连接至糖环的4'碳原子，从而形成亚甲基氧基(4’-CH

“错配”或“非互补核碱基”是指当第一核酸的核碱基不能与第二或靶核酸的对应核碱基配对的情况。

“修饰的核苷间键联”是指来自天然存在的核苷间键(即，磷酸二酯核苷间键)的取代或任何变化。

“修饰的核碱基”是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶的以外任何核碱基。“未修饰的核碱基”是指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。

“修饰的核苷”是指独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。

“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键联和/或修饰的核碱基的核苷酸。

“修饰寡核苷酸”意指包含至少一个修饰的核苷间键、修饰的糖和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。

“修饰的糖”是指来自天然糖部分的取代和/或任何变化。

“单体”是指低聚物的单个单元。单体包括但不限于天然存在或修饰的核苷和核苷酸。

“基序”是指反义化合物中未修饰的和修饰的核苷的型态。

“天然糖部分”是指DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中发现的糖部分。

“天然存在的核苷间键联”是指3'至5'磷酸二酯键联。

“非互补核碱基”是指彼此不形成氢键或以其他方式支持杂交的一对核碱基。

“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微RNA(miRNA)。

“核碱基”是指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。

“核碱基互补性”是指能够与另一核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基是指反义化合物中能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，如果反义化合物的某一位置上的核碱基能够与靶核酸的某一位置上的核碱基进行氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合的位置被认为在所述核碱基对上是互补的。

“核碱基序列”是指不依赖于任何糖、键联或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。

“核苷”是指连接至糖的核碱基。

“核苷模拟物”包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换糖或糖和碱基且不一定置换键联的那些结构，例如像具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物(例如非呋喃糖糖单位)的核苷模拟物。核苷酸模拟物包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换核苷和键联的那些结构，例如像肽核酸或吗啉代类(由-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键联连接的N-吗啉基)。糖替代物与稍微更广泛的术语核苷模拟物重叠，但仅旨在指示置换糖单位(呋喃糖环)。本文提供的四氢吡喃基环说明糖替代物的一个实例，其中呋喃糖糖基已被四氢吡喃基环系统置换。“模拟物”是指替代糖、核碱基和/或核苷间键联的基团。一般而言，使用模拟物替代糖或糖-核苷间键联组合，且维持核碱基以便与所选靶标杂交。

“核苷酸”是指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。

“脱靶效应”是指与调节除预期靶核酸以外的基因的RNA或蛋白质表达相关的不想要或有害的生物效应。

“低聚化合物”或“低聚物”是指具有连接的单体亚单位且能够与核酸分子的至少一个区杂交的聚合物。

“寡核苷酸”是指连接的核苷的聚合物，其中每个可以彼此独立地经修饰或未经修饰。

“胃肠外施用”是指通过注射(例如，快速浓注)或输注来施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。

“肽”是指通过由酰胺键连接至少两个氨基酸而形成的分子。如本文所用，“肽”是指多肽和蛋白质，而不限于此。

“药剂”是指当施用给个体时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向C9ORF72的反义寡核苷酸是药剂。

“药学上可接受的衍生物”涵盖本文所述的化合物的药学上可接受的盐、缀合物、前药或异构体。

“药学上可接受的盐”是指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即保留了母体寡核苷酸的所需生物活性并且不赋予其不希望的毒理学效应的盐。

“硫代磷酸酯键联”是指核苷之间的键联，其中磷酸二酯键通过用硫原子置换非桥联氧原子之一而被修饰。硫代磷酸酯键联为修饰的核苷间键联。

“部分”是指核酸的限定数目的连续(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的限定数目的连续核碱基。

“预防(Prevent)”或“预防(preventing)”是指延迟或阻止疾病、病症或病状的发作或发展持续数分钟到数天、数周到数月或无限期的时间段。

“前药”是指以非活性形式制备且在体内或其细胞内通过内源酶或其他化学物质或条件的作用转化成活性形式的治疗剂。

“防治有效量”是指向动物提供防治或预防益处的药剂的量。

“区”被定义为靶核酸中具有至少一个可鉴别的结构、功能或特征的部分。

“核糖核苷酸”是指在核苷酸的糖部分的2’位上具有羟基的核苷酸。核糖核苷酸可用多种取代基中的任一种进行修饰。

“盐”是指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即保留了母体寡核苷酸的所需生物活性并且不赋予其不希望的毒理学效应的盐。

“区段”被定义为靶核酸内的区的较小部分或子部分。

本文所教导的反义寡核苷酸的“缩短”或“截短”型式具有一个、两个或多个核苷缺失。

“副作用”是指可归因于治疗的除所需作用以外的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括但不限于注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌病。

“单链寡核苷酸”是指未与互补链杂交的寡核苷酸。“单链修饰的寡核苷酸”是指未与互补链杂交的修饰的寡核苷酸。

如本文所用的“位点”被定义为靶核酸内的独特核碱基位置。

“减缓进展”是指疾病发展的减少。

“可特异性地杂交”是指反义化合物在反义寡核苷酸与靶核酸之间具有足够的互补度以在需要特异性结合的条件下，即在体内测定及治疗性治疗的情况下于生理条件下诱导所需作用，而对非靶核酸展现极小的影响或无影响。

“严格杂交条件”或“严格条件”是指低聚化合物与其靶序列杂交，但与极少数目的其他序列杂交的条件。

“受试者”是指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。

“靶标”是指需要调节的蛋白质。

“靶基因”是指编码靶标的基因。

“靶向”或“靶向的”是指将与靶核酸特异性杂交并诱导所需效应的反义化合物的设计和选择的过程。

“靶核酸”、“靶RNA”和“靶RNA转录物”以及“核酸靶标”都是指能够由反义化合物靶向的核酸。

“靶区”是指靶核酸中由一种或多种反义化合物所靶向的部分。

“靶区段”是指反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。

“治疗有效量”是指向个体提供治疗益处的药剂的量。

“治疗(Treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指施用组合物以实现疾病或病状的改变或改善。

“未修饰的核碱基”是指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。

“未修饰的核苷酸”是指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间键联组成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸是RNA核苷酸(即β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即β-D-脱氧核糖核苷)。

“翼区段”是指被修饰来赋予寡核苷酸诸如抑制活性增强、对靶核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质的多个核苷。

某些实施方案

某些实施方案提供用于降低总C9ORF72 mRNA和蛋白质表达的组合物和方法。

某些实施方案提供用于减少C9ORF72致病相关mRNA变体的组合物和方法。

某些实施方案提供用于治疗、预防、改善有需要的个体中与C9ORF72相关的疾病或减缓所述疾病的进展的方法。还涵盖用于制备用以治疗、预防或改善与C9ORF72相关的疾病的药物的方法。C9ORF72相关疾病包括神经退行性疾病。在某些实施方案中，神经退行性疾病可以是ALS或FTD。在某些实施方案中，神经退行性疾病可以是家族性的或散发性的。

本公开提供以下非限制性编号的实施方案：

实施方案1.一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO：22-55的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。

实施方案2.如实施方案1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。

实施方案3.如实施方案1和2所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸是单链修饰的寡核苷酸。

实施方案4.如实施方案1-3中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。

实施方案5.如实施方案4所述的化合物，其中所述至少一个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

实施方案6.如实施方案4和5所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯键联。

实施方案7.如实施方案5所述的化合物，其中每个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

实施方案8.如实施方案1-7中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。

实施方案9.如实施方案8所述的化合物，其中所述修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。

实施方案10.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖。

实施方案11.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的每个核苷包含修饰的糖。

实施方案12.如实施方案10或11所述的化合物，其中所述至少一个修饰的糖是双环糖。

实施方案13.如实施方案12所述的化合物，其中所述双环糖包含在所述糖的4’位置与2’位置之间的化学桥，其中所述化学桥选自：4’-CH(R)-O-2’和4’-(CH

实施方案14.如实施方案13所述的化合物，其中所述化学桥是4’-CH(R)-O-2’，并且其中R是甲基。

实施方案15.如实施方案13所述的化合物，其中所述化学桥是4’-CH(R)-O-2’，并且其中R是H。

实施方案16.如实施方案13所述的化合物，其中所述化学桥是4’-CH(R)-O-2’，并且其中R是–CH

实施方案17.如实施方案10或11所述的化合物，其中所述至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基。

实施方案18.如实施方案1-10或12-16中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸是缺口聚物。

实施方案19.如实施方案18所述的化合物，其中所述缺口聚物是以下中的任一种：3-8-7MOE缺口聚物、3-10-7MOE缺口聚物、4-8-6MOE缺口聚物、4-10-6MOE缺口聚物、6-10-4MOE缺口聚物、6-8-4MOE缺口聚物、7-8-3MOE缺口聚物或7-10-3MOE缺口聚物。

实施方案20.如权利要求5所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含呈以下型态中的任一种的核苷间键联：soossssssssssooooss、sooossssssssssoooss、sooooossssssssssoss、soooooossssssssssss、soooosssssssssooss、sooosssssssssoooss、sooooosssssssssoss、soosssssssssoooss、soooosssssssssoss、sosssssssssooooss或sooooosssssssssss，其中，

s＝硫代磷酸酯键联，以及

o＝磷酸二酯键联。

实施方案19.一种组合物，其包含如前述实施方案中任一项所述的化合物或其盐，和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。

实施方案20.如实施方案19所述的组合物，其还包含C9ORF72反义转录物特异性抑制剂。

实施方案21.如实施方案20所述的组合物，其中所述C9ORF72反义转录物特异性抑制剂是反义化合物。

实施方案22.如实施方案21所述的组合物，其中所述反义化合物是修饰的寡核苷酸。

实施方案23.如实施方案22所述的组合物，其中所述修饰的寡核苷酸是单链的。

实施方案24.如实施方案22或23所述的组合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有与C9ORF72反义转录物至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补的核碱基序列。

实施方案25.如实施方案24所述的组合物，其中所述C9ORF72反义转录物具有SEQID NO：18的核碱基序列。

实施方案26.一种方法，其包括向动物施用如前述实施方案中任一项所述的化合物或组合物。

实施方案27.如实施方案26所述的方法，其中所述动物是人。

实施方案28.如实施方案26和27所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗、改善C9ORF72相关疾病或减缓所述疾病的进展。

实施方案29.如实施方案28所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病由六核苷酸重复序列扩增引起。

实施方案30.如实施方案28所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征和橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)。

实施方案31.如实施方案26-30所述的方法，其中所述施用减少核灶。

实施方案32.如实施方案26-31所述的方法，其中所述施用降低C9ORF72相关的RAN翻译产物的表达。

实施方案33.如实施方案32所述的方法，其中所述C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)中的任一种。

实施方案34.如实施方案1-33中任一项所述的化合物或组合物的用途，其用于制造用于治疗神经退行性病症的药物。

实施方案35.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案36.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案37.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案38.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案39.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案40.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案41.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案42.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案43.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够降低哺乳动物中的人C9ORF72 mRNA或蛋白质表达。

实施方案44.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够改善肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征或橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)的至少一种症状。

实施方案45.如实施方案44所述的化合物或组合物，其中所述ALS症状是运动缺陷、焦虑和去神经支配中的任一种。

实施方案46.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够延迟疾病进展。

实施方案47.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够延长存活。

实施方案48.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够减少C9ORF72相关的RAN翻译产物。

实施方案49.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够选择性地减少C9ORF72致病相关mRNA变体。

实施方案50.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够减少核灶。

实施方案51.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案52.一种方法，其包括向动物施用如实施方案51所述的化合物。

实施方案53.如实施方案52所述的方法，其中所述动物是人。

实施方案54.如实施方案53所述的方法，其中所述施用抑制C9ORF72。

实施方案55.如实施方案53所述的方法，其中所述施用预防、治疗、改善C9ORF72相关疾病或减缓所述疾病的进展。

实施方案56.如实施方案55所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病由六核苷酸重复序列扩增引起。

实施方案57.如实施方案55所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征或橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)中的任一种。

实施方案58.如实施方案53所述的方法，其中所述施用减少核灶。

实施方案59.如实施方案53所述的方法，其中所述施用降低C9ORF72相关的RAN翻译产物的表达。

实施方案60.如实施方案59所述的方法，其中所述C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)中的任一种。

实施方案61.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案62.一种方法，其包括向动物施用如实施方案60所述的组合物。

实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述动物是人。

实施方案64.如实施方案63所述的方法，其中所述施用抑制C9ORF72。

实施方案65.如实施方案62所述的方法，其中所述施用预防、治疗、改善C9ORF72相关疾病或减缓所述疾病的进展。

实施方案66.如实施方案65所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病由六核苷酸重复序列扩增引起。

实施方案67.如实施方案65所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征或橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)中的任一种。

实施方案68.如实施方案63所述的方法，其中所述施用减少核灶。

实施方案69.如实施方案63所述的方法，其中所述施用降低C9ORF72相关的RAN翻译产物的表达。

实施方案70.如实施方案69所述的方法，其中所述C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)中的任一种。

反义化合物

低聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸和siRNA。低聚化合物可以是靶核酸的“反义序列”，意味着其能够与靶核酸经由氢键合进行杂交。

在某些实施方案中，反义化合物具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。在某些这类实施方案中，反义寡核苷酸具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物的长度是12至30个亚单位。换言之，此类反义化合物是12至30个连接的亚单位。在其他实施方案中，反义化合物是8至80个、12至50个、15至30个、18至24个、19至22个或20个连接的亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度是8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个或80个连接的亚单位，或处于由上述值中的任何两个界定的范围内。在一些实施方案中，反义化合物是反义寡核苷酸，且连接的亚单位是核苷。

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义寡核苷酸可以是缩短或截短的。举例来说，单个亚单位可自5'端缺失(5'截短)，或者可替代地自3'端缺失(3'截短)。靶向C9ORF72核酸的缩短或截短的反义化合物可具有自反义化合物的5'端缺失的两个亚单位，或者可替代地可具有自反义化合物的3'端缺失的两个亚单位。或者，缺失的核苷可散布于整个反义化合物中，例如在5'端有一个核苷缺失和3'端有一个核苷缺失的反义化合物中。

