用于确定农药或内分泌干扰物的存在和/或水平的可生物降解的生物化学传感器：方法和组合物

本发明涉及一种使用囊泡封装的生物化学试剂检测和/或量化样品中的农药或内分泌干扰物的方法，所述生物化学试剂包含能够在存在所述目标分析物的情况下产生或抑制特定可测量信号的一种或多种酶。本发明还涉及包括所述囊泡的组合物或试剂盒。

农药用于控制和/或消除植物或动物病虫害。农药按用途可分为除草剂、杀虫剂、杀真菌剂或其它类型，并且它们涉及不同的化学化合物。

农药可按生物靶标、化学结构或安全性特征进行分类。由于农药的高毒性，环保机构为其在饮用水和地表水中的污染水平设定了最大值。根据农药的水溶性，农药要么留在土壤中，要么进入地表水和地下水。

农药残留分析的常规方法，特别是蔬菜和水果中农药残留的分析方法，包含分光光度法、核磁共振光谱法、薄层色谱法、原子吸收光谱法、气相色谱法、液相色谱法、质谱法、荧光法等，其中由于具有良好的重复性、灵敏度以及确定农药类型和浓度的能力，气相色谱法和液相色谱法与质谱法的联用更为常用。此类方法必须通过遵循标准检测步骤以及由具备进行样品预处理和通过仪器操作进行分析的专业知识的实验室技术人员来执行。它们提供具有高重现性的强大痕量分析，但这些技术涉及提取大量水，需要大量纯化，并且需要有资质的人员和昂贵的设备。

近年来，开发了多种利用生物化学反应和电化学技术检测酶抑制性农药的方法，特别是利用固定化酶技术(参见美国专利第6,406,876号(Gordon等人；CN专利CN101082599(Lin等人))。还公开了用于将酶固定在电极上以便通过农药对酶的抑制程度测定水溶液中农药浓度的方法(参见中国台湾专利1301541(Wu等人))。然而，使酶固定的方法很复杂，并且固定化酶的缺点包含成本高、制造工艺复杂和保存条件严格(参见美国专利US20150300976A1(Wang等人)的审查)。

最近在将纳米材料应用于传感器和生物传感器开发方面取得了重大进展。由于纳米材料的小尺寸、纳米材料的大的表面积与体积比；纳米材料的理化性质、组成和形状；以及纳米材料不寻常的靶标结合特性所提供的性质，这些传感器可以显著提高分析物检测的灵敏度和特异性。所述性质以及纳米材料的整体结构稳健性使这些材料非常适合用于基于不同转导模式的各种检测方案(“纳米材料用于传感和破坏农药(Nanomaterials forSensing and Destroying Pesticides.)”Gemma Aragay等人,《化学评论》,2012,112,5317-5338)。

可以引用专利文献美国申请US20150355154A1(Tae Jung Park等人)，其公开了一种能够通过诱导金纳米颗粒聚集来检测有机磷农药残留的传感器系统。

还可以引用专利文献CN102553497A，公开了一种兼具荧光和磁性的多功能化合物-标记纳米球的制备方法及其在通过改变多功能化合物-标记纳米球在选择性吸附到模板的农药分子前后的荧光强度来检测农药残留方面的应用。

最后，还可以引用国际专利申请文献WO 2017/178896A2(Molina等人)，其公开了用于在疾病诊断方法中使用的生物合成装置，所述方法实施能够与样品中需要测试的目标化合物反应的封装酶。

众所周知，内分泌干扰物会通过各种接触途径对人类造成有害影响。这些化学物质似乎主要干扰内分泌或激素系统。同样重要的是，许多研究表明，内分泌干扰物的积累会诱发致命的疾病，包含肥胖症和癌症。(Yang O.等人,《亚太癌症防治杂志(J CancerPrev.)》2015年3月；20(1):12-24)。

内分泌干扰物会影响内分泌系统的各个层面。首先，内分泌干扰物可以破坏参与类固醇生成的酶的作用。这些酶可以被抑制，参与雌激素代谢的酶也可以被抑制。例如，一些多氯联苯(PCB)代谢物会抑制磺基转移酶，从而导致循环雌二醇增加(Kester MH等人,《内分泌学》2000；141:1897-1900)。已知其它内分泌干扰物可促进脂肪生成。这些内分泌干扰物包含联苯A(BPA)有机磷农药、谷氨酸钠和多溴联苯醚(PBDE)。

本发明提供了一种用于检测和/或量化目标分析物的方法，所述目标分析物选自农药和内分泌干扰物残留的组，存在于样品、溶液中或在固体产品表面，具体地说，存在于环境或食物中，其中已知需要测试的所述农药或内分泌干扰物靶标是具有特定酶活性的底物或抑制剂。

在优选的实施例中，本发明涉及这样一种方法，所述方法用于其在农艺食品、环境或健康诊断领域中的应用，更优选农艺食品和环境领域。

例如，草甘膦是一种除草剂，其抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶，所述合酶是莽草酸途径中的关键酶，参与芳香族氨基酸的合成。EPSP抑制作用导致蛋白质合成所需的芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸耗尽。已经开发出具有替代性EPSP酶的草甘膦抗性作物，允许在这些作物上使用草甘膦而不会对作物造成伤害(http://herbicidesymptoms.ipm.ucanr.edu/MOA/EPSP_synthase_inhibitors/)。

在第一方面，本发明涉及一种检测样品中是否存在至少一种目标分析物、或检测所述至少一种目标分析物的相关数量和/或量化所述至少一种目标分析物的量的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使所述样品与组合物接触，其中：

-所述组合物包括形成生物化学网络的生物化学元件，所述生物化学网络封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的一个微囊泡或纳米囊泡(以下称为囊泡)中或囊泡集合中，所述生物化学网络包括作为生物化学元件的至少一种酶，所述至少一种酶具有作为底物或作为抑制剂或作为活化剂的需要检测和/或量化的所述目标分析物，并且其中：

i)所述目标分析物选自由农药和/或内分泌干扰物组成的组，

ii)所述生物化学网络能够：

-当所述目标分析物是所述生物化学网络的所述酶的底物时，仅在存在所述目标分析物的情况下，优选地给定选择的阈值，产生至少一个特定的可读/可测量输出信号；或

-当所述目标分析物是所述生物化学网络的所述酶的抑制剂时，仅在存在所述目标分析物的情况下抑制由所述生物化学网络产生的所述特定的可读/可测量输出信号，以及

b)确定由所述生物化学网络产生的所述特定的可读/可测量输出信号的速率和/或水平，所获得的速率和/或水平与所述样品中是否存在所述目标分析物和/或所述目标分析物的量相关。

在本说明书中，当与权利要求书和/或说明书中的术语“包括(comprising)”结合使用时，“一/一个(a或an)”一词的使用可能意味着“一个”，但也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