当单个额外亚单位存在于延长的反义化合物中时，所述额外亚单位可位于反义化合物的5'或3'端处。当存在两个或多个额外亚单位时，所添加的亚单位可彼此邻近，例如在反义化合物的5'端上添加有两个亚单位(5'添加)或可替代地3'端上添加有两个亚单位(3'添加)的反义化合物中。或者，所添加的亚单位可散布于整个反义化合物中，例如在5'端上添加有一个亚单位和3'端上添加有一个亚单位的反义化合物中。

有可能增加或减少反义化合物(如反义寡核苷酸)的长度和/或引入错配碱基而不消除活性。例如，在Woolf等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992)中，测试长度为13-25个核碱基的一系列反义寡核苷酸在卵母细胞注射模型中诱导靶RNA裂解的能力。长度为25个核碱基且在接近反义寡核苷酸的末端处具有8或11个错配碱基的反义寡核苷酸能够导引靶mRNA进行特异性裂解，但程度低于不含错配的反义寡核苷酸。同样，靶标特异性裂解可使用具有13个核碱基的反义寡核苷酸(包括具有1或3个错配者)达成。

Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,2001年3月)证明与bcl-2mRNA具有100％互补性且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外及体内减少bcl-2及bcl-xL两者的表达的能力。此外，这个寡核苷酸展现有效的体内抗肿瘤活性。

Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)分别测试一系列具有14个核碱基的串联反义寡核苷酸以及包含所述串联反义寡核苷酸中的两个或三个的序列的具有28个及42个核碱基的反义寡核苷酸在家兔网状红血球测定中阻止人DHFR转译的能力。3个具有14个核碱基的反义寡核苷酸各自能够单独抑制转译，但程度相较于具有28个或42个核碱基的反义寡核苷酸而言更适中。

反义化合物基序

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有排列成一定型态或基序的化学上修饰的亚单位，以赋予反义化合物诸如抑制活性增强、对靶核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质。

嵌合反义化合物通常含有至少一个修饰的以赋予增强的核酸酶降解抗性、增加的细胞吸收、增强的对靶核酸的结合亲和力和/或增强的抑制活性的区。嵌合反义化合物的第二区可任选地用作细胞核酸内切酶RNA酶H的底物，所述酶裂解RNA:DNA双螺旋体的RNA链。

具有缺口聚物基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在缺口聚物中，具有多个支持RNA酶H裂解的核苷酸的内部区位于具有多个在化学上与内部区的核苷不同的核苷酸的外部区之间。在具有缺口聚物基序的反义寡核苷酸的状况下，缺口区段一般用作核酸内切酶裂解的底物，而翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的区由构成每个相异区的糖部分的类型来区分。用于区分缺口聚物的各区的糖部分的类型在一些实施方案中可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'-修饰的核苷(所述2'-修饰的核苷可尤其包括2'-MOE和2’-O-CH

在某些实施方案中，反义化合物具有“翼聚体(wingmer)”基序，其具有翼-缺口或缺口-翼构型，即如上文对于缺口聚物构型所述的X-Y或Y-Z构型。因此，本文所述的翼聚体构型包括但不限于例如5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、5-13、5-8或6-8。

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有5-10-5缺口聚物基序。

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有5-8-5缺口聚物基序。

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有呈以下型态中的任一种的糖修饰：eeekkdddddddkkeee、eekkddddddddkkeee、ekddddddddekekeee、kekeddddddddekeke和ekekddddddddkekee；其中，

e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷

d＝2’-脱氧核苷，以及

k＝cEt核苷。

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有缺口缩窄的基序。在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的缺口缩窄的反义寡核苷酸具有位于紧邻且介于5、4、3、2或1个化学修饰的核苷的翼区段之间的9、8、7或6个2’-脱氧核苷酸的缺口区段。在某些实施方案中，化学修饰包含双环糖。在某些实施方案中，双环糖包含选自以下的4’至2’桥：4’-(CH

靶核酸、靶区域和核苷酸序列

编码C9ORF72的核苷酸序列包括但不限于以下：GENBANK登录号NM_001256054.1(作为SEQ ID NO：1并入本文)的补体、从核碱基27535000至27565000截短的GENBANK登录号NT_008413.18(作为SEQ ID NO：2并入本文)的补体、GENBANK登录号BQ068108.1(作为SEQID NO：3并入本文)、GENBANK登录号NM_018325.3(作为SEQ ID NO：4并入本文)、GENBANK登录号DN993522.1(作为SEQ ID NO：5并入本文)、GENBANK登录号NM_145005.5(作为SEQ IDNO：6并入本文)、GENBANK登录号DB079375.1(作为SEQ ID NO：7并入本文)、GENBANK登录号BU194591.1(作为SEQ ID NO：8并入本文)、序列标识符4141_014_A(作为SEQ ID NO：9并入本文)和序列标识符4008_73_A(作为SEQ ID NO：10并入本文)、以及从核苷8522000至8552000截短的GENBANK登录号NW_001101662.1(作为SEQ ID NO：11并入本文)。

应了解，本文中所含的实例中的各SEQ ID NO中所列的序列与糖部分、核苷间键联或核碱基的任何修饰无关。因而，由SEQ ID NO定义的反义化合物可独立地包含糖部分、核苷间键联或核碱基的一个或多个修饰。由Isis编号(Isis No)描述的反义化合物指示核酸碱基序列与基序的组合。

在某些实施方案中，靶区域为靶核酸的结构明确的区。例如，靶区域可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接合部、编码区、翻译起始区、翻译终止区，或其他所定义的核酸区域。关于C9ORF72的结构上定义的区域可通过登录号从序列数据库如NCBI获得并且所述信息以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，靶区域可涵盖从靶区域内一个靶区段的5’靶位点到同一靶区域内另一靶区段的3’靶位点的序列。

靶向包括确定至少一个与反义化合物杂交，从而出现所需作用的靶区段。在某些实施方案中，所需作用为mRNA靶核酸水平降低。在某些实施方案中，所需作用为由靶核酸编码的蛋白质水平的降低或与靶核酸有关的表型改变。

靶区域可含有一个或多个靶区段。靶区域内的多个靶区段可重叠。或者，它们可不相重叠。在某些实施方案中，靶区域内的靶区段相隔至多约300个核苷酸。在某些实施方案中，靶区域内的靶区段相隔靶核酸上一定数目的核苷酸，所述数目为、为约、为至多、为至多约250个、200个、150个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个或10个核苷酸，或为由前述任何两个值所界定的范围。在某些实施方案中，靶区域内的靶区段相隔靶核酸上的至多或至多约5个核苷酸。在某些实施方案中，靶区段为连续的。涵盖由具有为本文所列的5'靶位点或3'靶位点中的任一个的起始核酸的范围所界定的靶区。

适合的靶区段可见于5'UTR、编码区、3'UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接合点内。含有起始密码子或终止密码子的靶区段也为适合的靶区段。适合的靶区段可尤其排除某一结构明确的区，诸如起始密码子或终止密码子。

确定适合的靶区段可包括将靶核酸的序列与整个基因组中的其他序列相比较。举例来说，可使用BLAST算法来鉴别不同核酸当中具相似性的区域。这个比较可预防选择可能以非特异性方式与除所选靶核酸以外的序列(即非靶或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。

反义化合物在靶区内的活性(例如如由靶核酸水平的降低百分比所定义)可能不同。在某些实施方案中，C9ORF72 mRNA水平的降低指示对C9ORF72表达的抑制。C9ORF72蛋白质水平的降低还指示靶mRNA表达的抑制。扩增的C9ORF72 RNA灶的存在减少指示对C9ORF72表达的抑制。此外，表型改变指示对C9ORF72表达的抑制。例如，改善的运动功能和呼吸可指示对C9ORF72表达的抑制。

杂交

在一些实施方案中，在本文公开的反义化合物与C9ORF72核酸之间进行杂交。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键键结(例如沃森-克里克、霍氏或反霍氏氢键键结)。

杂交可在不同条件下进行。严格条件具序列依赖性且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。

确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法在本领域中是熟知的。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与C9ORF72核酸特异性杂交。

互补性

当反义化合物中足够数目的核碱基可与靶核酸中的相应核碱基进行氢键合，从而出现所需作用(例如对靶核酸(诸如C9ORF72核酸)的反义抑制)时，反义化合物与靶核酸彼此互补。

可容忍反义化合物与C9ORF72核酸之间的非互补性核碱基，前提是所述反义化合物仍能够与靶核酸特异性杂交。此外，反义化合物可在C9ORF72核酸的一个或多个区段上杂交，以使得介入或相邻区段不参与杂交事件(例如环结构、错配或发夹结构)。

在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与C9ORF72核酸、靶区、靶区段或其指定部分为或为至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。反义化合物与靶核酸的互补性百分比可使用常规方法测定。

举例来说，反义化合物中反义化合物的20个核碱基中有18个核碱基与靶区互补且因此特异性杂交将表示90％互补性。在这个实例中，其余非互补核碱基可与互补核碱基丛集或交替并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因此，长18个核碱基并且具有4(四)个非互补核碱基且所述非互补核碱基侧接有两个与靶核酸完全互补的区的反义化合物将与靶核酸具有77.8％总体互补性且因此将处于本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区域的互补性百分比可常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜寻工具)和PowerBLAST程序来测定(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403410；Zhang和Madden，Genome Res.,1997,7,649 656)。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)的算法的Gap程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用默认设置来测定。

在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与靶核酸或其指定部分完全互补(即，100％互补)。例如，反义化合物可与C9ORF72核酸或其靶区域或靶区段或靶序列完全互补。本文所用的“完全互补”是指反义化合物的每个核碱基皆能够与靶核酸的相应核碱基进行准确碱基配对。举例来说，具有20个核碱基的反义化合物与长度为400个核碱基的靶序列完全互补，只要靶核酸中有具有20个核碱基的相应部分与反义化合物完全互补即可。完全互补还可参考第一和/或第二核酸的指定部分来使用。举例来说，具有30个核碱基的反义化合物中的20个核碱基的部分可与长度为400个核碱基的靶序列“完全互补”。具有30个核碱基的寡核苷酸中的20个核碱基的部分在靶序列具有含20个核碱基且每个核碱基与反义化合物中的所述20个核碱基的部分互补的相应部分的情况下与靶序列完全互补。同时，整个具有30个核碱基的反义化合物与靶序列可能完全互补或可能不是完全互补，这取决于反义化合物的其余10个核碱基是否也与靶序列互补。

非互补核碱基的位置可处于反义化合物的5'端或3'端处。或者，一个或多个非互补核碱基可处于反义化合物的内部位置处。当存在两个或多个非互补核碱基时，它们可为连续(即连接的)或不连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于缺口聚物反义寡核苷酸的翼段中。

在某些实施方案中，长度为或为达12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(诸如C9ORF72核酸)或其指定部分包含至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。

在某些实施方案中，长度为或为达12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核碱基的反义化合物相对于靶核酸(诸如C9ORF72核酸)或其指定部分包含至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。

本文提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的反义化合物。本文所用的“部分”是指靶核酸的区或段内确定数目的连续(即连接的)核碱基。“部分”还可指反义化合物中确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少9个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少11个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少13个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少14个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少15个核碱基的部分互补。还涵盖与靶区段中具有至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个(或由这些值中的任何两个所界定的范围)核碱基的部分互补的反义化合物。

同一性

本文提供的反义化合物还可与特定核苷酸序列SEQ ID NO或由特定Isis编号表示的化合物或其部分具有确定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，那么其与本文公开的序列同一。举例来说，在所公开的DNA序列中含有尿嘧啶代替胸苷的RNA将被视作与DNA序列同一，因为尿嘧啶和胸苷皆与腺嘌呤配对。还涵盖本文所述的反义化合物的缩短及延长型式以及相对于本文提供的反义化合物具有不一致碱基的化合物。不一致碱基可彼此相邻或散布于整个反义化合物中。反义化合物的同一性百分比是根据相对于与其比较的序列具有同一碱基配对的碱基的数目来计算的。

在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在某些实施方案中，将反义化合物的一部分与靶核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核碱基的部分与靶核酸的等长部分相比较。

在某些实施方案中，将反义寡核苷酸的一部分与靶核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核碱基的部分与靶核酸的等长部分相比较。

修饰

核苷为碱基-糖组合。核苷的核碱基(又称为碱基)部分通常为杂环碱基部分。核苷酸为还包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可连接至糖的2'、3'或5'羟基部分。寡核苷酸是经由相邻核苷彼此共价键联形成线性聚合寡核苷酸而形成的。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常被视作形成寡核苷酸的核苷间键联。

反义化合物的修饰涵盖核苷间键联、糖部分或核碱基的取代或改变。修饰的反义化合物常因具有如以下的所需性质而优于原生形式：细胞吸收增强、对核酸靶标的亲和力增强、在核酸酶存在下的稳定性增强或抑制活性增强。

化学上修饰的核苷还可用于增强缩短或截短型反义寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，常可以具有所述化学上修饰的核苷的较短反义化合物获得类似结果。

修饰的核苷间键联

RNA和DNA的天然存在的核苷间键联为3'至5'磷酸二酯键联。相较于具有天然存在的核苷间键联的反义化合物，具有一个或多个修饰的(即非天然存在)的核苷间键联的反义化合物常会因具有所需性质(如细胞吸收增强、对靶核酸的亲和力增强及在核酸酶存在下的稳定性增强)而被优先选择。

具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具磷原子的核苷间键联。代表性含磷的核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯。制备含磷键及不含磷键的方法为熟知的。

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联散布于整个反义化合物中。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，反义化合物的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物包含至少一个磷酸二酯键联和至少一个硫代磷酸酯键联。

在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有呈以下型态中的任一种的核苷间键联：soooossssssssssooss、sooosssssssssooss、soosssssssssooss和sosssssssssoooss；其中，

s＝硫代磷酸酯键联，以及

o＝磷酸二酯键联。

修饰的糖部分

本发明的反义化合物可任选含有其中糖基已被修饰的一个或多个核苷。所述糖修饰的核苷可赋予反义化合物以增强的核酸酶稳定性、增强的结合亲和力或某种其他有利生物性质。在某些实施方案中，核苷包含化学上修饰的呋喃核糖环部分。化学上修饰的呋喃核糖环的实例包括不限于添加取代基(包括5'及2'取代基)；非偕位环原子桥连形成双环核酸(BNA)；核糖基环氧原子用S、N(R)或C(R

具有修饰的糖部分的核苷的实例包括不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH

本文所用的“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核酸(BNA)的实例包括不限于在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包含一个或多个BNA核苷，其中桥包含下式中的一个：4'-(CH

其他双环核苷已经在公开的文献中进行了报道(参见例如：Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Frieden等人，Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372；Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人，Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum等人，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；美国专利号：7,399,845；7,053,207；7,034,133；6,794,499；6,770,748；6,670,461；6,525,191；6,268,490；美国专利公布号：US2008-0039618；US2007-0287831；US2004-0171570；美国专利申请序列号：12/129,154；61/099,844；61/097,787；61/086,231；61/056,564；61/026,998；61/026,995；60/989,574；国际申请WO 2007/134181；WO2005/021570；WO 2004/106356；以及PCT国际申请号：PCT/US2008/068922；PCT/US2008/066154；和PCT/US2008/064591)。上述各双环核苷可被制备而具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(参见1999年3月25日公开为WO99/14226的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。

如本文所用，“单环核苷”是指包含不为双环糖部分的修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置上被修饰或取代。

本文所用的“4'-2'双环核苷”或“4'至2'双环核苷”是指包含含连接2'碳原子与4'碳原子的桥基的呋喃糖环的双环核苷。

在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在呋喃戊糖基糖部分的4'与2'碳原子之间具有至少一个桥的化合物，所述桥包括但不限于包含1个或1至4个独立地选自以下的连接基团的桥：-[C(R

各J

在某些实施方案中，双环糖部分的桥是-[C(R

在某些实施方案中，双环核苷进一步由异构构型定义。例如，包含4'-(CH

在某些实施方案中，双环核苷包括具有4'至2'桥的那些，其中此类桥包括但不限于α-L-4'-(CH

在某些实施方案中，双环核苷具有式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

-Q

R

T

在某些实施方案中，双环核苷具有式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T

Z

在一个实施方案中，每个取代的基团独立地被独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、氧代、羟基、OJ

在某些实施方案中，双环核苷具有式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T

Z

在某些实施方案中，双环核苷具有式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T

R

各q

在某些实施方案中，双环核苷具有式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T

q

或q

q

已描述了具有4'-CH

还已制备具有4'至2'桥连基团诸如4'-CH

在某些实施方案中，双环核苷具有式：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T

各q

q

一种具有4'-(CH

在某些实施例中，双环核苷包括但不限于如下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH

其中Bx为碱基部分且R独立地为H、保护基团、C

如本文所用，“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”是指具有取代普通核苷中的呋喃戊糖基残基的6元四氢吡喃“糖”的核苷并且也可以称为糖替代物。修饰的THP核苷包括但不限于在本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)或具有如下所示的四氢吡喃环系统的氟HNA(F-HNA)。

在某些实施方案中，选择具有下式的糖替代物：

其中：

Bx为杂环碱基部分；

T

q

R

在某些实施方案中，q

在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如包含吗啉代糖部分的核苷以及它们在低聚化合物中的用途已有所报道(参见例如：Braasch等人，Biochemistry,2002,41,4503-4510；和美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444以及5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”是指具有以下式的糖替代物：

在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。

还提供了修饰的组合，不限于如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其他公开的5',2'-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO2008/101157)和用S替代核糖基环氧原子以及在2'-位上的进一步取代(参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5'-取代(参见11/22/07公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH

在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个修饰的环己烯基核苷，其为用六元环己烯基替代天然存在的核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷。修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中描述的那些(参见例如共同拥有的已公布的2010年4月10日公布的PCT申请WO2010/036696；Robeyns等人，J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等人，Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等人，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等人，Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等人，Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等人，Acta Crystallographica,Section F：Structural Biology and CrystallizationCommunications,2005,F61(6),585-586；Gu等人，Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123；Gu等人，Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang等人，J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等人，Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等人，J.Org.Chem.,2001,66,8478-82；Wang等人，Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788；Wang等人，J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；已公布的PCT申请WO06/047842；以及已公布的PCT申请WO 01/049687；其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。某些修饰的环己烯基核苷具有式X。

其中独立地对于所述至少一种式X的环己烯基核苷类似物中的每一个：

Bx为杂环碱基部分；

T

q

许多其他单环、双环和三环的环系统为本领域中已知的并且适合作为可用来修饰用于并入本文所提供的低聚化合物中的核苷的糖替代物(参见，例如，综述文章：Leumann,Christian J.Bioorg.&Med.Chem.,2002,10,841-854)。可对所述环系统进行各种其他的取代以进一步增强活性。

如本文所用，“2’-修饰的糖”是指在2’位上修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，所述修饰包括选自以下的取代基：包括但不限于卤基、取代和未取代的烷氧基、取代和未取代的硫烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基、取代和未取代的烯丙基以及取代和未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH

本文所用的“2'-修饰的核苷”或“2'-取代的核苷”是指包含在2'位上包含除H或OH以外的取代基的糖的核苷。2'-修饰的核苷包括但不限于其中连接糖环的两个碳原子的桥连接糖环的2'碳与另一个碳的双环核苷以及具有如以下的非桥连2'取代基的核苷：烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C

本文所用的“2’-F”是指包括在糖环的2'位上包含氟基的糖的核苷。

本文所用的“2’-OMe”或“2’-OCH

本文所用的“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH

用于制备修饰的糖的方法为本领域技术人员所熟知。教导此类修饰的糖的制备的一些代表性美国专利包括但不限于U.S.：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,670,633；5,700,920；5,792,847和6,600,032，以及2005年6月2日提交且2005年12月22日公布为WO 2005/121371的国际申请PCT/US2005/019219，并且其各自以引用的方式整体并入本文。

本文所用的“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一或多个是修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。

在具有修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然、修饰的或其组合)被维持以便与适当核酸靶标杂交。

在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的糖部分为2'-MOE。在某些实施方案中，2'-MOE修饰的核苷酸排列于缺口聚物基序中。在某些实施方案中，修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH

用于配制药物组合物的组合物和方法

反义化合物可与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或所施用的剂量。

靶向C9ORF72核酸的反义化合物可通过将反义化合物与适合的药学上可接受的稀释剂或载体组合而用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)。PBS是适用于以胃肠外方式递送的组合物中的稀释剂。因此，在一个实施方案中，在本文所述的方法中使用包含靶向C9ORF72核酸的反义化合物及药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为PBS。在某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸。

包含反义化合物的药物组合物涵盖在动物(包括人)施用时能够提供(直接或间接)其生物活性代谢物或残余物的任何药学上可接受的盐、酯或所述酯的盐，或任何其他寡核苷酸。因此，例如，本公开还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、所述前药的药学上可接受的盐以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。

前药可包括在反义化合物的一端或两端上并入可由体内内源性核酸酶裂解而形成活性反义化合物的额外核苷。

缀合的反义化合物

反义化合物可共价连接至一个或多个增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的部分或缀合物。典型缀合物基团包括胆固醇部分和脂质部分。额外的缀合物基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、啡嗪、叶酸盐、啡啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。

反义化合物还可被修饰以具有一个或多个稳定化基团，所述一个或多个稳定化基团一般连接至反义化合物的一端或两端以增强如核酸酶稳定性的性质。在稳定化基团中包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免遭核酸外切酶降解，且可有助于递送和/或定位于细胞内。帽可存在于5'端(5'帽)或3'端(3'帽)上，或可存在于这两端上。帽结构在本领域中为熟知的且包括例如反向脱氧无碱基帽。其他可用于对反义化合物的一端或两端进行封端以赋予核酸酶稳定性的3'及5'-稳定化基团包括2003年1月16日公开的WO 03/004602中所公开的那些基团。

细胞培养和反义化合物处理

可在多种细胞类型中体外测试反义化合物对C9ORF72核酸的水平、活性或表达的作用。用于所述分析的细胞类型可获自商业供货商(例如American Type CultureCollection,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC；CloneticsCorporation,Walkersville,MD)且根据供货商的说明书使用商购的试剂(例如InvitrogenLife Technologies,Carlsbad,CA)培养细胞。说明性细胞类型包括但不限于HepG2细胞、Hep3B细胞及初级肝细胞。

体外测试反义寡核苷酸

本文描述用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可被适当修改以用于用其他反义化合物进行的处理。

通常，当细胞在培养中达到约60％-80％汇合度时，用反义寡核苷酸处理细胞。

一种通常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子型脂质转染试剂LIPOFECTIN(Invitrogen,Carlsbad,CA)。可将反义寡核苷酸与LIPOFECTIN在OPTI-MEM 1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需最终浓度及通常在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的LIPOFECTIN浓度。

另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括LIPOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在OPTI-MEM 1血清减少型培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需浓度及通常在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的LIPOFECTAMINE浓度。

另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括电穿孔。

通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。通常在反义寡核苷酸处理后16至24小时收获细胞，此时通过本领域中已知及本文所述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平。一般来说，当在多次重复实验中进行处理时，数据呈现为重复处理的平均值。

所用的反义寡核苷酸浓度在细胞系之间有所不同。确定用于特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法在本领域中为熟知的。当用LIPOFECTAMINE转染时，通常使用浓度在1nM至300nM范围内的反义寡核苷酸。当使用电穿孔进行转染时，使用625nM至20,000nM范围内的较高浓度的反义寡核苷酸。

RNA分离

可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA是使用本领域中熟知的方法，例如使用TRIZOL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根据制造商推荐的方案来制备。

目标水平或表达的抑制的分析

对C9ORF72核酸的水平或表达的抑制可以本领域中已知的多种方式来测定。举例来说，靶核酸水平可通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来定量。可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA印迹分析在本领域中也是常规的。定量实时PCR可以使用可从PE-Applied Biosystems,FosterCity,CA商购，并根据制造商说明书来使用的市售ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统来方便地完成。

对目标RNA水平的定量实时PCR分析

可通过定量实时PCR，使用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)根据制造商说明书来对靶RNA水平进行定量。定量实时PCR的方法在本领域中为熟知的。

在实时PCR之前，使分离的RNA经历逆转录酶(RT)反应，产生互补的DNA(cDNA)，其接着用作实时PCR扩增的底物。在同一样品孔中依序进行RT和实时PCR反应。RT和实时PCR试剂可获自Invitrogen(Carlsbad,CA)。RT实时PCR反应通过本领域技术人员熟知的方法进行。

通过实时PCR获得的基因(或RNA)目标量是使用表达恒定的基因(如亲环素A(cyclophilin A))的表达水平或通过使用RIBOGREEN(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)定量总RNA来标准化。亲环素A表达是通过实时PCR，通过与目标同时操作、复合操作或分开操作来定量。总RNA是使用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen,Inc.Eugene,OR)来定量。通过RIBOGREEN定量RNA的方法是教导于Jones,L.J.等人，(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中。使用CYTOFLUOR 4000仪器(PE Applied Biosystems)来测量RIBOGREEN荧光。

探针和引物被设计来与C9ORF72核酸杂交。用于设计实时PCR探针和引物的方法在本领域中是熟知的，且可包括使用软件，如PRIMER EXPRESS软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)。

分析蛋白质水平

对C9ORF72核酸的反义抑制可通过测量C9ORF72蛋白质水平来评估。C9ORF72的蛋白质水平可以本领域中熟知的多种方式来评价或定量，如免疫沉淀法、蛋白质印迹分析(免疫印迹法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如卡斯蛋白酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选法(FACS)。针对靶标的抗体可被识别且获自多种来源，如MSRS抗体目录(Aerie Corporation,Birmingham,MI)，或可经由本领域中熟知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法来制备。适用于检测小鼠、大鼠、猴和人C9ORF72的抗体是可商购的。

体内测试反义化合物

在动物体内测试反义化合物(例如反义寡核苷酸)以评估它们抑制C9ORF72表达和产生表型改变(诸如，改善的运动功能和呼吸)的能力。在某些实施方案中，在动物中通过旋转杆、握力、爬杆、旷场表现、平衡木、后爪足迹测试来测量运动功能。在某些实施方案中，通过动物中的全身体积描记器、侵入性阻力和顺应性测量来测量呼吸。可在正常动物或实验疾病模型中进行测试。为了向动物施用，在药学上可接受的稀释剂如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或人工脑脊液(aCSF)中配制反义寡核苷酸。施用包括胃肠外施用途径，如腹膜内、静脉内和皮下，以及中心施用途径，如脑室内或鞘内。计算反义寡核苷酸剂量和给药频率在本领域技术人员的能力范围内，且取决于如施用途径及动物体重的因素。在用反义寡核苷酸处理一段时间后，自CNS组织或CSF分离RNA且测量C9ORF72核酸表达的改变。

靶向C9ORF72

本文所述的反义寡核苷酸可在RNA加工的任何阶段与C9ORF72核酸杂交。例如，本文描述与前体mRNA或成熟mRNA互补的反义寡核苷酸。此外，本文所述的反义寡核苷酸可与C9ORF72核酸的任何元件杂交。例如，本文描述与C9ORF72核酸的外显子、内含子、5'UTR、3'UTR、重复区、六核苷酸重复序列扩增、剪接接合点、外显子:外显子剪接接合点、外显子剪接沉默子(ESS)、外显子剪接增强子(ESE)、外显子1a、外显子1b、外显子1c、外显子1d、外显子1e、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9或内含子10互补的反义寡核苷酸。

在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸与C9ORF72的所有变体杂交。在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸与C9ORF72的某些变体选择性地杂交。在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸与C9ORF72的含有六核苷酸重复序列扩增的变体选择性地杂交。在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸与含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体选择性地杂交。在某些实施方案中，C9ORF72的含有六核苷酸重复序列扩增的前体mRNA变体包括SEQ ID NO：1-3和6-10。在某些实施方案中，这种六核苷酸重复序列扩增包含GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC或GGGGCG中的任一种的至少24个重复序列。

在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸抑制C9ORF72的所有变体的表达。在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸同等地抑制C9ORF72的所有变体的表达。在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸优先抑制C9ORF72的一种或多种变体的表达。在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸优先抑制C9ORF72的含有六核苷酸重复序列扩增的变体的表达。在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸选择性地抑制含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体的表达。在某些实施方案中，本文所述的反义寡核苷酸选择性地抑制C9ORF72致病相关mRNA变体的表达。在某些实施方案中，C9ORF72的含有六核苷酸重复序列扩增的前体mRNA变体包括SEQ ID NO：1-3和6-10。在某些实施方案中，这种六核苷酸重复序列扩增包含GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC或GGGGCG中的任一种的至少24个重复序列。在某些实施方案中，六核苷酸重复序列扩增形成核灶。在某些实施方案中，本文描述的反义寡核苷酸适用于减少核灶。核灶可就具有病灶的细胞的百分比以及每个细胞的病灶数量而言来减少。