此外，使用“包括(comprise)”、“含有(contain)”和“包含(include)”，或这些词根的修改，例如但不限于“包括(comprises)”、“含有(contained)”和“包含(including)”，并非旨在限制。术语“和/或”意指之前和之后的术语可以一起使用或分开使用。出于说明目的，但不作为限制，“X和/或Y”可以意指“X”或“Y”或“X和Y”。

在整个说明书中，包含权利要求书，“包括(comprise)”一词及其变体，如“包括(comprising和comprises)”，以及“具有(have/having)”、“包含(includes和including)”及其变体意指其所指的指定步骤、元件或材料是必不可少的，但可以添加其它步骤、元件或材料并且仍然形成在权利要求书或公开范围内的构造。当在描述本发明和在权利要求书中引用时，其意指本发明和所要求保护的内容被认为是以下内容，并且可能更多。这些术语，特别是当应用于权利要求书时，是包容性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的元件或方法步骤。

术语酶抑制剂旨在表示通过以某种方式干扰酶来降低酶催化反应的速率的化合物。酶抑制剂，例如与酶结合并降低其活性的分子。抑制剂的结合可以阻止底物进入酶的活性位点和/或阻碍酶催化其反应。

术语酶活化剂旨在表示增加酶的速率、活性或速度的化合物。通常，它们是与酶结合的分子。它们的作用与酶的作用相反

术语酶底物旨在表示与酶反应生成产物的化合物。它是酶作用于其上的材料。

生物分子元件旨在表示存在于生物体中的分子，包含大分子，如蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸，以及小分子，如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。

囊泡(或微囊泡或纳米囊泡)旨在表示尺寸(直径)介于5nm和500μm之间，优选地介于10nm和200μm之间，更优选地介于25nm和50μm之间的囊泡。它还旨在表示具有脂质膜(脂质体)或合成聚合物或共聚物的单层或多层囊泡。

囊泡中封装、内化或包含或含有的生物化学元件旨在表示既可以封装在囊泡的内部隔室中，也可以封装到膜(双层或多层膜)中或附着在囊泡膜(外膜或内膜)上的生物化学元件。

在本发明方法的优选实施例中，所述生物分子元件选自合成、半合成的生物分子元件或从天然存在的生物系统中分离。

在更优选的实施例中，所述至少一种生物分子元件选自由以下组成的组：蛋白质、核酸，优选地非编码核酸，和代谢物。酶和代谢物是特别更优选的一种或多种生物分子元件。

当封装在这些颗粒系统中时，这些蛋白质(具体地说，酶)即使在室温下也表现出非常好的稳定性和增强的动力学，并且它们的活性随后可以在室温下长时间保持。

术语目标分析物还旨在表示样品中需要检测或量化的一类或一组农药或内分泌干扰物，当所述类或组中的所有成员都像封装在囊泡或囊泡集合中的所述酶的底物、抑制剂或活化剂一样起作用时。

术语“目标分析物”在本文中通常是指可用本文所述的方法和试剂盒检测的农药或内分泌干扰物的任何分子。可用本文所述的方法和试剂盒检测的农药或内分泌干扰物靶标的非限制性实例包含但不限于化学或生物化学化合物。

作为非限制性实例，农药选自由杀虫剂、除草剂、杀真菌剂组成的组。优选可作为底物或酶活性抑制剂的农药。

作为非限制性实例，内分泌干扰物(ED)选自由以下组成的组：

A)与雌激素受体结合的ED，其具有激动或拮抗作用

i)激动剂(雌激素作用)

双酚A；邻苯二甲酸盐

多酚，包含异黄酮和染料木素

一些UV屏蔽剂(二苯甲酮2；肉桂酸盐；樟脑衍生物)

ii)拮抗剂(抗雄激素作用)

农药、杀真菌剂、除草剂(利谷隆(linurone)、腐霉利(procymidone)、长春花素(vinclocolin))二恶英

B)对酶有影响的Ed

杀真菌剂(唑类)：合成抑制剂：抑制作用影响的合成步骤(甾醇脱甲基酶和染色酶)

异黄酮：甲状腺过氧化物酶的抑制作用

多酚(异黄酮、染料木素)：硫酸酯酶增加减少的磺基转移酶(来自W.Wuttke等人,《激素(Hormones)》2010,9(1):9-15)。

在优选的实施例中，本发明涉及一种用于检测样品中是否存在至少一种目标分析物和/或量化所述至少一种目标分析物的量的方法，所述方法包括以下步骤：

来自含有或易含有目标分析物的样品；

a)使所述样品与包括形成生物化学网络的生物化学元件的组合物接触，所述生物化学网络包括作为生物化学元件的至少一种酶，所述至少一种酶具有作为底物或作为抑制剂或作为活化剂的需要检测和/或量化的所述目标分析物，并且其中：

-形成生物化学网络的所述生物化学元件中的至少一个生物化学元件被封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的一个微囊泡或纳米囊泡(被称为囊泡)中；或

-形成生物化学网络的所述生物化学元件中的至少两个生物化学元件被封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的两个不同囊泡中，

其中：

i)样品中需要检测或量化的所述至少一种目标分析物选自农药或内分泌干扰物的组，更优选地选自农药的组。优选可作为底物或酶活性抑制剂的农药。最优选由杀虫剂、除草剂、杀真菌剂组成的组。

ii)所述生物化学网络能够：

-当所述目标分析物是所述生物化学网络的所述酶的底物时，仅在存在所述目标分析物的情况下产生至少一个特定的可读/可测量输出信号；或

-当所述目标分析物是所述生物化学网络的所述酶的抑制剂时，仅在存在所述目标分析物的情况下抑制由所述生物化学网络产生的所述特定的可读/可测量输出信号，以及

b)确定由所述生物化学网络产生的所述特定的可读/可测量输出信号的速率和/或水平，所获得的速率和/或水平与所述样品中是否存在所述目标分析物和/或所述目标分析物的量相关。

在优选的实施例中，当需要将酶封装在囊泡中或促进酶进入囊泡时，可以使用表面活性剂、溶血素或孔蛋白：

-表面活性剂可用于促进草甘膦通过囊泡膜的转移，因为草甘膦不容易通过脂质膜。可以使用聚氧乙烯胺，如POE氢化牛脂酰胺、POE(3)N-牛脂三亚甲基二胺、POE(15)牛脂胺、POE(5)牛脂胺、POE(2)牛脂胺。

-溶血素或孔蛋白也可以插入膜中，以促进酶、底物或分子的转移，从而通过囊泡膜进行检测(如草甘膦)(Deshpande等人2015,《自然通讯(NATURE COMMUNICATIONS)》|DOI:10.1038/ncomms10447；Vamvakaki等人2007,《生物传感器与生物电子学(BiosensBioelectron.)》2007年6月15日；22(12):2848-53.Epub 2007年1月16日；Karamdad等人2015,《芯片实验室(Lab Chip)》,2015,15,557)。

在优选的实施例中，目标分析物、农药和/或内分泌干扰物是封装在所述囊泡中的至少一种酶的底物，或者是包含在组合物中但未封装在所述囊泡中的至少一种酶的底物。

在也优选的实施例中，目标分析物、农药和/或内分泌干扰物是封装或未封装在所述囊泡中的至少一种所述酶的活性抑制剂。

在优选的实施例中，易含有目标分析物的样品选自由以下组成的组：流体或固体材料样品，优选环境材料样品、植物材料、水(如饮用水、饮料、废水、河流或海水)、食品、土壤提取物、工业材料、食品生产、植物提取物、生理液体(尿液、血液、汗液、植物汁液等)或来自活生物体(哺乳动物、植物、家禽等)的组织。

活生物体的组织的非限制性实例包含软组织、硬组织、皮肤、表面组织、外部组织、内部组织、膜、胎儿组织和内皮组织。

当样品来自食物来源时，食物来源的非限制性实例可以是植物(优选可食用植物)谷物/种子、饮料、牛奶和乳制品、鱼、贝类、蛋、商业制备的和/或易腐烂的动物或人类消费食品。

如上所述，样品可以在外部环境中，如土壤、水道、污泥、商业污水等。

样品旨在特别表示疑似含有所关注的一种或多种分析物的材料的样品，所述材料可以是流体或具有足够的流动性以流过在本发明的方法中实施的组合物的囊泡或与所述囊泡接触。流体样品可以作为直接从来源获得的或在预处理以改变其特性后获得的使用。此类样品可以包含如上所列但不限于的人类、动物、植物或人造样品。样品可以在不干扰测定的任何方便的介质中制备。通常，样品是水溶液或生物流体，或固体材料的表面。

因此，所述样品也可以表示疑似含有所关注的一种或多种分析物的固体材料的表面，所述固体材料可以是多孔的或无孔的，并且可以选自人造材料、食品、植物、种子、果实等。在这种情况下，在本发明的方法中实施并包括囊泡的组合物可以直接施加到该固体材料的表面上，例如与本发明的组合物一起以多孔凝胶的形式，如多孔聚合物珠(例如琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、葡聚糖、丙烯酰胺聚合物衍生物珠)，其中保留了组合物的囊泡。

在优选的实施例中，本发明的方法的特征在于，通过与试剂相关的信号检测目标分析物的存在或相关数量和/或量，所述试剂选自由以下组成的组：比色剂、电子转移剂、酶、荧光剂、提供与目标分析物的存在和/或量相关的所述可检测或可量化信号的试剂。

本发明还涉及一种检测样品中是否存在至少两种不同目标分析物和/或量化所述至少两种不同目标分析物的量的方法，其中所述不同分析物是封装或未封装在囊泡中的相同的至少一种生物化学网络酶的底物或抑制剂或活化剂。

事实上，作用于相同的囊泡封装酶或未封装的酶或作用于相同的生物化学网络酶(作为底物或作为抑制剂)的两种不同分析物的存在可以放大发射的信号。

例如，(参见实例6，图6、7和12)，可以通过本发明方法中使用的相同生物化学网络分别检测或量化第一目标分析物(即草甘膦)和第二目标(即甘氨酸)的检测。此外，使用根据本发明的相同生物化学网络，可以同时检测和/或量化两种目标分析物(参图12)。

本发明方法的优点之一是减少或去除通常存在的背景噪声，当在化合物的检测或量化方法中使用不同的生物化学元件或生物化学网络时，所述背景噪声会造成困难。

在相同的装置或组合物中，在溶液中、封装在囊泡中或捕获在凝胶基质中或固体表面中的生物化学元件可以显著降低这些背景噪音。

当需要时，例如当特定信号不能直接通过目测读取时，可以通过比色测量、荧光、光谱(即红外、拉曼(Raman))、化学化合物或粒子(电子)产生来检测或量化信号。

在本发明方法的优选实施例中，能够由所述生物化学网络产生的所述输出信号选自生物信号、化学信号、电子信号或光子信号，优选可读的和任选地可测量的物理化学输出信号。

在可用作输出信号的信号中，可以特别引用例如比色信号、荧光信号、发光信号或电化学信号。这些实例并非旨在限制可用于本发明的输出信号。这些信号的选择主要取决于在灵敏度或技术资源方面的测定规范。重要的是，比色输出是人类可读的，这是集成到低成本、易于使用的护理点装置中的重要性质，而例如发光信号提供超高灵敏度和宽动态检测范围。然而，除了测量传统的终点信号之外，还存在其它生物传感框架，并且可以通过生物系统固有的性质实现这些生物传感框架。因此可以定义不同的读出模式，如线性、频率或阈值，或多值检测模式。

在另一方面，本发明的方法可用于检测和/或量化同一样品中两种不同目标分析物的存在，并且其中在所述方法中实施的组合物包括形成两个不同的生物化学网络的两个不同的生物化学元件集合，所述生物化学网络封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的相同或至少两个不同的囊泡或囊泡集合中，所述生物化学元件中的每一个生物化学元件包括至少一种不同的酶，所述至少一种不同的酶具有作为底物或抑制剂或活化剂的需要检测和/或量化的目标分析物中的仅一个。在这种情况下，在本发明的方法中实施的组合物含有至少两个不同的生物化学元件集合，所述生物化学元件中的每一个生物化学元件形成不同的生物化学网络，从而产生不同的可读/可测量输出信号，所述两个不同的生物化学元件集合被封装在相同的囊泡或不同的囊泡集合中，或者形成生物化学网络的所述生物化学元件中的至少一个生物化学元件和对于两个不同的生物化学网络中的每一个生物化学网络都被封装在相同的囊泡或不同的囊泡集合中。

因此，本发明还涉及一种检测样品中是否存在至少两种不同目标分析物和/或量化所述至少两种不同目标分析物的量的方法，其中：

-所述不同分析物是两种不同的生物化学网络酶的底物或抑制剂，并且其中：

-至少并且对于所述两个不同的生物化学网络中的每一个生物化学网络，形成所述生物化学网络的所述生物化学元件中的一个生物化学元件被封装在对目标分析物可渗透或不可渗透的囊泡中；或

-形成所述生物化学网络的所述生物化学元件中的至少两个生物化学元件被封装在对目标分析物可渗透或不可渗透的两个不同囊泡中；并且

-所述不同的生物化学网络(互连或不互连)产生不同的可读/可测量输出信号。

“互连的生物化学网络”在此旨在表示两个不同的生物化学网络可以具有共同的生物化学元件或网络的相同的共同步骤或部分。

在优选的实施例中，本发明的方法的特征在于需要检测和/或量化的农药或内分泌干扰物是生物化学网络的生物化学元件，所述生物化学网络可以在一个或多个步骤中产生特定的可读/可测量输出信号，所述生物化学元件优选地选自由以下组成的组：大分子、肽、蛋白质、代谢物、酶、核酸、金属离子。