某些致病相关变体的选择性抑制

在本文的某些实例中，引物探针集RTS3905检测从含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体加工的mRNA变体(例如NM_001256054.1)。mRNA变体从含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体(即，“C9ORF72致病相关mRNA变体”)加工。当前体mRNA的转录在从外显子1A的起始位点至外显子1B的起始位点的区域，例如，基因组序列(SEQ ID NO：2，从核苷酸27535000至27565000截短的GENBANK登录号NT_008413.18的补体)的核苷酸1107至1520中开始时，前体mRNA包含六核苷酸重复序列。在此区域中设计寡核苷酸以选择性地靶向含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体。RTS3905测量含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体的mRNA产物(即C9ORF72致病相关mRNA变体)，且因此测量含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体的减少。

C9ORF72特征

本文所述的反义寡核苷酸可在C9ORF72基因的任何元件内的任何加工状态下与任何C9ORF72变体杂交。例如，本文所述的反义寡核苷酸可与外显子、内含子、5'UTR、3'UTR、重复区、六核苷酸重复序列扩增、剪接接合点、外显子:外显子剪接接合点、外显子剪接沉默子(ESS)、外显子剪接增强子(ESE)、外显子1a、外显子1b、外显子1c、外显子1d、外显子1e、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9或内含子10杂交。例如，反义寡核苷酸可靶向针对下文描述的各种C9ORF72变体在下面表1-5中表征的任何外显子。本文所述的反义寡核苷酸还可靶向未在下文表征的变体，并且此类变体在GENBANK中表征。此外，本文所述的反义寡核苷酸还可靶向除外显子以外的元件，并且此类元件在GENBANK中表征。

表1

NM_001256054.1(SEQ ID NO：1)的功能区段

表2

NM_018325.3(SEQ ID NO：4)的功能区段

表3

NM_145005.5(SEQ ID NO：6)的功能区段

表4

DB079375.1(SEQ ID NO：7)的功能区段

表5

BU194591.1(SEQ ID NO：8)的功能区段

某些适应症

在某些实施方案中，本文提供治疗个体的方法，所述方法包括施用本文所述的一种或多种药物组合物。在某些实施方案中，个体患有神经退行性疾病。在某些实施方案中，个体处于发展神经退行性疾病(包括但不限于ALS或FTD)的风险中。在某些实施方案中，个体已被鉴定为患有C9ORF72相关疾病。在某些实施方案中，本文提供用于预防性减少个体的C9ORF72表达的方法。某些实施方案包括通过向个体施用治疗有效量的靶向C9ORF72核酸的反义化合物来治疗有需要的个体。

在一个实施方案中，施用治疗有效量的靶向C9ORF72核酸的反义化合物伴随监测个体中的C9ORF72水平以测定个体对施用反义化合物的反应。个体对施用反义化合物的反应可由医师用于确定治疗性干预的量及持续时间。

在某些实施方案中，施用靶向C9ORF72核酸的反义化合物导致C9ORF72表达降低至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或由这些值中的任两个所限定的范围。在某些实施方案中，在动物中施用靶向C9ORF72核酸的反义化合物导致改善的运动功能和呼吸。在某些实施方案中，施用C9ORF72反义化合物使运动功能和呼吸改善至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或由这些值中的任意两个所限定的范围。

在某些实施方案中，包含靶向C9ORF72的反义化合物的药物组合物用于制备用以治疗患有或易患神经退行性疾病(包括ALS和FTD)的患者的药物。

某些组合疗法

在某些实施方案中，本文描述的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂共同施用。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药剂被设计来与本文所述的一种或多种药物组合物治疗相同疾病、病症或条件。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药剂被设计来与本文所述的一种或多种药物组合物治疗不同疾病、病症或条件。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药剂被设计来治疗本文所述的一种或多种药物组合物的不期望的副作用。在某些实施方案中，本文描述的一种或多种药物组合物与另一药剂共同施用以治疗所述另一药剂的不期望的作用。在某些实施方案中，本文描述的一种或多种药物组合物与另一药剂共同施用来产生组合作用。在某些实施方案中，本文描述的一种或多种药物组合物与另一药剂共同施用来产生协同作用。

在某些实施方案中，本文所述的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂同时施用。在某些实施方案中，本文所述的一种或多种药物组合物与一种或多种其他药剂在不同时间施用。在某些实施方案中，本文描述的一种或多种药物组合物和一种或多种其他药剂一起制备成单个制剂。在某些实施方案中，本文所述的一种或多种药物组合物和一种或多种其他药剂是单独制备的。

在某些实施方案中，可与本文所述的药物组合物共同施用的药剂包括利鲁唑(力如太)、力奥来素(力奥来素)和Dexpramipexole。

在某些实施方案中，可与本文所述的C9ORF72特异性抑制剂共同施用的药剂包括但不限于另外的C9ORF72抑制剂。

在某些实施方案中，可与本文所述的C9ORF72特异性抑制剂共同施用的药剂包括但不限于C9ORF72反义转录物特异性抑制剂。在某些实施方案中，C9ORF72反义转录物特异性抑制剂是反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物是修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸是单链的。

在某些实施方案中，在施用本文所述的药物组合物之前施用共同施用的药剂。在某些实施方案中，在施用本文所述的药物组合物之后施用共同施用的药剂。在某些实施方案中，与本文所述的药物组合物同时施用共同施用的药剂。在某些实施方案中，共同施用的药剂的剂量与在单独施用共同施用的药剂时将施用的剂量相同。在某些实施方案中，共同施用的药剂的剂量比在单独施用共同施用的药剂时将施用的剂量低。在某些实施方案中，共同施用的药剂的剂量比在单独施用共同施用的药剂时将施用的剂量高。

在某些实施方案中，第二化合物的共同施用增强第一化合物的作用，以使得所述化合物的共同施用产生的作用大于单独施用第一化合物的作用。在其他实施方案中，共同施用产生为单独施用时化合物的作用的相加的作用。在某些实施方案中，共同施用产生为单独施用时化合物的作用的超相加的作用。在某些实施方案中，第一化合物是反义化合物。在某些实施方案中，第二化合物是反义化合物。

某些对比组合物

在某些实施方案中，本文描述的化合物比ISIS 576816、ISIS 576974、ISIS577061、ISIS 577065和/或ISIS 577083更耐受。ISIS 576816、ISIS 576974、ISIS 577061、ISIS 577065和ISIS 577083被选择为比较化合物，因为它们在WO2014/062691中描述的各种研究中展现高水平的剂量依赖性C9ORF72 mRNA减少。因此，ISIS 576816、ISIS 576974、ISIS 577061、ISIS 577065和ISIS 577083被认为是高度有效和有力的化合物。另外，在WO2014/062691中描述的ISIS 577065、ISIS 577056和ISIS 576816与本文描述的化合物是结构上类似的。例如，ISIS 577065与ISIS 801287具有16个核碱基的重叠；ISIS 577056与ISIS 806679具有16个核碱基的重叠；ISIS 576816与ISIS 802473具有18个核碱基的重叠(18聚体)；并且ISIS 576816与ISIS 802459具有18个核碱基的重叠。

在某些实施方案中，具有序列(从5’至3’)GCCTTACTCTAGGACCAAGA(作为SEQ IDNO：21并入本文)的ISIS 576816(一种5-10-5MOE缺口聚物)是对比化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且核苷1-5和16-20中的每个包含2’-O-甲氧基乙基，其先前描述于以引用的方式并入本文的WO2014/062691中。ISIS 576816在小鼠中的急性耐受性研究中实现7.00的平均FOB分数(参见下文的实施例3)。本文所述的某些化合物在小鼠中的类似急性耐受性研究中实现较低FOB分数(参见下文的实施例2)，包括ISIS 801287、ISIS 806679、ISIS 802473和ISIS 802459。因此，本文所述的某些化合物比对比化合物ISIS 576816更耐受。

在某些实施方案中，具有序列(从5’至3’)GGGACACTACAAGGTAGTAT(作为SEQ IDNO：56并入本文)的ISIS 576974(一种5-10-5MOE缺口聚物)是对比化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且核苷1-5和16-20中的每个包含2’-O-甲氧基乙基，其先前描述于以引用的方式并入本文的WO2014/062691中。ISIS 576974在小鼠中的急性耐受性研究中实现5.67的平均FOB分数(参见下文的实施例3)。本文所述的某些化合物在小鼠中的类似急性耐受性研究中实现较低FOB分数(参见下文的实施例2)，包括ISIS 801287、ISIS 806679、ISIS 802473和ISIS 802459。因此，本文所述的某些化合物比对比化合物ISIS 576974更耐受。

在某些实施方案中，具有序列(从5’至3’)TACAGGCTGCGGTTGTTTCC(作为SEQ IDNO：57并入本文)的ISIS 577061(一种5-10-5MOE缺口聚物)是对比化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且核苷1-5和16-20中的每个包含2’-O-甲氧基乙基，其先前描述于以引用的方式并入本文的WO2014/062691中。ISIS 577061在小鼠中的急性耐受性研究中实现7.00的平均FOB分数(参见下文的实施例3)。本文所述的某些化合物在小鼠中的类似急性耐受性研究中实现较低FOB分数(参见下文的实施例2)，包括ISIS 801287、ISIS 806679、ISIS 802473和ISIS 802459。因此，本文所述的某些化合物比对比化合物ISIS 577061更耐受。

在某些实施方案中，具有序列(从5’至3’)CCCGGCCCCTAGCGCGCGAC(作为SEQ IDNO：58并入本文)的ISIS 577065(一种5-10-5MOE缺口聚物)是对比化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且核苷1-5和16-20中的每个包含2’-O-甲氧基乙基，其先前描述于以引用的方式并入本文的WO2014/062691中。ISIS 577065在小鼠中的急性耐受性研究中实现6.00的平均FOB分数(参见下文的实施例3)。本文所述的某些化合物在小鼠中的类似急性耐受性研究中实现较低FOB分数(参见下文的实施例2)，包括ISIS 801287、ISIS 806679、ISIS 802473和ISIS 802459。因此，本文所述的某些化合物比对比化合物ISIS 577065更耐受。

在某些实施方案中，具有序列(从5’至3’)GGTAACTTCAAACTCTTGGG(作为SEQ IDNO：59并入本文)的ISIS 577083(一种5-10-5MOE缺口聚物)是对比化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且核苷1-5和16-20中的每个包含2’-O-甲氧基乙基，其先前描述于以引用的方式并入本文的WO2014/062691中。ISIS 577083在小鼠中的急性耐受性研究中实现7.00的平均FOB分数(参见下文的实施例3)。本文所述的某些化合物在小鼠中的类似急性耐受性研究中实现较低FOB分数(参见下文的实施例2)，包括ISIS 801287、ISIS 806679、ISIS 802473和ISIS 802459。因此，本文所述的某些化合物比对比化合物ISIS 577083更耐受。

在某些实施方案中，具有序列(从5’至3’)AATCTTTATCAGGTCTTTTC(作为SEQ IDNO：60并入本文)的ISIS 577056(一种5-10-5MOE缺口聚物)是对比化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且核苷1-5和16-20中的每个包含2’-O-甲氧基乙基，其先前描述于以引用的方式并入本文的WO2014/062691中。ISIS 577056在小鼠中的急性耐受性研究中实现6.5的平均FOB分数(参见下文的实施例3)。本文所述的某些化合物在小鼠中的类似急性耐受性研究中实现较低FOB分数(参见下文的实施例2)，包括ISIS 801287、ISIS 806679、ISIS 802473和ISIS 802459。因此，本文所述的某些化合物比对比化合物ISIS 577056更耐受。

某些人类治疗剂

本文所述的人C9ORF72反义寡核苷酸是人类治疗剂。正在研究效力、功效和/或耐受性的各种参数。此类参数包括体外抑制总C9ORF72 RNA表达、体外抑制C9ORF72致病相关RNA变体表达、体外剂量反应(IC50)、体内抑制在相关组织(例如，脑和/或脊髓)中含有人C9ORF72转基因的转基因动物中的总或致病性RNA和/或蛋白质、在小鼠中的耐受性、在大鼠中的耐受性和/或在灵长类动物中的耐受性。可测量的耐受性标志物包括血液和血清化学参数、CSF化学参数、身体和器官重量、一般观察结果和/或行为测试和/或生物化学标志物如GFAP和/或AIF1。可测量急性或长期耐受性。

某些组合物

1.

在某些实施方案中，ISIS 801287被表征为4-8-6MOE缺口聚物，其具有序列(从5’至3’)GCCCCTAGCGCGCGACTC(作为SEQ ID NO：33并入本文)，其中核苷1-4和13-18中的每个是2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的核苷，并且核苷5-12中的每个是2’-脱氧核苷，其中在核苷2至3、3至4、13至14、14至15和15至16之间的核苷间键联是磷酸二酯键联，并且在核苷1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、16至17和17至18之间的核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶是5’-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 801287：Ges mCeo mCeo mCesmCds Tds Ads Gds mCds Gds mCds Gds mCeo Geo Aeo mCes Tes mCe；其中，

A＝腺嘌呤，

mC＝5’-甲基胞嘧啶

G＝鸟嘌呤，

T＝胸腺嘧啶，

e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖

d＝2’-脱氧核糖，

s＝硫代磷酸酯核苷间键联，以及

o＝磷酸二酯核苷间键联。

在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 801287，或其盐：

结构1.ISIS 801287

在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 801287的钠盐：

结构2.ISIS 801287的钠盐

2.

在某些实施方案中，ISIS 806679被表征为6-10-4MOE缺口聚物，其具有序列(从5’至3’)GGTTAATCTTTATCAGGTCT(作为SEQ ID NO：49并入本文)，其中核苷1-6和17-20中的每个是2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的核苷，并且核苷7-16中的每个是2’-脱氧核苷，其中在核苷2至3、3至4、4至5、5至6、6至7和17至18之间的核苷间键联是磷酸二酯键联，并且在核苷1至2、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、18至19和19至20之间的核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶是5’-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 806679：Ges Geo Teo Teo AeoAeo Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds mCds Ads Gds Geo Tes mCes Te；其中，

A＝腺嘌呤，

mC＝5’-甲基胞嘧啶

G＝鸟嘌呤，

T＝胸腺嘧啶，

e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖

d＝2’-脱氧核糖，

s＝硫代磷酸酯核苷间键联，以及

o＝磷酸二酯核苷间键联。

在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 806679，或其盐：

结构3.ISIS 806679

在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 806679的钠盐：

结构4.ISIS 806679的钠盐

3.