更优选地，需要检测和/或量化的农药或内分泌干扰物选自由以下组成的组：

a)作为酶活性的特定底物的农药或内分泌干扰物分子，所述活性可以在一个或多个步骤中产生特定的可读/可测量输出信号；或

b)作为酶活性的特定抑制剂的农药或内分泌干扰物分子，所述活性可以在一个或多个步骤中产生特定的可读/可测量输出信号；或

c)作为酶活性的特定活化剂的农药或内分泌干扰物分子，所述活性可以在一个或多个步骤中产生特定的可读/可测量输出信号。

在更优选的实施例中，作为酶活性的特定底物的农药或内分泌干扰物分子，所述活性可以在一个或多个步骤中产生与样品中该目标分析物的存在和/或量相关的特定的可读/可测量输出信号，选自由草甘膦(甘氨酸/草甘膦氧化酶的底物)和十氯酮(十氯酮还原酶底物)组成的组。

在也更优选的实施例中，作为酶活性的特定抑制剂的农药或内分泌干扰物分子，所述活性可以在一个或多个步骤中产生与样品中该目标分析物的存在和/或量相关的特定的可读/可测量输出信号，选自由以下组成的组：草甘膦(EPSPS抑制剂)、十氯酮(雌激素受体干扰剂)、氨基甲酸酯(乙酰胆碱酯酶抑制剂)、琥珀酸脱氢酶抑制剂杀真菌剂(SDHI杀真菌剂)。优选的SDHI杀真菌剂选自氧噻吩甲酰胺、苯基-苯甲酰胺、噻唑-甲酰胺、呋喃-甲酰胺、吡啶-甲酰胺、吡唑-甲酰胺和吡啶基-乙基-苯甲酰胺的组。新烟碱类(乙酰胆碱受体活性抑制剂)优选地选自氯吡啶基、三氟吡啶基、氯噻唑基、四氢呋喃基、苯基吡唑的组。

可以引用其它杀真菌剂，如苯胺嘧啶(AP)杀真菌剂、羧酸酰胺(CAA)杀真菌剂和甾醇生物合成抑制剂(SBI)，它们也是酶活性的特定抑制剂(有关这些化合物的完整信息，参见网站

选自由以下组成的组的农药或内分泌干扰物分子也是优选的：新烟碱、有机氯化物、二恶英(PCDD)、多氯联苯(PCB)、17-β雌二醇、17-α乙烯雌二醇、双酚(PBDE)、邻苯二甲酸盐、重金属(Cr、Mn、Pb、Li、Hg等)。

在也更优选的实施例中，形成生物化学网络的元件包括至少封装在囊泡中的至少一种酶，所述至少一种酶选自由以下组成的组：甘氨酸/草甘膦氧化酶(EC 1.4.3.19)、乙酰胆碱酯酶(EC3.1.1.7)、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(EC 2.5.1.19)和琥珀酸脱氢酶(EC 1.3.5.1)。

在另一个更优选的实施例中，样品中需要检测和/或量化的至少农药或内分泌干扰物目标分析物是草甘膦。

在更优选的实施例中，本发明涉及一种根据本发明的方法，所述方法用于检测样品中是否存在作为目标分析物的至少草甘膦和/或量化所述草甘膦的量，所述方法包括以下步骤：

来自含有或易含有草甘膦的样品；

a)使所述样品与包括形成生物化学网络的生物化学元件的组合物接触，所述生物化学网络包括作为生物化学元件的至少一种酶，所述至少一种酶具有作为底物或作为抑制剂或作为活化剂的需要检测和/或量化的所述目标分析物，并且其中：

-形成生物化学网络的所述生物化学元件中的至少一个生物化学元件被封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的一个囊泡中；或

-形成生物化学网络的所述生物化学元件中的至少两个生物化学元件被封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的两个不同囊泡中，

其中：

i)所述生物化学网络能够：

-当所述目标分析物是所述生物化学网络的所述酶的底物时，仅在存在所述目标分析物的情况下产生至少一个特定的可读/可测量输出信号；或

-当所述目标分析物是所述生物化学网络的所述酶的抑制剂时，仅在存在所述目标分析物的情况下抑制由所述生物化学网络产生的所述特定的可读/可测量输出信号，以及

b)确定由所述生物化学网络产生的所述特定的可读/可测量输出信号的速率和/或水平，所获得的速率和/或水平与所述样品中是否存在草甘膦和/或所述草甘膦的量相关。

在优选的实施例中，形成生物化学网络的生物化学元件包括至少封装或未封装在囊泡中的甘氨酸/草甘膦氧化酶(EC 1.4.3.19)。

在优选的实施例中，所述甘氨酸/草甘膦氧化酶是可以作为重组蛋白获得的天然(或野生型/WT)甘氨酸/草甘膦氧化酶。

在更优选的实施例中，所述甘氨酸/草甘膦氧化酶包括与甘氨酸/草甘膦氧化酶融合的标签，具体地说，为了增强重组表达及其与天然序列相比的溶解性(JeffreyG.Marblestone等人(《(蛋白质科学(Protein Sci.)》2006年1月；15(1):182-189))。

在可以使用但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)、NUS A、泛素(Ub)和SUMO(小泛素相关修饰物)标签中，可以引用标签。

包括SUMO和GST的标签是特别优选的标签。

在也更优选的实施例中，所述甘氨酸/草甘膦氧化酶是来自海洋细菌地衣芽孢杆菌的甘氨酸氧化酶(GO)((BliGO)，所述甘氨酸氧化酶已经被克隆并且相对于来自枯草芽孢杆菌的标准GO显示出62％的相似性(参见“一种来自地衣芽孢杆菌的新型甘氨酸氧化酶BliGO的表征和定向进化(Characterization and directed evolution of BliGO,anovel glycine oxidase from Bacillus licheniformis.)”Zhang K等人(《酶与微生物技术(Enzyme Microb Technol.)》2016年4月；85:12-8.)。与BliGO WT蛋白质序列具有至少60％、70％、优选75％、80％、85％、90％或95％同一性(使用例如标准BLAST-P或BLAST-N软件进行比对)并且优选地在相同的活性测试条件下表现出至少GO活性(优选地，至少50％的BliGO WT GO活性)的同源序列也是优选的。

优选具有DNA序列SEQ ID NO:5或氨基酸序列SEQ ID NO:6的GST-BliGO(天然/WT)(参见图16)和具有DNA序列SEQ ID NO:9或氨基酸序列SEQ ID NO:10的SUMO-BliGO(天然/WT)(参见图18)，或其如上定义的同源标记的BliGO序列，其中BliGO序列相对于WT BliGO展现出至少70％，优选地，75％、80％、85％、90％或95％的同一性。

在更优选的实施例中，所述甘氨酸/草甘膦氧化酶是来自海洋细菌地衣芽孢杆菌的突变型甘氨酸氧化酶(GO)((BliGO)-SCF4，与野生型版本BliGO-WT相比，所述突变型甘氨酸氧化酶经基因修饰并含有6个单氨基酸突变，所述突变型甘氨酸氧化酶已被克隆并且相对于来自枯草芽孢杆菌的标准GO显示出62％的相似性(参见“一种来自地衣芽孢杆菌的新型甘氨酸氧化酶BliGO的表征和定向进化”Zhang K等人(《酶与微生物技术》2016年4月；85:12-8.)。

还优选具有DNA序列SEQ ID NO:7或氨基酸序列SEQ ID NO:8的GST-BliGO_Mut(参见图17)和具有DNA序列SEQ ID NO:11或氨基酸序列SEQ ID NO:12的SUMO-BliGO_Mut(参见图19)。

在优选的实施例中，除了甘氨酸/草甘膦氧化酶(EC 1.4.3.19)之外，形成生物化学网络的生物化学元件进一步包括至少封装在同一颗粒或另一个囊泡中的过氧化物酶，优选辣根过氧化物酶(HRP)酶(EC.1.11.17)，和可被氧化的过氧化物酶的底物，优选邻联茴香胺(O-dianisidine)、连苯三酚或安普莱克司红(amplex red)、2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)酸(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、高香草酸、酪胺(Tyramin)或鲁米诺(Luminol)。

在另一个更优选的实施例中，样品中需要检测和/或量化的农药或内分泌干扰物目标分析物是草甘膦，并且其中形成生物化学网络的生物化学元件包括至少封装在囊泡中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(EPSPS)酶(EC 2.5.1.19)、3-磷酸-莽草酸和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。

在优选的实施例中，除了5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(EPSPS)酶(EC2.5.1.19)之外，形成生物化学网络的生物化学元件进一步包括3-磷酸-莽草酸和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、至少封装在同一颗粒或另外一个或多个颗粒中的分支酸合酶(EC.4.2.3.5)、分支酸裂解酶(EC.4.1.3.40)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27)及其NADH底物。

在另一个更优选的实施例中，样品中需要检测和/或量化的农药或内分泌干扰物目标分析物是草甘膦，并且其中形成生物化学网络的生物化学元件包括至少封装在囊泡中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(EPSPS)酶(EC 2.5.1.19)、3-磷酸-莽草酸和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，以及在同一颗粒或另外一个或多个颗粒中的嘌呤核苷磷酸化酶(EC.2.4.2.1.)及其肌苷底物、黄嘌呤氧化酶(EC1.17.3.2)、过氧化物酶，优选辣根过氧化物酶(HRP)酶(EC.1.11.17)，以及可被氧化的过氧化物酶的底物，优选邻-联茴香胺、连苯三酚或安普莱克司红、2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)酸(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、高香草酸、酪胺或鲁米诺。

在优选的实施例中，囊泡选自由以下组成的组：单层或多层囊泡，优选脂质囊泡、脂质体或自组装磷脂，或由合成聚合物或共聚物形成的囊泡，所述囊泡的平均直径优选为0,01μm到500μm，优选地，0.01μm到100μm，更优选地0.05μm到50μm或0.05μm到10μm。

例如，但不限于，在本发明的方法中实施的组合物的生物化学元件可以被分隔/封闭或封装在隔室中，例如在囊泡系统或任何其它类型的隔室中，所述其它类型的隔室具有或不具有囊泡性质，如但不限于：多孔凝胶、多孔聚合物珠、组装的磷脂(如脂质体)、合成共聚物。

在本说明书中，针对“封装的”，也使用“封闭的”或“分隔的”这样的词语，它们具有相同的含义。

在优选的实施例中，在本发明的方法中实施的组合物的囊泡被捕获在多孔聚合物凝胶中，所述多孔聚合物凝胶优选地选自由海藻酸盐、壳聚糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PVA(聚乙烯醇)、琼脂糖、sephadex、sepharose、sephacryl及其混合物组成的多孔聚合物凝胶的组。

例如，根据本发明，检测样品中是否存在至少一种目标分析物和/或量化所述至少一种目标分析物的量的方法包括以下步骤：

a)使在本发明方法中实施的组合物与易含有所述目标分析物化合物的样品接触，以产生混合物，

b)在适于进行至少一种生物化学反应的条件下孵育所述混合物，以产生至少所述输出信号，优选可读/可测量的物理化学输出信号，其中所述输出信号表示所述样品中需要分析的化合物的存在、或相关数量和/或水平。

c)检测或测量在步骤b)中产生的输出信号，以及

d)根据步骤c)中产生/测量的信号确定所述化合物的存在和/或水平。

还应当理解的是，在本发明方法的某些实施例中，该所述方法可以在期望的持续时间内检测一种或多种目标分析物。持续时间可以是计算出的第一预定时间间隔和至少第二预定时间间隔。在某些实施例中，在测试时间间隔期间计算分析物相关值。

在第二方面，本发明涉及一种检测样品中是否存在至少一种目标分析物和/或量化所述至少一种目标分析物的量的组合物，所述组合物包括形成生物化学网络的生物化学元件，所述生物化学网络封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的一个囊泡中或囊泡集合中，所述生物化学网络包括作为生物化学元件的至少一种酶，所述至少一种酶具有作为底物或作为抑制剂的需要检测和/或量化的所述目标分析物，并且其中：

i)所述目标分析物选自由农药和/或内分泌干扰物组成的组，

ii)所述生物化学网络能够：

a)当所述目标分析物是所述生物化学网络的所述酶的底物时，仅在存在所述目标分析物的情况下产生至少一个特定的可读/可测量输出信号；或

b)当所述目标分析物是所述生物化学网络的所述酶的抑制剂时，仅在存在所述目标分析物的情况下抑制由所述生物化学网络产生的所述特定的可读/可测量输出信号。

在优选的实施例中，囊泡对于目标分析物是可渗透的。

在优选的实施例中，根据本发明的组合物包括囊泡或囊泡集合，所述囊泡或囊泡集合具有如在针对本发明的方法实施的组合物中所定义的特性。

在更优选的实施例中，本发明的所述组合物包括形成生物化学网络的生物化学元件，所述生物化学网络封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的一个囊泡中或囊泡集合中，所述生物化学网络包括：

A)作为生物化学元件的选自以下组中的生物化学元件之一：

-甘氨酸/草甘膦氧化酶(EC 1.4.3.19)、乙酰胆碱酯酶(EC3.1.1.7)、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(EC 2.5.1.19)和琥珀酸脱氢酶(EC 1.3.5.1)，以及任选的，