在某些实施方案中，ISIS 802473被表征为4-8-6MOE缺口聚物，其具有序列(从5’至3’)GCCTTACTCTAGGACCAA(作为SEQ ID NO：47并入本文)，其中核苷1-4和13-18中的每个是2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的核苷，并且核苷5-12中的每个是2’-脱氧核苷，其中在核苷2至3、3至4、13至14、14至15和15至16之间的核苷间键联是磷酸二酯键联，并且在核苷1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、16至17和17至18之间的核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶是5’-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 802473：Ges mCeo mCeo TesTds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Geo Aeo mCeo mCes Aes Ae；其中，

A＝腺嘌呤，

mC＝5’-甲基胞嘧啶

G＝鸟嘌呤，

T＝胸腺嘧啶，

e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖

d＝2’-脱氧核糖，

s＝硫代磷酸酯核苷间键联，以及

o＝磷酸二酯核苷间键联。

在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 802473，或其盐：

结构5.ISIS 802473

在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 802473的钠盐：

结构6.ISIS 802473的钠盐

4.

在某些实施方案中，ISIS 802459被表征为3-10-7MOE缺口聚物，其具有序列(从5’至3’)GCCTTACTCTAGGACCAAGA(作为SEQ ID NO：21并入本文)，其中核苷1-3和14-20中的每个是2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的核苷，并且核苷4-13中的每个是2’-脱氧核苷，其中在核苷2至3、3至4、14至15、15至16、16至17和17至18之间的核苷间键联是磷酸二酯键联，并且在核苷1至2、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、18至19和19至20之间的核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶是5’-甲基胞嘧啶。

在某些实施方案中，通过以下化学符号描述ISIS 802459：Ges mCeo mCeo TdsTds Ads mCds Tds mCds Tds Ads Gds Gds Aeo mCeo mCeo Aeo Aes Ges Ae；其中，

A＝腺嘌呤，

mC＝5’-甲基胞嘧啶

G＝鸟嘌呤，

T＝胸腺嘧啶，

e＝2’-O-甲氧基乙基核糖修饰的糖

d＝2’-脱氧核糖，

s＝硫代磷酸酯核苷间键联，以及

o＝磷酸二酯核苷间键联。

在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 802459，或其盐：

结构7.ISIS 802459

在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 802459的钠盐：

结构8.ISIS 802459的钠盐

本发明提供的各个方面的实施方案也通过以下任意一个段落进行了描述。

实施方案1.一种化合物，其包含修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接核苷组成并且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO：22-55的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个连续核碱基。

实施方案2.如实施方案1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。

实施方案3.如实施方案1和2所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸是单链修饰的寡核苷酸。

实施方案4.如实施方案1-3中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。

实施方案5.如实施方案4所述的化合物，其中所述至少一个修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

实施方案6.如实施方案4和5所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个磷酸二酯键联。

实施方案7.如实施方案4所述的化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。

实施方案8.如实施方案1-7中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。

实施方案9.如实施方案8所述的化合物，其中所述修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。

实施方案10.如实施方案1-9中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖。

实施方案11.如实施方案10所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的每个核苷包含修饰的糖。

实施方案12.如实施方案10或11所述的化合物，其中所述至少一个修饰的糖是双环糖。

实施方案13.如实施方案12所述的化合物，其中所述双环糖包含在所述糖的4’位置与2’位置之间的化学桥，其中所述化学桥选自：4’-CH(R)-O-2’和4’-(CH

实施方案14.如实施方案13所述的化合物，其中所述化学桥是4’-CH(R)-O-2’，并且其中R是甲基。

实施方案15.如实施方案13所述的化合物，其中所述化学桥是4’-CH(R)-O-2’，并且其中R是H。

实施方案16.如实施方案13所述的化合物，其中所述化学桥是4’-CH(R)-O-2’，并且其中R是–CH

实施方案17.如实施方案10或11所述的化合物，其中所述至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基。

实施方案18.如实施方案1-10或12-16中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸是缺口聚物。

实施方案19.如实施方案18所述的化合物，其中所述缺口聚物是以下中的任一种：3-8-7MOE缺口聚物、3-10-7MOE缺口聚物、4-8-6MOE缺口聚物、4-10-6MOE缺口聚物、6-10-4MOE缺口聚物、6-8-4MOE缺口聚物、7-8-3MOE缺口聚物或7-10-3MOE缺口聚物。

实施方案20.如实施方案5所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含呈以下型态中的任一种的核苷间键联：soossssssssssooooss、sooossssssssssoooss、sooooossssssssssoss、soooooossssssssssss、soooosssssssssooss、sooosssssssssoooss、sooooosssssssssoss、soosssssssssoooss、soooosssssssssoss、sosssssssssooooss或sooooosssssssssss，其中，

s＝硫代磷酸酯键联，以及

o＝磷酸二酯键联。

实施方案19.一种组合物，其包含如前述实施方案中任一项所述的化合物或其盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。

实施方案20.如实施方案19所述的组合物，其还包含C9ORF72反义转录物特异性抑制剂。

实施方案21.如实施方案20所述的组合物，其中所述C9ORF72反义转录物特异性抑制剂是反义化合物。

实施方案22.如实施方案21所述的组合物，其中所述反义化合物是修饰的寡核苷酸。

实施方案23.如实施方案22所述的组合物，其中所述修饰的寡核苷酸是单链的。

实施方案24.如实施方案22或23所述的组合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有与C9ORF72反义转录物至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补的核碱基序列。

实施方案25.如实施方案24所述的组合物，其中所述C9ORF72反义转录物具有SEQID NO：18的核碱基序列。

实施方案26.一种方法，其包括向动物施用如前述实施方案中任一项所述的化合物或组合物。

实施方案27.如实施方案26所述的方法，其中所述动物是人。

实施方案28.如实施方案26和27所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗、改善C9ORF72相关疾病或减缓所述疾病的进展。

实施方案29.如实施方案28所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病由六核苷酸重复序列扩增引起。

实施方案30.如实施方案28所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征和橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)。

实施方案31.如实施方案26-30所述的方法，其中所述施用减少核灶。

实施方案32.如实施方案26-31所述的方法，其中所述施用降低C9ORF72相关的RAN翻译产物的表达。

实施方案33.如实施方案32所述的方法，其中所述C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)中的任一种。

实施方案34.如实施方案1-33中任一项所述的化合物或组合物的用途，其用于制造用于治疗神经退行性病症的药物。

实施方案35.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案36.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案37.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案38.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案39.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案40.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案41.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案42.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案43.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够降低哺乳动物中的人C9ORF72 mRNA或蛋白质表达。

实施方案44.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够改善肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征或橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)的至少一种症状。

实施方案45.如实施方案44所述的化合物或组合物，其中所述ALS症状是运动缺陷、焦虑和去神经支配中的任一种。

实施方案46.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够延迟疾病进展。

实施方案47.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够延长存活。

实施方案48.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够减少C9ORF72相关的RAN翻译产物。

实施方案49.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够选择性地减少C9ORF72致病相关mRNA变体。

实施方案50.如实施方案1-25或35-42中任一项所述的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物能够减少核灶。

实施方案51.一种根据下式由修饰的寡核苷酸组成的化合物，或其盐：

实施方案52.一种方法，其包括向动物施用如实施方案51所述的化合物。

实施方案53.如实施方案52所述的方法，其中所述动物是人。

实施方案54.如实施方案53所述的方法，其中所述施用抑制C9ORF72。

实施方案55.如实施方案53所述的方法，其中所述施用预防、治疗、改善C9ORF72相关疾病或减缓所述疾病的进展。

实施方案56.如实施方案55所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病由六核苷酸重复序列扩增引起。

实施方案57.如实施方案55所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征或橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)中的任一种。

实施方案58.如实施方案53所述的方法，其中所述施用减少核灶。

实施方案59.如实施方案53所述的方法，其中所述施用降低C9ORF72相关的RAN翻译产物的表达。

实施方案60.如实施方案59所述的方法，其中所述C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)中的任一种。

实施方案61.一种根据下式由修饰的寡核苷酸的钠盐组成的组合物：

实施方案62.一种方法，其包括向动物施用如实施方案60所述的组合物。

实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述动物是人。

实施方案64.如实施方案63所述的方法，其中所述施用抑制C9ORF72。

实施方案65.如实施方案62所述的方法，其中所述施用预防、治疗、改善C9ORF72相关疾病或减缓所述疾病的进展。

实施方案66.如实施方案65所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病由六核苷酸重复序列扩增引起。

实施方案67.如实施方案65所述的方法，其中所述C9ORF72相关疾病是肌萎缩性侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型帕金森综合征或橄榄体脑桥小脑退化症(OPCD)中的任一种。

实施方案68.如实施方案63所述的方法，其中所述施用减少核灶。

实施方案69.如实施方案63所述的方法，其中所述施用降低C9ORF72相关的RAN翻译产物的表达。

实施方案70.如实施方案69所述的方法，其中所述C9ORF72相关的RAN翻译产物是聚-(甘氨酸-脯氨酸)、聚-(甘氨酸-丙氨酸)和聚-(甘氨酸-精氨酸)中的任一种。

实施例

非限制性公开且以引用方式并入

虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。本申请中所述的各参考文献以引用的方式整体并入本文。

实施例1：靶向人C9ORF72的反义寡核苷酸

下表中的反义寡核苷酸被设计为MOE缺口聚物。每个缺口聚物的中心缺口区段包含2'-脱氧核苷，并且由在5'端和3'端两者上含有各自包含2'-MOE基团的核苷的翼区段侧接。每个缺口聚物的特定基序列于下表，由通过连字符分隔的三个数字表示。这些数字分别表示5'-翼、缺口和和3'-翼中核苷的数目。整个各寡核苷酸中的所有胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。缺口聚物的核苷间键联是混合的硫代磷酸酯和磷酸二酯键联。每个缺口聚物的核苷间键联在键联列中呈现，其中‘o’指示磷酸二酯键联，并且‘s’指示硫代磷酸酯键联。

下表中列出的每个反义寡核苷酸靶向于人C9ORF72基因组序列，本文中命名为SEQID NO：2(从核苷27535000至27565000截短的GENBANK登录号NT_008413.18的补体)。“起始位点”表示人基因组序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因组序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。

表6靶向人C9ORF72的反义寡核苷酸

实施例2：小鼠中靶向人C9ORF72的反义寡核苷酸的耐受性

在小鼠中测试上述反义寡核苷酸以评估寡核苷酸的耐受性。野生型C57/Bl6小鼠各自接受700μg的下表中列出的反义寡核苷酸的单个ICV剂量。每个处理组由4只小鼠组成。在注射后3小时，根据7个不同的标准评价每只小鼠。所述7个标准是(1)小鼠敏捷、机警且有反应；(2)在无刺激时小鼠是站立的或蜷缩的；(3)在无刺激时小鼠表现出任何运动；(4)在被提起之后小鼠表现出向前的运动；(5)在被提起之后小鼠表现出任何运动；(6)小鼠对尾部夹痛有反应；(7)均匀呼吸。对于7个不同标准中的每一个，每只小鼠如果满足标准则给予其0的分项分数，如果不满足，则给予其1的分项分数。评价了所有7个标准之后，对每只小鼠的分项分数求和，且然后对每个组求平均值。例如，如果小鼠在700μg ICV剂量后3小时敏捷、机警且有反应，并且满足所有其他标准，则它将得到0的总和分数。例如，如果小鼠在700μg ICV剂量后3小时不是敏捷、机警且有反应的，但满足所有其他标准，则它将得到1的分数。结果表示为每个处理组的平均分数。

表7

急性耐受性分数

实施例3：来自WO 2014/062691的寡核苷酸的耐受性

在小鼠中的急性耐受性研究中测试在WO 2014/062691中描述的寡核苷酸。对3只野生型C57/Bl6小鼠的组进行测试且如在实施例2中所描述进行分析。所测试的寡核苷酸包括列于下表的那些，其是具有完整硫代磷酸酯主链的5-10-5MOE缺口聚物，并且每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。示出SEQ ID NO：2上的每个寡核苷酸所靶向的起始位点和终止位点。结果在下表中表示为每个处理组的平均分数。这些结果证明ISIS 576816、ISIS 576974、ISIS577061、ISIS 577065、ISIS577083和ISIS 577056耐受性较差。

表8

在用来自WO 2014/062691的反义寡核苷酸处理后第3小时的急性耐受性分数

表9

在用来自WO 2014/062691的反义寡核苷酸处理后第3小时的急性耐受性分数

实施例4：HepG2细胞中人C9ORF72 mRNA变体的反义抑制

将以上所述的反义寡核苷酸在体外针对其对C9ORF72 mRNA的作用进行测试。用反义寡核苷酸电穿孔密度为每孔20,000个细胞的培养的HepG2细胞。在约24小时的处理期后，从所述细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量C9ORF72 mRNA水平。使用人引物探针集RTS3905(正向引物序列GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG，在本文中指定为SEQ ID NO：12；反向引物序列GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT，在本文中指定为SEQ ID NO：13；探针序列TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC，在本文中指定为SEQ ID NO：14–一种TAQ-man引物探针集)。RTS3905检测从含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体加工的mRNA变体(例如NM_001256054.1)。从含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体加工的mRNA变体在本文中是“C9ORF72致病相关mRNA变体”。当前体mRNA的转录在从外显子1A的起始位点至外显子1B的起始位点的区域(一般来说，基因组序列：SEQ ID NO：2的核苷酸1107至1520，从核苷酸27535000至2756500截短的GENBANK登录号NT_008413.18的补体)中开始时，前体mRNA包含六核苷酸重复序列。因此，在此区域中设计的寡核苷酸选择性地靶向含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体。RTS3905测量含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体的mRNA产物(即C9ORF72致病相关mRNA变体)，且因此测量含有六核苷酸重复序列的前体mRNA变体的减少。将C9ORF72致病相关mRNA变体的水平标准化至细胞的总RNA含量(如通过