-i)除了甘氨酸/草甘膦氧化酶(EC 1.4.3.19)之外，至少一种过氧化物酶，优选辣根过氧化物酶(HRP)酶(EC.1.11.17)，以及任选的可被氧化的过氧化物酶的底物，优选邻联茴香胺、连苯三酚或安普莱克司红、2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)酸(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、高香草酸、酪胺或鲁米诺，以及任选的，

-ii)除了5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(EPSPS)酶(EC 2.5.1.19)之外，至少3-磷酸-莽草酸和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，以及任选的另外的：

ii)a)分支酸合酶((EC.4.2.3.5)、分支酸裂解酶(EC.4.1.3.40)、乳酸脱氢酶(EC1.1.1.27)及其NADH底物，或

ii)b)嘌呤核苷磷酸化酶(EC.2.4.2.1.)及其肌苷底物、黄嘌呤氧化酶(EC.1.17.3.2)、过氧化物酶，优选辣根过氧化物酶(HRP)酶(EC.1.11.17)，以及可被氧化的过氧化物酶的底物，优选邻-联茴香胺、连苯三酚或安普莱克司红、2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)酸(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、高香草酸、酪胺或鲁米诺；

以及

B)作为囊泡的选自由以下组成的组的囊泡：

-单层或多层囊泡，优选脂质囊泡、脂质体或自组装磷脂，或由合成聚合物或共聚物形成的囊泡，所述囊泡的平均直径优选为0,01μm到500μm，优选地，0.01μm到100μm，更优选地0.05μm到50μm或0.05μm到10μm；和/或

-具有或不具有囊泡性质的囊泡，如但不限于：多孔凝胶、多孔聚合物珠、组装的磷脂(如脂质体)、合成共聚物。

在更优选的实施例中，本发明的组合物的囊泡被捕获在多孔聚合物凝胶中，所述多孔聚合物凝胶优选地选自由海藻酸盐、壳聚糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PVA(聚乙烯醇)、琼脂糖、sephadex、sepharose、sephacryl及其混合物组成的多孔聚合物凝胶的组。

在更优选的实施例中，本发明的组合物涉及一种包括形成生物化学网络的生物化学元件的组合物，所述生物化学网络封装或未封装在对所述目标分析物可渗透或不可渗透的一个囊泡中或囊泡集合中，所述生物化学网络包括作为生物化学元件的至少一种酶，所述至少一种酶选自以下组：

-甘氨酸/草甘膦氧化酶(EC 1.4.3.19)，优选可以作为重组蛋白获得的天然(野生型/WT)甘氨酸/草甘膦氧化酶，或其同源序列，所述同源序列与WT蛋白质序列具有至少70％的同一性并表现出甘氨酸/草甘膦氧化酶活性；

-5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(EC 2.5.1.19)；

-来自海洋细菌地衣芽孢杆菌的甘氨酸氧化酶(GO)((BliGO)，所述甘氨酸氧化酶已经被克隆并且相对于来自枯草芽孢杆菌的标准GO显示出至少62％的相似性，或其同源BliGO序列，所述同源序列与BliGO WT蛋白质序列具有至少70％的同一性并表现出GO活性；

-来自海洋细菌地衣芽孢杆菌的突变型甘氨酸氧化酶(GO)((BliGO)_SCF4(也被称为BliGO-Mut)，与野生型版本BliGO-WT相比，所述突变型甘氨酸氧化酶经基因修饰并含有6个单氨基酸突变；

-标记的草甘膦氧化酶，优选地带有选自由以下组成的组的标签：麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)、NUS A、泛素(Ub)和SUMO(小泛素相关修饰物)标签，优选SUMO和GST标签；以及

-具有DNA序列SEQ ID NO:5或氨基酸序列SEQ ID NO:6的GST-BliGO(天然/WT)；

-具有DNA序列SEQ ID NO:9或氨基酸序列SEQ ID NO:10的SUMO-BliGO(天然/WT)；

-具有DNA序列SEQ ID NO:7或氨基酸序列SEQ ID NO:8的GST-BliGO-Mut和具有DNA序列SEQ ID NO:11或氨基酸序列SEQ ID NO:12的SUMO-BliGO-Mut以及

其如上定义的同源标记的BliGO序列，其中BliGO序列表现出至少70％，以及任选的如上定义的一个囊泡，并且其中形成生物化学网络的至少一个生物化学元件被封装在囊泡中和/或捕获在凝胶基质中。

在第三方面，本发明涉及一种检测样品中是否存在至少一种目标分析物、或所述至少一种目标分析物的相关数量的存在和/或量化所述至少一种目标分析物的量的试剂盒或装置，所述试剂盒包括容器，所述容器含有根据本发明的组合物或如上文所定义的在针对本发明的方法实施的组合物中，其中所述组合物的囊泡被捕获在多孔聚合物凝胶中，所述多孔聚合物凝胶优选地选自由多孔聚合物凝胶组成的组，所述多孔聚合物凝胶优选地选自由海藻酸盐、壳聚糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PVA(聚乙烯醇)、琼脂糖、sephadex、sepharose、sephacryl及其混合物组成的组。

应当理解，前述一般描述和以下详细描述均仅是示例性和说明性的，并非旨在限制当前教导的范围。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包含复数。

本领域的普通技术人员将认识到，以下对实施例的详细描述仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。受益于本公开的此类技术人员将容易地理解提其它实施例。本文对“实施例”、“方面”或“实例”的引用表示如此描述的本发明的实施例可以包含特定特征、结构或特性，但并非每个实施例都必须包含所述特定特征、结构或特性。进一步地，短语“在一个实施例中”的重复使用不一定指代相同的实施例，尽管它可以。

选择以下实施例、附图和图例，为本领域技术人员提供完整的描述，以便能够实施和使用本发明。这些实施例并非旨在限制发明人认为是其发明的范围，也不旨在表明仅进行了以下实验。

本发明的其它特性和优点将在说明书的其余部分连同实施例和附图中显现，其图例在下文中给出。

附图说明：

图1：甘氨酸/草甘膦生物化学网络#1的示意图。该网络包括用于比色或荧光读出的GST-BliGO Mut#1酶、HRP酶和安普莱克司红或联茴香胺。

图2A-2B：用于草甘膦检测的EPSP合酶生物化学网络#2A和#2B的示意图。

网络#2A(图2A)包括用于吸光度或荧光检测的EPSP合酶、分支酸合酶、分支酸裂解酶、乳酸脱氢酶和NADH。

网络#2B包括用于比色或荧光读出的EPSP合酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、HRP酶和安普莱克司红或邻联茴香胺。

图3：囊泡形成的微流体过程(来自Courbet等人《分子系统生物学(Mol.Sys.Biol.)》2018,14(4):e7845.图4A))