实施例5：人C9ORF72 mRNA变体的剂量依赖性反义抑制

在HepG2细胞中以各种剂量测试以上所述的反义寡核苷酸。将细胞以每孔20,000个细胞的密度接种且用反义寡核苷酸电穿孔。在约16小时或24小时的处理期后，从所述细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量C9ORF72 mRNA水平。人C9ORF72引物探针集RTS3905用于测量C9ORF72致病相关mRNA变体。将C9ORF72致病相关mRNA变体的水平根据总RNA含量进行调整，如通过

实施例6：在LLC-MK2细胞中通过人-恒河猴交叉反应性反义寡核苷酸进行的C9ORF72的反义抑制

将以上描述的与恒河猴C9ORF72核酸完全交叉反应的反义寡核苷酸针对其在体外对恒河猴C9ORF72 mRNA的作用进行测试。用反义寡核苷酸电穿孔密度为每孔20,000个细胞的培养的恒河猴LLC-MK2细胞。在约24小时的处理期后，从所述细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量C9ORF72 mRNA水平。使用引物探针集RTS3750(正向序列TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA，在本文中指定为SEQ ID NO：15；反向序列GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG，在本文中指定为SEQ ID NO：16；探针序列TCGACTCTTTGCCCACCGCCA，在本文中指定为SEQ ID NO：17–一种TAQ-man引物探针集)来测量总C9ORF72mRNA水平。RTS3750靶向mRNA转录物的外显子2且因此测量总mRNA转录物。将C9ORF72 mRNA水平根据总RNA含量(如通过

实施例7：LLC-MK2中人C9ORF72 mRNA的剂量依赖性反义抑制

在LLC-MK2细胞中以各种剂量测试以上所述的反义寡核苷酸。将细胞以每孔20,000个细胞的密度接种且用反义寡核苷酸电穿孔。在约16小时或24小时的处理期后，从所述细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量C9ORF72 mRNA水平。引物探针集RTS3750用于测量总C9ORF72 mRNA水平。将C9ORF72 mRNA水平根据总RNA含量(如通过

实施例8：转基因小鼠模型中人C9ORF72 mRNA的反义抑制

将以上所述的反义寡核苷酸在两种BAC转基因小鼠系(在本文中指定为C9B41和C9B183)中进行测试，所述小鼠系各自表达包含外显子1-5的截短的人C9ORF72基因。C9B41和C9B183小鼠系的截短的人C9ORF72基因分别包含110和450个六核苷酸重复序列。每个处理组中的每只小鼠接受350μg的反义寡核苷酸，然后通过RT-PCR分析人C9ORF72 RNA的表达水平。还执行剂量反应。

实施例9：患者成纤维细胞中C9ORF72 mRNA的反义抑制

将以上所述的反义寡核苷酸在体外针对其对C9ORF72 mRNA的作用进行测试。将下表中列出的反义寡核苷酸添加至板中，之后以每孔20,000个细胞的密度添加患者成纤维细胞F09-152。在添加细胞后反义寡核苷酸的最终浓度列于下表。在30秒振荡后，将细胞电穿孔，然后转移至Primaria涂覆的培养板。在16小时后，从所述细胞分离RNA，且通过RT-qPCR测量总C9ORF72 mRNA(即，从外显子1A开始的mRNA和从外显子1B开始的mRNA)水平和致病相关mRNA的水平(参见实施例4)。人引物探针集RTS 3750(参见实施例6)和RTS3905(参见实施例4)分别用于检测总C9ORF72 mRNA和C9ORF72致病相关mRNA。将C9ORF72总mRNA和C9ORF72致病相关mRNA的水平标准化至细胞的总RNA含量(如通过

表10

在患者成纤维细胞中反义抑制之后的C9ORF72 mRNA水平

实施例10：转基因小鼠模型中人C9ORF72 mRNA的反义抑制

在BAC转基因小鼠系C9B41(参见实施例8)中测试了上述反义寡核苷酸，所述小鼠系通过外显子5和110个六核苷酸重复序列表达包含启动子区的人C9ORF72基因。每个处理组由2-3只小鼠组成。每只小鼠接受350μg的下表所列的反义寡核苷酸的单个ICVB或PBS。两周后，将小鼠安乐死，并且通过RT-qPCR分析人致病相关C9ORF72 mRNA变体和/或总人C9ORF72 mRNA的表达水平，如实施例9中所述。对于不特异性地靶向C9ORF72重复序列变体前体mRNA的寡核苷酸，未完成致病相关C9ORF72变体mRNA水平的分析。下表中的结果示出相对于PBS处理组的标准化平均值，标准化的人C9ORF72 mRNA水平的平均百分比。

表11

在转基因小鼠中反义抑制之后的人C9ORF72 mRNA水平

表12

在转基因小鼠中反义抑制之后的人C9ORF72 mRNA水平

实施例11：转基因小鼠模型中人C9ORF72 mRNA的剂量依赖性反义抑制

将以上所述的反义寡核苷酸在两种BAC转基因小鼠系(C9B41和C9B183)中进行测试，所述小鼠系各自表达包含外显子1-5的截短的人C9ORF72基因。C9B41和C9B183小鼠系的截短的人C9ORF72基因分别包含110和450个六核苷酸重复序列(参见实施例8)。每个处理组由2-4只小鼠组成。每只小鼠接受30μg、100μg、300μg或700μg的如下表所列的反义寡核苷酸的单个ICVB或PBS。两周后，将小鼠安乐死，并且通过RT-qPCR分析人致病相关C9ORF72 mRNA变体和/或总人C9ORF72 mRNA的表达水平，如实施例9中所述。下表中的结果示出相对于PBS处理组的标准化平均值，标准化的人C9ORF72 mRNA水平的平均百分比。100或更大的值意味着反义寡核苷酸不减少mRNA或增加mRNA的量。

表13

在C9B41转基因小鼠中剂量依赖性反义抑制之后的人C9ORF72 mRNA水平

表14

在C9B183转基因小鼠中剂量依赖性反义抑制之后的人C9ORF72 mRNA水平

实施例12：小鼠中靶向人C9Orf72的反义寡核苷酸的耐受性

野生型C57/Bl6小鼠各自接受700μg的下表中列出的反义寡核苷酸的单个ICV剂量，如实施例2中所述。每个处理组由4只小鼠组成。在注射后8周，根据7个不同的标准评估小鼠。所述标准是(1)小鼠敏捷、机警且有反应；(2)在无刺激时小鼠是站立的或蜷缩的；(3)在无刺激时小鼠表现出任何运动；(4)在被提起之后小鼠表现出向前的运动；(5)在被提起之后小鼠表现出任何运动；(6)小鼠对尾部夹痛有反应；(7)均匀呼吸。对于7个标准中的每个，小鼠如果满足标准则给予其0的分项分数，如果不满足则给予其1的分项分数。评价了所有7个标准之后，对每只小鼠的分数求和，且然后在每个处理组内求平均值。结果在下表中呈现。

在8周时处死动物。从每只动物收集皮质和脊髓，并进行RT-PCR。测定同种异体移植炎症因子(AIF1)的表达水平作为炎症的量度。还测定胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达水平作为胶质细胞活化的量度。将结果标准化至Gpadh，并且在下表中相对于PBS对照(1.0)呈现。“N.D.”表示没有数据，因为未进行实验。星号表示对应结果是1-3只小鼠的平均值。

表15：小鼠中靶向C9Orf72的反义寡核苷酸的耐受性

实施例13：大鼠中靶向人C9Orf72的反义寡核苷酸的耐受性

将Sprague Dawley大鼠分成4或6只大鼠的组。对每个大鼠组中的每只大鼠施用单一3mg鞘内(IT)剂量的下表中所指示的寡核苷酸。在IT剂量后3小时和8周，对每只大鼠评价身体的7个不同部位的活动。7个身体部位为：(1)大鼠尾部；(2)大鼠后位姿；(3)大鼠后肢；(4)大鼠后爪；(5)大鼠前爪；(6)大鼠前位姿；(7)大鼠头部。对于7个不同身体部位的每个部位，如果这个身体部位是活动的，那么为每只大鼠给出0的分项分数，如果这个身体部位是瘫痪的，那么给出1的分项分数。在评价了7个身体部位中的每个部位之后，对每只大鼠的分项分数求和，然后对每个组求平均值。例如，如果在3mg IT剂量之后3小时大鼠的尾部、头部和所有其他被评价的身体部位是活动的，那么它将得到0的求和分数。如果在3mg IT剂量之后3小时另一只大鼠的尾部是不活动的，但所有其他被评价的身体部位是活动的，那么它将得到1的分数。盐水处理的大鼠通常得到0的分数。在范围顶端的分数将表明有急性毒性。结果在下表中呈现为每个处理组的平均分数。

在8周时处死动物。从每只动物收集皮质和脊髓，并进行RT-PCR。测定AIF1的表达水平作为炎症的量度。还测定(GFAP)的表达水平作为胶质细胞活化的量度。星号表示对应结果是2-3只小鼠的平均值。将结果标准化至Gapdh，并且在下表中相对于PBS对照(1.0)呈现。

表16：大鼠中靶向C9Orf72的反义寡核苷酸的耐受性

实施例14：非人灵长类动物中靶向人C9ORF72的反义寡核苷酸的耐受性

通过鞘内快速浓注(1mL缓慢浓注，然后0.25mL冲洗)，在第1天、第14天和第28天向雌性食蟹猴(2-6kg)给予35mg反义寡核苷酸的3个剂量。每个处理组包括4只猴。在最终剂量后两周，将动物处死并对各种CNS组织进行RT-PCR。测定AIF1的表达水平作为炎症的量度，并且测定GFAP的表达水平作为胶质细胞活化的量度。将结果标准化至GADPH，并且对于ISISNo.801287、802459和806679相对于下表中的PBS对照(1.0)呈现。

表17：食蟹猴中靶向C9ORF72的反义寡核苷酸的耐受性

序列表

<110> IONIS制药公司

<120> 用于调节C9ORF72表达的组合物

<130> BIOL0269WO

<150> 62/148,691

<151> 2015-04-16

<150> 62/232,941

<151> 2015-09-25

<150> 62/239,400

<151> 2015-10-09

<160> 60

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 3339

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60

cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120

ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggagat atctccggag catttggata 180

atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc 240

caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg 300

ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact 360

tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg 420

aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat 480

tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc 540

aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga 600

tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggaaa gacaagaaaa 660

tgtccagaag attatcttag aaggcacaga gagaatggaa gatcagggtc agagtattat 720

tccaatgctt actggagaag tgattcctgt aatggaactg ctttcatcta tgaaatcaca 780

cagtgttcct gaagaaatag atatagctga tacagtactc aatgatgatg atattggtga 840

cagctgtcat gaaggctttc ttctcaatgc catcagctca cacttgcaaa cctgtggctg 900

ttccgttgta gtaggtagca gtgcagagaa agtaaataag atagtcagaa cattatgcct 960

ttttctgact ccagcagaga gaaaatgctc caggttatgt gaagcagaat catcatttaa 1020

atatgagtca gggctctttg tacaaggcct gctaaaggat tcaactggaa gctttgtgct 1080

gcctttccgg caagtcatgt atgctccata tcccaccaca cacatagatg tggatgtcaa 1140

tactgtgaag cagatgccac cctgtcatga acatatttat aatcagcgta gatacatgag 1200

atccgagctg acagccttct ggagagccac ttcagaagaa gacatggctc aggatacgat 1260

catctacact gacgaaagct ttactcctga tttgaatatt tttcaagatg tcttacacag 1320

agacactcta gtgaaagcct tcctggatca ggtctttcag ctgaaacctg gcttatctct 1380

cagaagtact ttccttgcac agtttctact tgtccttcac agaaaagcct tgacactaat 1440

aaaatatata gaagacgata cgcagaaggg aaaaaagccc tttaaatctc ttcggaacct 1500

gaagatagac cttgatttaa cagcagaggg cgatcttaac ataataatgg ctctggctga 1560

gaaaattaaa ccaggcctac actcttttat ctttggaaga cctttctaca ctagtgtgca 1620

agaacgagat gttctaatga ctttttaaat gtgtaactta ataagcctat tccatcacaa 1680

tcatgatcgc tggtaaagta gctcagtggt gtggggaaac gttcccctgg atcatactcc 1740

agaattctgc tctcagcaat tgcagttaag taagttacac tacagttctc acaagagcct 1800

gtgaggggat gtcaggtgca tcattacatt gggtgtctct tttcctagat ttatgctttt 1860

gggatacaga cctatgttta caatataata aatattattg ctatctttta aagatataat 1920

aataggatgt aaacttgacc acaactactg tttttttgaa atacatgatt catggtttac 1980

atgtgtcaag gtgaaatctg agttggcttt tacagatagt tgactttcta tcttttggca 2040

ttctttggtg tgtagaatta ctgtaatact tctgcaatca actgaaaact agagccttta 2100

aatgatttca attccacaga aagaaagtga gcttgaacat aggatgagct ttagaaagaa 2160

aattgatcaa gcagatgttt aattggaatt gattattaga tcctactttg tggatttagt 2220

ccctgggatt cagtctgtag aaatgtctaa tagttctcta tagtccttgt tcctggtgaa 2280

ccacagttag ggtgttttgt ttattttatt gttcttgcta ttgttgatat tctatgtagt 2340

tgagctctgt aaaaggaaat tgtattttat gttttagtaa ttgttgccaa ctttttaaat 2400

taattttcat tatttttgag ccaaattgaa atgtgcacct cctgtgcctt ttttctcctt 2460

agaaaatcta attacttgga acaagttcag atttcactgg tcagtcattt tcatcttgtt 2520

ttcttcttgc taagtcttac catgtacctg ctttggcaat cattgcaact ctgagattat 2580

aaaatgcctt agagaatata ctaactaata agatcttttt ttcagaaaca gaaaatagtt 2640

ccttgagtac ttccttcttg catttctgcc tatgtttttg aagttgttgc tgtttgcctg 2700

caataggcta taaggaatag caggagaaat tttactgaag tgctgttttc ctaggtgcta 2760

ctttggcaga gctaagttat cttttgtttt cttaatgcgt ttggaccatt ttgctggcta 2820

taaaataact gattaatata attctaacac aatgttgaca ttgtagttac acaaacacaa 2880

ataaatattt tatttaaaat tctggaagta atataaaagg gaaaatatat ttataagaaa 2940

gggataaagg taatagagcc cttctgcccc ccacccacca aatttacaca acaaaatgac 3000

atgttcgaat gtgaaaggtc ataatagctt tcccatcatg aatcagaaag atgtggacag 3060

cttgatgttt tagacaacca ctgaactaga tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa 3120

aaaatatata aatactacct tgtagtgtcc catactgtgt tttttacatg gtagattctt 3180

atttaagtgc taactggtta ttttctttgg ctggtttatt gtactgttat acagaatgta 3240

agttgtacag tgaaataagt tattaaagca tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc 3300

taaatggaga attttgaata aaatatattt gaaattttg 3339

<210> 2

<211> 30001

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

caaagaaaag ggggaggttt tgttaaaaaa gagaaatgtt acatagtgct ctttgagaaa 60

attcattggc actattaagg atctgaggag ctggtgagtt tcaactggtg agtgatggtg 120

gtagataaaa ttagagctgc agcaggtcat tttagcaact attagataaa actggtctca 180

ggtcacaacg ggcagttgca gcagctggac ttggagagaa ttacactgtg ggagcagtgt 240

catttgtcct aagtgctttt ctacccccta cccccactat tttagttggg tataaaaaga 300

atgacccaat ttgtatgatc aactttcaca aagcatagaa cagtaggaaa agggtctgtt 360

tctgcagaag gtgtagacgt tgagagccat tttgtgtatt tattcctccc tttcttcctc 420

ggtgaatgat taaaacgttc tgtgtgattt ttagtgatga aaaagattaa atgctactca 480

ctgtagtaag tgccatctca cacttgcaga tcaaaaggca cacagtttaa aaaacctttg 540

tttttttaca catctgagtg gtgtaaatgc tactcatctg tagtaagtgg aatctataca 600

cctgcagacc aaaagacgca aggtttcaaa aatctttgtg ttttttacac atcaaacaga 660

atggtacgtt tttcaaaagt taaaaaaaaa caactcatcc acatattgca actagcaaaa 720

atgacattcc ccagtgtgaa aatcatgctt gagagaattc ttacatgtaa aggcaaaatt 780

gcgatgactt tgcaggggac cgtgggattc ccgcccgcag tgccggagct gtcccctacc 840

agggtttgca gtggagtttt gaatgcactt aacagtgtct tacggtaaaa acaaaatttc 900

atccaccaat tatgtgttga gcgcccactg cctaccaagc acaaacaaaa ccattcaaaa 960

ccacgaaatc gtcttcactt tctccagatc cagcagcctc ccctattaag gttcgcacac 1020

gctattgcgc caacgctcct ccagagcggg tcttaagata aaagaacagg acaagttgcc 1080

ccgccccatt tcgctagcct cgtgagaaaa cgtcatcgca catagaaaac agacagacgt 1140

aacctacggt gtcccgctag gaaagagagg tgcgtcaaac agcgacaagt tccgcccacg 1200

taaaagatga cgcttggtgt gtcagccgtc cctgctgccc ggttgcttct cttttggggg 1260

cggggtctag caagagcagg tgtgggttta ggaggtgtgt gtttttgttt ttcccaccct 1320

ctctccccac tacttgctct cacagtactc gctgagggtg aacaagaaaa gacctgataa 1380

agattaacca gaagaaaaca aggagggaaa caaccgcagc ctgtagcaag ctctggaact 1440

caggagtcgc gcgctagggg ccggggccgg ggccggggcg tggtcggggc gggcccgggg 1500

gcgggcccgg ggcggggctg cggttgcggt gcctgcgccc gcggcggcgg aggcgcaggc 1560

ggtggcgagt gggtgagtga ggaggcggca tcctggcggg tggctgtttg gggttcggct 1620

gccgggaaga ggcgcgggta gaagcggggg ctctcctcag agctcgacgc atttttactt 1680

tccctctcat ttctctgacc gaagctgggt gtcgggcttt cgcctctagc gactggtgga 1740

attgcctgca tccgggcccc gggcttcccg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgcaggga 1800

caagggatgg ggatctggcc tcttccttgc tttcccgccc tcagtacccg agctgtctcc 1860

ttcccgggga cccgctggga gcgctgccgc tgcgggctcg agaaaaggga gcctcgggta 1920

ctgagaggcc tcgcctgggg gaaggccgga gggtgggcgg cgcgcggctt ctgcggacca 1980

agtcggggtt cgctaggaac ccgagacggt ccctgccggc gaggagatca tgcgggatga 2040

gatgggggtg tggagacgcc tgcacaattt cagcccaagc ttctagagag tggtgatgac 2100

ttgcatatga gggcagcaat gcaagtcggt gtgctcccca ttctgtggga catgacctgg 2160

ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg aagtgactat tgtgacttgg 2220