图4A-4B：

图4A：通过甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#1进行的吸光度草甘膦检测。检测范围为0到10mM的草甘膦。

图4B：甘氨酸/草甘膦氧化酶催化活性分析。

图5A-5B：

图5A：通过甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#2B进行的荧光磷烯醇丙酮酸(PEP)检测。检测范围为0到100μM的PEP。图5B：EPSP合酶催化活性分析。

图6：用于甘氨酸检测的甘氨酸生物化学网络#3的示意图。该网络包括用于比色或荧光读出的枯草芽孢杆菌甘氨酸氧化酶H244K酶、HRP酶和安普莱克司红或邻联茴香胺。

图7：用于草甘膦和甘氨酸检测的草甘膦或甘氨酸生物化学网络#4的示意图。该网络包括用于比色或荧光读出的GST-BliGO Mut#1酶、枯草芽孢杆菌甘氨酸氧化酶H244K酶、HRP酶和安普莱克司红或邻联茴香胺。

图8A-8B：通过甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#1进行的荧光(上半部分)和比色(下半部分)草甘膦检测。(A-左)在Tris缓冲液50mM pH 7,5中检测范围为0到2mM的草甘膦。(B-右)在Tris缓冲液50mM pH 7,5中在提取的大麦种子中检测范围为0到2mM的草甘膦。

图9A-9B：通过集成在囊泡中的甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#1进行的荧光(上半部分)和比色(下半部分)草甘膦检测。(A-左)在Tris缓冲液50mM pH 7,5中检测范围为0到2mM的草甘膦。(B-右)在Tris缓冲液50mM pH 7,5中在提取的大麦种子中检测范围为0到2mM的草甘膦。

图10：通过集成在藻酸盐珠中的甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#1进行的比色草甘膦检测。(上半部分)在Tris缓冲液50mM pH 7,5中检测范围为0到4mM的草甘膦。(下半部分)在Tris缓冲液50mM pH 7,5中在提取的大麦种子中检测范围为0到4mM的草甘膦。

图11：通过甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#3进行的荧光(上半部分)和比色(下半部分)甘氨酸检测。(左)在Tris缓冲液50mM pH 7,5中检测范围为0到1mM的甘氨酸。注意没有检测到100μM的草甘膦。

图12：通过甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#4进行的荧光草甘膦和甘氨酸检测。(上半部分)通过网络进行的草甘膦和/或甘氨酸降解的动力学。草甘膦和甘氨酸的浓度为1mM。(下半部分)甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#4逻辑门(OR)对甘氨酸和/或草甘膦存在的响应。

图13：通过EPSP合酶网络#2B进行的荧光草甘膦检测。通过网络进行的草甘膦降解的动力学。检测范围为0到1mM的草甘膦。

图14：BliGO_WT(天然)蛋白质：DNA(SEQ ID NO:1)和氨基酸(SEQ ID NO:2)序列

图15：BliGO_Mut蛋白质：DNA(SEQ ID NO:3)和氨基酸(SEQ ID NO:4)序列

图16：GST-BliGO_WT(天然)蛋白质：DNA(SEQ ID NO:5)和氨基酸(SEQ ID NO:6)序列

图17：GST-BliGO_Mut蛋白质：DNA(SEQ ID NO:7)和氨基酸(SEQ ID NO:8)序列

图18：SUMO-BliGO_WT蛋白质：DNA(SEQ ID NO:9)和氨基酸(SEQ ID NO:10)序列

图19：SUMO-BliGO_Mut蛋白质：DNA(SEQ ID NO:11)和氨基酸(SEQ ID NO:12)序列。

实例1：研究设计—生物化学网络的设定

不同的生物化学网络被设计用于检测不同农药和/或内分泌干扰物的存在。我们发明的一个独创性在于，不同的生物化学网络可以连接在一起以允许检测不同的分析物并在必要时导致单个输出信号的传递。

对于草甘膦农药的特异性检测，我们设计了两个检测系统，二者可以组合在一起以提高输出信号的特异性：

1.第一网络使用甘氨酸/草甘膦氧化酶代谢草甘膦的能力(图1)。

在第一个实例中，所述第一网络包括：

a)甘氨酸/草甘膦氧化酶、辣根过氧化物酶和邻联茴香胺二盐酸盐。在存在草甘膦的情况下，甘氨酸/草甘膦氧化酶会产生2-氨基膦酸盐和H

首先，该网络已经在没有囊泡或凝胶的液体缓冲液中进行了测试。100μl反应系统包括30mM焦磷酸二钠(pH 8.5)、0.46μM(0.0024单位)来自枯草芽孢杆菌(Biovision#7845)的甘氨酸/草甘膦氧化酶H244K、0.5mM邻联茴香胺二盐酸盐以及0.25单位的辣根过氧化物酶和浓度范围为0到600mM的草甘膦。通过在分光光度计上记录450nm处的吸光度，在25℃下进行反应，持续1小时。

在第二个实例中，所述第一网络可以包括：

b)GST-地衣芽孢杆菌Mut#1或SCF-4甘氨酸/草甘膦氧化酶、辣根过氧化物酶和安普莱克司红。在存在草甘膦的情况下，甘氨酸/草甘膦氧化酶会产生2-氨基膦酸盐和H

首先，该网络已经在没有囊泡或凝胶的液体缓冲液中进行了测试(图8A-8B)。100μl反应系统包括50mM Tris(pH 7.5)、0.46μM(0.0024单位)来自地衣芽孢杆菌的甘氨酸/草甘膦氧化酶GST-BliGO Mut#1(其经基因修饰并衍生自与野生型版本相比含有6个单氨基酸突变的BliGO-SCF-4)、.2mM安普莱克司红、0.25单位的辣根过氧化物酶和浓度范围为0到2mM的草甘膦。该网络也已经在存在大麦提取物的情况下进行了测试(图8B)。通过在分光光度计上记录荧光(530nm处的激发/590nm处的发射)，在25℃下跟踪反应，持续1小时。

该网络也已经在囊泡中进行了测试(图9A-9B)。囊泡包括50mM Tris(pH 7.5)、0.2mM安普莱克司红和0.25单位的辣根过氧化物酶。将0.46μM(0.0024单位)来自地衣芽孢杆菌的甘氨酸/草甘膦氧化酶GST-BliGO Mut#1和浓度范围为0到2mM的草甘膦添加到囊泡外的反应中。通过在分光光度计上记录荧光(530nm处的激发/590nm处的发射)，在25℃下跟踪反应，持续1小时。