gcatcacttg actgatggta atcagttgtc taaagaagtg cacagattac atgtccgtgt 2280

gctcattggg tctatctggc cgcgttgaac accaccaggc tttgtattca gaaacaggag 2340

ggaggtcctg cactttccca ggaggggtgg ccctttcaga tgcaatcgag attgttaggc 2400

tctgggagag tagttgcctg gttgtggcag ttggtaaatt tctattcaaa cagttgccat 2460

gcaccagttg ttcacaacaa gggtacgtaa tctgtctggc attacttcta cttttgtaca 2520

aaggatcaaa aaaaaaaaag atactgttaa gatatgattt ttctcagact ttgggaaact 2580

tttaacataa tctgtgaata tcacagaaac aagactatca tataggggat attaataacc 2640

tggagtcaga atacttgaaa tacggtgtca tttgacacgg gcattgttgt caccacctct 2700

gccaaggcct gccactttag gaaaaccctg aatcagttgg aaactgctac atgctgatag 2760

tacatctgaa acaagaacga gagtaattac cacattccag attgttcact aagccagcat 2820

ttacctgctc caggaaaaaa ttacaagcac cttatgaagt tgataaaata ttttgtttgg 2880

ctatgttggc actccacaat ttgctttcag agaaacaaag taaaccaagg aggacttctg 2940

tttttcaagt ctgccctcgg gttctattct acgttaatta gatagttccc aggaggacta 3000

ggttagccta cctattgtct gagaaacttg gaactgtgag aaatggccag atagtgatat 3060

gaacttcacc ttccagtctt ccctgatgtt gaagattgag aaagtgttgt gaactttctg 3120

gtactgtaaa cagttcactg tccttgaagt ggtcctgggc agctcctgtt gtggaaagtg 3180

gacggtttag gatcctgctt ctctttgggc tgggagaaaa taaacagcat ggttacaagt 3240

attgagagcc aggttggaga aggtggctta cacctgtaat gccagagctt tgggaggcgg 3300

aggcaagagg atcacttgaa gccaggagtt caagctcaac ctgggcaacg tagaccctgt 3360

ctctacaaaa aattaaaaac ttagccgggc gtggtgatgt gcacctgtag tcctagctac 3420

ttgggaggct gaggcaggag ggtcatttga gcccaagagt ttgaagttac cgagagctat 3480

gatcctgcca gtgcattcca gcctggatga caaaacgaga ccctgtctct aaaaaacaag 3540

aagtgagggc tttatgattg tagaattttc actacaatag cagtggacca accacctttc 3600

taaataccaa tcagggaaga gatggttgat tttttaacag acgtttaaag aaaaagcaaa 3660

acctcaaact tagcactcta ctaacagttt tagcagatgt taattaatgt aatcatgtct 3720

gcatgtatgg gattatttcc agaaagtgta ttgggaaacc tctcatgaac cctgtgagca 3780

agccaccgtc tcactcaatt tgaatcttgg cttccctcaa aagactggct aatgtttggt 3840

aactctctgg agtagacagc actacatgta cgtaagatag gtacataaac aactattggt 3900

tttgagctga tttttttcag ctgcatttgc atgtatggat ttttctcacc aaagacgatg 3960

acttcaagta ttagtaaaat aattgtacag ctctcctgat tatacttctc tgtgacattt 4020

catttcccag gctatttctt ttggtaggat ttaaaactaa gcaattcagt atgatctttg 4080

tccttcattt tctttcttat tctttttgtt tgtttgtttg tttgtttttt tcttgaggca 4140

gagtctctct ctgtcgccca ggctggagtg cagtggcgcc atctcagctc attgcaacct 4200

ctgccacctc cgggttcaag agattctcct gcctcagcct cccgagtagc tgggattaca 4260

ggtgtccacc accacacccg gctaattttt tgtattttta gtagaggtgg ggtttcacca 4320

tgttggccag gctggtcttg agctcctgac ctcaggtgat ccacctgcct cggcctacca 4380

aagagctggg ataacaggtg tgacccacca tgcccggccc attttttttt tcttattctg 4440

ttaggagtga gagtgtaact agcagtataa tagttcaatt ttcacaacgt ggtaaaagtt 4500

tccctataat tcaatcagat tttgctccag ggttcagttc tgttttagga aatactttta 4560

ttttcagttt aatgatgaaa tattagagtt gtaatattgc ctttatgatt atccaccttt 4620

ttaacctaaa agaatgaaag aaaaatatgt ttgcaatata attttatggt tgtatgttaa 4680

cttaattcat tatgttggcc tccagtttgc tgttgttagt tatgacagca gtagtgtcat 4740

taccatttca attcagatta cattcctata tttgatcatt gtaaactgac tgcttacatt 4800

gtattaaaaa cagtggatat tttaaagaag ctgtacggct tatatctagt gctgtctctt 4860

aagactatta aattgataca acatatttaa aagtaaatat tacctaaatg aatttttgaa 4920

attacaaata cacgtgttaa aactgtcgtt gtgttcaacc atttctgtac atacttagag 4980

ttaactgttt tgccaggctc tgtatgccta ctcataatat gataaaagca ctcatctaat 5040

gctctgtaaa tagaagtcag tgctttccat cagactgaac tctcttgaca agatgtggat 5100

gaaattcttt aagtaaaatt gtttactttg tcatacattt acagatcaaa tgttagctcc 5160

caaagcaatc atatggcaaa gataggtata tcatagtttg cctattagct gctttgtatt 5220

gctattatta taaatagact tcacagtttt agacttgctt aggtgaaatt gcaattcttt 5280

ttactttcag tcttagataa caagtcttca attatagtac aatcacacat tgcttaggaa 5340

tgcatcatta ggcgattttg tcattatgca aacatcatag agtgtactta cacaaaccta 5400

gatagtatag cctttatgta cctaggccgt atggtatagt ctgttgctcc taggccacaa 5460

acctgtacaa ctgttactgt actgaatact atagacagtt gtaacacagt ggtaaatatt 5520

tatctaaata tatgcaaaca gagaaaaggt acagtaaaag tatggtataa aagataatgg 5580

tatacctgtg taggccactt accacgaatg gagcttgcag gactagaagt tgctctgggt 5640

gagtcagtga gtgagtggtg aattaatgtg aaggcctaga acactgtaca ccactgtaga 5700

ctataaacac agtacgctga agctacacca aatttatctt aacagttttt cttcaataaa 5760

aaattataac tttttaactt tgtaaacttt ttaatttttt aacttttaaa atacttagct 5820

tgaaacacaa atacattgta tagctataca aaaatatttt ttctttgtat ccttattcta 5880

gaagcttttt tctattttct attttaaatt ttttttttta cttgttagtc gtttttgtta 5940

aaaactaaaa cacacacact ttcacctagg catagacagg attaggatca tcagtatcac 6000

tcccttccac ctcactgcct tccacctcca catcttgtcc cactggaagg tttttagggg 6060

caataacaca catgtagctg tcacctatga taacagtgct ttctgttgaa tacctcctga 6120

aggacttgcc tgaggctgtt ttacatttaa cttaaaaaaa aaaaaagtag aaggagtgca 6180

ctctaaaata acaataaaag gcatagtata gtgaatacat aaaccagcaa tgtagtagtt 6240

tattatcaag tgttgtacac tgtaataatt gtatgtgcta tactttaaat aacttgcaaa 6300

atagtactaa gaccttatga tggttacagt gtcactaagg caatagcata ttttcaggtc 6360

cattgtaatc taatgggact accatcatat atgcagtcta ccattgactg aaacgttaca 6420

tggcacataa ctgtatttgc aagaatgatt tgttttacat taatatcaca taggatgtac 6480

ctttttagag tggtatgttt atgtggatta agatgtacaa gttgagcaag gggaccaaga 6540

gccctgggtt ctgtcttgga tgtgagcgtt tatgttcttc tcctcatgtc tgttttctca 6600

ttaaattcaa aggcttgaac gggccctatt tagcccttct gttttctacg tgttctaaat 6660

aactaaagct tttaaattct agccatttag tgtagaactc tctttgcagt gatgaaatgc 6720

tgtattggtt tcttggctag catattaaat atttttatct ttgtcttgat acttcaatgt 6780

cgttttaaac atcaggatcg ggcttcagta ttctcataac cagagagttc actgaggata 6840

caggactgtt tgcccatttt ttgttatggc tccagacttg tggtatttcc atgtcttttt 6900

tttttttttt ttttttgacc ttttagcggc tttaaagtat ttctgttgtt aggtgttgta 6960

ttacttttct aagattactt aacaaagcac cacaaactga gtggctttaa acaacagcaa 7020

tttattctct cacaattcta gaagctagaa gtccgaaatc aaagtgttga caggggcatg 7080

atcttcaaga gagaagactc tttccttgcc tcttcctggc ttctggtggt taccagcaat 7140

cctgagtgtt cctttcttgc cttgtagttt caacaatcca gtatctgcct tttgtcttca 7200

catggctgtc taccatttgt ctctgtgtct ccaaatctct ctccttataa acacagcagt 7260

tattggatta ggccccactc taatccagta tgaccccatt ttaacatgat tacacttatt 7320

tctagataag gtcacattca cgtacaccaa gggttaggaa ttgaacatat ctttttgggg 7380

gacacaattc aacccacaag tgtcagtctc tagctgagcc tttcccttcc tgtttttctc 7440

ctttttagtt gctatgggtt aggggccaaa tctccagtca tactagaatt gcacatggac 7500

tggatatttg ggaatactgc gggtctattc tatgagcttt agtatgtaac atttaatatc 7560

agtgtaaaga agcccttttt taagttattt ctttgaattt ctaaatgtat gccctgaata 7620

taagtaacaa gttaccatgt cttgtaaaat gatcatatca acaaacattt aatgtgcacc 7680

tactgtgcta gttgaatgtc tttatcctga taggagataa caggattcca catctttgac 7740

ttaagaggac aaaccaaata tgtctaaatc atttggggtt ttgatggata tctttaaatt 7800

gctgaaccta atcattggtt tcatatgtca ttgtttagat atctccggag catttggata 7860

atgtgacagt tggaatgcag tgatgtcgac tctttgccca ccgccatctc cagctgttgc 7920

caagacagag attgctttaa gtggcaaatc acctttatta gcagctactt ttgcttactg 7980

ggacaatatt cttggtccta gagtaaggca catttgggct ccaaagacag aacaggtact 8040

tctcagtgat ggagaaataa cttttcttgc caaccacact ctaaatggag aaatccttcg 8100

aaatgcagag agtggtgcta tagatgtaaa gttttttgtc ttgtctgaaa agggagtgat 8160

tattgtttca ttaatctttg atggaaactg gaatggggat cgcagcacat atggactatc 8220

aattatactt ccacagacag aacttagttt ctacctccca cttcatagag tgtgtgttga 8280

tagattaaca catataatcc ggaaaggaag aatatggatg cataaggtaa gtgatttttc 8340

agcttattaa tcatgttaac ctatctgttg aaagcttatt ttctggtaca tataaatctt 8400

atttttttaa ttatatgcag tgaacatcaa acaataaatg ttatttattt tgcatttacc 8460

ctattagata caaatacatc tggtctgata cctgtcatct tcatattaac tgtggaaggt 8520

acgaaatggt agctccacat tatagatgaa aagctaaagc ttagacaaat aaagaaactt 8580

ttagaccctg gattcttctt gggagccttt gactctaata ccttttgttt ccctttcatt 8640

gcacaattct gtcttttgct tactactatg tgtaagtata acagttcaaa gtaatagttt 8700

cataagctgt tggtcatgta gcctttggtc tctttaacct ctttgccaag ttcccaggtt 8760

cataaaatga ggaggttgaa tggaatggtt cccaagagaa ttccttttaa tcttacagaa 8820

attattgttt tcctaaatcc tgtagttgaa tatataatgc tatttacatt tcagtatagt 8880

tttgatgtat ctaaagaaca cattgaattc tccttcctgt gttccagttt gatactaacc 8940

tgaaagtcca ttaagcatta ccagttttaa aaggcttttg cccaatagta aggaaaaata 9000

atatctttta aaagaataat tttttactat gtttgcaggc ttacttcctt ttttctcaca 9060

ttatgaaact cttaaaatca ggagaatctt ttaaacaaca tcataatgtt taatttgaaa 9120

agtgcaagtc attcttttcc tttttgaaac tatgcagatg ttacattgac tgttttctgt 9180

gaagttatct ttttttcact gcagaataaa ggttgttttg attttatttt gtattgttta 9240

tgagaacatg catttgttgg gttaatttcc tacccctgcc cccatttttt ccctaaagta 9300

gaaagtattt ttcttgtgaa ctaaattact acacaagaac atgtctattg aaaaataagc 9360

aagtatcaaa atgttgtggg ttgttttttt aaataaattt tctcttgctc aggaaagaca 9420

agaaaatgtc cagaagatta tcttagaagg cacagagaga atggaagatc aggtatatgc 9480

aaattgcata ctgtcaaatg tttttctcac agcatgtatc tgtataaggt tgatggctac 9540

atttgtcaag gccttggaga catacgaata agcctttaat ggagctttta tggaggtgta 9600

cagaataaac tggaggaaga tttccatatc ttaaacccaa agagttaaat cagtaaacaa 9660

aggaaaatag taattgcatc tacaaattaa tatttgctcc cttttttttt ctgtttgccc 9720

agaataaatt ttggataact tgttcatagt aaaaataaaa aaaattgtct ctgatatgtt 9780

ctttaaggta ctacttctcg aacctttccc tagaagtagc tgtaacagaa ggagagcata 9840

tgtacccctg aggtatctgt ctggggtgta ggcccaggtc cacacaatat ttcttctaag 9900

tcttatgttg tatcgttaag actcatgcaa tttacatttt attccataac tattttagta 9960

ttaaaatttg tcagtgatat ttcttaccct ctcctctagg aaaatgtgcc atgtttatcc 10020

cttggctttg aatgcccctc aggaacagac actaagagtt tgagaagcat ggttacaagg 10080

gtgtggcttc ccctgcggaa actaagtaca gactatttca ctgtaaagca gagaagttct 10140

tttgaaggag aatctccagt gaagaaagag ttcttcactt ttacttccat ttcctcttgt 10200

gggtgaccct caatgctcct tgtaaaactc caatatttta aacatggctg ttttgccttt 10260

ctttgcttct ttttagcatg aatgagacag atgatacttt aaaaaagtaa ttaaaaaaaa 10320

aaacttgtga aaatacatgg ccataataca gaacccaata caatgatctc ctttaccaaa 10380

ttgttatgtt tgtacttttg tagatagctt tccaattcag agacagttat tctgtgtaaa 10440

ggtctgactt aacaagaaaa gatttccctt tacccaaaga atcccagtcc ttatttgctg 10500

gtcaataagc agggtcccca ggaatggggt aactttcagc accctctaac ccactagtta 10560

ttagtagact aattaagtaa acttatcgca agttgaggaa acttagaacc aactaaaatt 10620

ctgcttttac tgggattttg ttttttcaaa ccagaaacct ttacttaagt tgactactat 10680

taatgaattt tggtctctct tttaagtgct cttcttaaaa atgttatctt actgctgaga 10740

agttcaagtt tgggaagtac aaggaggaat agaaacttaa gagattttct tttagagcct 10800

cttctgtatt tagccctgta ggattttttt tttttttttt ttttttggtg ttgttgagct 10860

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attaagaatt gagtcctaat ctgttttatt aggtgctttt tgtagtgtct ggtctttcta 25080

aagtgtctaa atgatttttc cttttgactt attaatgggg aagagcctgt atattaacaa 25140

ttaagagtgc agcattccat acgtcaaaca acaaacattt taattcaagc attaacctat 25200

aacaagtaag tttttttttt ttttttgaga aagggaggtt gtttatttgc ctgaaatgac 25260

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t 30001

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<211> 1031

<212> DNA

<213> 智人

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<211> 3244

<212> DNA

<213> 智人

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<223> n is a, c, g, or t

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cacgaggctt tgatatttct tacaacgaat ttcatgtgta gacccactaa acagaagcta 60

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tggattccag gtgactaaag aatacttatt tcttaggata tgttttattg ataataacaa 300

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gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg 120

agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc agtgatgtcg actctttgcc caccgc 176

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<211> 30001

<212> DNA

<213> 猕猴

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<222> (26113)..(26155)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

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<222> (28797)..(29186)

<223> n is a, c, g, or t

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aatctctaag caattttttg gggaagaaag aattgcaatt agggcatacg tgtagatcag 60

atggtcttcg gtatatccaa cgacaaagaa aaggtgggag gtttcgttaa aaaagagaaa 120

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ttttttagtt gggtataaca agaacgaccc aaattgtatg atcaactttc acaaagcata 420

gaacagtagg aaaagggtct gtttctgcag aagatgtaga cgttgagagc cattttatgt 480

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accacctttc taaataccaa tcagggaaga catagttgat ttttaacaaa catttaaaga 3720

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aggaaaaggt taacagaaat agccaatatt tgttcagtgc ctacatgtta gttcctatac 14160

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gtacaagtag aatgtgagca aattatgtat tgaaatggtt cctctccctg caggtctttc 26700

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catgtttttg aagttgttgc catttgcctg caataggcta taaggaatag caggagaaat 28200

tttactgaag tgctattttt ctaggtgcta ctttggcaga gctaagtggt ctgtttcttt 28260

tgtttcctta atgcgtttgg accattttgc tggctgtaaa ataactgatt aatataattc 28320

taacacaata ttgacattgt agtgtacaca aacacaaata ttttatttaa aactggaagt 28380

aacataaaag ggaaaatata tttataagaa aggaataaag gtaatagagc tcttctgtcc 28440

cccagccacc aaatttacac aacaaaatca tatgttctaa tgtgaaaggt cataatagct 28500

ttcccatcat taatcagaaa gatgtggcag cttgattttt tagacaaccc ctgaactaga 28560

tgactgttgt actgtagctc agtcatttaa aaaatatata aatactatct cgtagtgtcc 28620

catactatgt tttttacatg atagattctt atttaagtgc taactggtta ttttctttgg 28680

ctggtttatt gtactgttat atagaatgta agttgtacag tgaaataagt tattaaagca 28740

tgtgtaaaca ttgttatata tcttttctcc tagatggaga attttgaata aaatatnnnn 28800

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28860

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28920

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 28980

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29040

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29100

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 29160

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnagaa gactaattga tcatatcact atgattctca 29220

aagaagaacc aaaacttcat ataatactac aaatatgaga tagttacttc tgtagtatat 29280

ttctgtaatg ctacaggtta aacaggtcac tcttatataa cactattttg attttgatgt 29340

agaattgcac aaattgatat ttcttctatg atctgtaggg tatagcttaa agtagcaaaa 29400

acagtccacc acctccagtt aacacacagt aacactatgg gactagtatt attatttcca 29460

ttttacaaag gaggaaacta aagcttaaag atgtgtaata tacagcccaa ggtcacacag 29520

ctggtaaagg tagatttcat cccagacagt tacagtcatt gccgtgggca cagctcctaa 29580

cttattaact ccatgtaact ggtactcagt ttagttgaat tgaaaggaga gtagggaagc 29640

aggtctgttt gcactattca gagcccaagt gtgaatccct gctgtgctgc ttggagaagt 29700

tacttaacct atgcaaggtt cattttttaa atatttgaaa cggaatgata atacatactt 29760

caccagtggg tttaatgaga ccttataaga tcgttagttc agtacctgac cagtgcttca 29820

taaatgcttt ttcatccaat ctgacaatct ctagcttgta attggggcat ttagaacatt 29880

taatatgatt attggcatgg taggttaaag ttgtcatctt gctgttttct ctttgttctt 29940

ttttctcctt tcttttggat ttttttttaa ttttactgtg tcttctctgt tgtcttatta 30000

a 30001

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

gggtctagca agagcaggtg 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

gtcttggcaa cagctggaga t 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 14

tgatgtcgac tctttgccca ccgc 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tgtgacagtt ggaatgcagt ga 22

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

gccacttaaa gcaatctctg tcttg 25

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 17

tcgactcttt gcccaccgcc a 21

<210> 18

<211> 783

<212> DNA

<213> 智人

<400> 18

gcctctcagt acccgaggct cccttttctc gagcccgcag cggcagcgct cccagcgggt 60

ccccgggaag gagacagctc gggtactgag ggcgggaaag caaggaagag gccagatccc 120

catcccttgt ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc gggaagcccg gggcccggat 180

gcaggcaatt ccaccagtcg ctagaggcga aagcccgaca cccagcttcg gtcagagaaa 240

tgagagggaa agtaaaaatg cgtcgagctc tgaggagagc ccccgcttct acccgcgcct 300

cttcccggca gccgaacccc aaacagccac ccgccaggat gccgcctcct cactcaccca 360

ctcgccaccg cctgcgcctc cgccgccgcg ggcgcaggca ccgcaaccgc agccccgccc 420

cgggcccgcc cccgggcccg ccccgaccac gccccggccc cggccccggc cccggccccg 480

gcccctagcg cgcgactcct gagttccaga gcttgctaca ggctgcggtt gtttccctcc 540

ttgttttctt ctggttaatc tttatcaggt cttttcttgt tcaccctcag cgagtactgt 600

gagagcaagt agtggggaga gagggtggga aaaacaaaaa cacacacctc ctaaacccac 660

acctgctctt gctagacccc gcccccaaaa gagaagcaac cgggcagcag ggacggctga 720

cacaccaagc gtcatctttt acgtgggcgg aacttgtcgc tgtttgacgc acctctcttt 780

cct 783

<210> 19

<400> 19

000

<210> 20

<400> 20

000

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 21

gccttactct aggaccaaga 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 22

ccggccccta gcgcgcgact 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 23

cggcccctag cgcgcgact 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 24

ccggccccta gcgcgcgac 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 25

ccctagcgcg cgactcctga 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 26

cccctagcgc gcgactcctg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 27

gcccctagcg cgcgactcct 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 28

ggcccctagc gcgcgactcc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 29

cggcccctag cgcgcgactc 20

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 30

cctagcgcgc gactcctg 18

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 31

ccctagcgcg cgactcct 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 32

cccctagcgc gcgactcc 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 33

gcccctagcg cgcgactc 18

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 34

ggcccctagc gcgcgact 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 35

cggcccctag cgcgcgac 18

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 36

aggctgcggt tgtttccctc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 37

caggctgcgg ttgtttccct 20

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 38

ggctgcggtt gtttccctc 19

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 39

aggctgcggt tgtttccct 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 40

caggctgcgg ttgtttccc 19

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 41

gctgcggttg tttccctc 18

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 42

ggctgcggtt gtttccct 18

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 43

aggctgcggt tgtttccc 18

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 44

caggctgcgg ttgtttcc 18

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 45

tctgtctttg gagcccaaat 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 46

ctgcgatccc cattccagtt 20

<210> 47

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 47

gccttactct aggaccaa 18

<210> 48

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 48

tctgtctttg gagcccaa 18

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 49

ggttaatctt tatcaggtct 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 50

tggttaatct ttatcaggtc 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 51

ctggttaatc tttatcaggt 20

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 52

gttaatcttt atcaggtc 18

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 53

ggttaatctt tatcaggt 18

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 54

tggttaatct ttatcagg 18

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 55

ctagcgcgcg actcctga 18

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 56

gggacactac aaggtagtat 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 57

tacaggctgc ggttgtttcc 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 58

cccggcccct agcgcgcgac 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 59

ggtaacttca aactcttggg 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 60

aatctttatc aggtcttttc 20