该网络也已经在藻酸盐珠中进行了测试(图10)。藻酸盐珠包括50mM Tris(pH7.5)、0.2mM安普莱克司红、0.25单位的辣根过氧化物酶。0.46μM(0.0024单位)来自地衣芽孢杆菌的甘氨酸/草甘膦氧化酶GST-BliGO。将珠子浸入50mM Tris缓冲液(pH 7,5)或含有浓度为0到4mM的草甘膦的大麦提取物中。在25℃下跟踪反应(珠子的比色法)，持续1小时。

2.第二网络组合了4种酶的活性，第一种酶是5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)(图2A-2B)。

该网络利用草甘膦抑制EPSP合酶活性的能力。有了这个网络，抑制水平取决于草甘膦的浓度。网络的入口由以下构成：EPSP合酶，其使用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸，以产生5-O-(1-羧乙烯基)-3-磷酸莽草酸盐和无机磷酸盐。

然后测试了2个不同的网络：

-一个网络转化无机磷酸盐(Pi)：在存在嘌呤核苷磷酸化酶的情况下，Pi与肌苷结合生成次黄嘌呤。在存在黄嘌呤氧化酶的情况下，次黄嘌呤导致黄嘌呤和H

首先，该网络已经在没有囊泡或凝胶的液体缓冲液中进行了测试。100μl反应系统包括50mM Hepes(pH 7)、50mM KCl、0.5mM莽草酸-3-磷酸盐、0.1单位的黄嘌呤氧化酶、0.12μg大肠杆菌EPSP合酶、0.2单位的嘌呤核苷磷酸化酶、2.25mM嘌呤、0.5mM邻联茴香胺二盐酸盐、0.25单位的辣根过氧化物酶、介于0和600μM之间的磷酸烯醇丙酮酸盐以及浓度范围为0到2mM的草甘膦。通过在分光光度计上记录450nm处的吸光度，在25℃下进行反应，持续1小时。

-一个网络转化由EPSP合酶产生的5-O-(1-羧乙烯基)-3-磷酸莽草酸盐：5-O-(1-羧乙烯基)-3-磷酸莽草酸盐被分支酸合酶代谢为分支酸盐。然后该分支酸盐被分支酸裂解酶转化为丙酮酸盐。最后，丙酮酸盐在存在NADH的情况下被乳酸脱氢酶使用，以产生乳酸和NAD+。NADH的消耗之后是分光光度计上445nm处的荧光发射变化(340nm处的激发)-或340nm处的吸光度变化。

3.第三个网络(#3)利用枯草芽孢杆菌H244K(创造性酶)酶甘氨酸/草甘膦氧化酶代谢甘氨酸的能力(图6)。

该网络包括：枯草芽孢杆菌H244K甘氨酸/草甘膦氧化酶、辣根过氧化物酶和安普莱克司红。在存在甘氨酸但不存在草甘膦的情况下，甘氨酸/草甘膦氧化酶会产生乙醛酸盐和H

首先，网络已经在没有囊泡或凝胶的液体缓冲液中进行了测试(图11)。100μl反应系统包括50mM Tris(pH 7.5)、0.46μM(0.0024单位)来自枯草芽孢杆菌的经基因修饰的H244K甘氨酸/草甘膦氧化酶(与野生型版本(创造性酶NATE-1674)相比，其含有1个单氨基酸突变H244K(参见登录号031616，Biovision))、0.2mM安普莱克司红、0.25单位的辣根过氧化物酶和浓度范围为0到1mM的甘氨酸。通过在分光光度计上记录荧光(530nm处的激发/590nm处的发射)，在25℃下跟踪反应，持续1小时。

4.第四网络(#4)组合了第一网络和第三网络，以便检测甘氨酸和草甘膦(图7)。

该网络包括：GST-地衣芽孢杆菌Mut#1甘氨酸/草甘膦氧化酶、枯草芽孢杆菌H244K甘氨酸/草甘膦氧化酶、辣根过氧化物酶和安普莱克司红。在存在甘氨酸或草甘膦的情况下，甘氨酸/草甘膦氧化酶网络#4会产生2-氨基膦酸盐、乙醛酸盐和H

该网络已经在囊泡中进行了测试(图12)。囊泡包括50mM Tris(pH 7.5)、0.2mM安普莱克司红和0.25单位的辣根过氧化物酶。将0.46μM(0.0024单位)来自地衣芽孢杆菌的甘氨酸/草甘膦氧化酶GST-BliGO Mut#1、0.46μM(0.0024单位)来自枯草芽孢杆菌的经基因修饰的H244K甘氨酸/草甘膦氧化酶(与野生型版本(创造性酶NATE-1674)相比，其含有1个单氨基酸突变H244K)和浓度范围为0到2mM的草甘膦添加到囊泡外的反应中。通过在分光光度计上记录荧光(530nm处的激发/590nm处的发射)，在25℃下跟踪反应，持续1小时。

实例2：设定囊泡以封装生物化学网络(参见Courbet等人《分子系统生物学》2018)

我们鉴定了一种通用且强大的大分子架构，其能够支持体外生物传感/生物计算过程的模块化实施。这种架构能够(i)稳定地封装和保护与其生物分子组成无关的任意生物化学电路，(ii)通过界定含有合成电路的绝缘内部和由操作介质(例如临床样品)组成的外部来离散空间，(iii)允许通过分子信号(即生物标志物输入)的选择性传质进行信号转导，以及(iv)通过热力学有利的自组装机制支持准确构建。我们在本研究中提出的囊泡结构由磷脂双层膜制成。

我们依赖于对一种方法的开发，所述方法同时支持(i)膜单层性、(ii)封装效率和化学计量、(iii)单分散性和(iv)增加的稳定性/对渗透压力的抵抗力。为此，我们开发了一个定制的微流控平台并设计了基于PDMS的微流控芯片，以实现合成磷脂(DPPC)到封装低拷贝数生物化学物种的经校准的、定制大小的膜双层中的定向自组装。简而言之，该策略依赖于流动聚焦液滴生成通道几何结构，所述几何结构生成水包油包水双乳液模板(W-O-W：PBS中的生物化学电路-油酸中的DPPC-具有低浓度甲醇的水性储存缓冲液)。在双乳液模板形成后，DPPC磷脂膜通过缓冲液中的甲醇在油相的受控溶剂萃取过程中精确定向自组装(图3)。这种微流体设计还集成了一种被称为交错人字形混合器(SHM)(Williams等人，2008年)的装置，以在斯托克斯流态(Stokes flow regime)下实现多个上游通道的高效被动且混沌的混合。我们推断，层流浓度梯度可以防止生物化学部分的关键混合、精确的化学计量和有效的封装。我们假设，在即将组装前均质化的合成生物化学电路可以将封装机制标准化并减少其对绝缘材料性质的依赖。此外，这种设计允许通过控制输入流速对化学计量进行微调，这证明可以测试不同参数以进行原始传感器的直接原型设计。

我们使用超快相机来实现实时监控并目视检查制造过程，从而可以估计在这些流速下囊泡产生的平均频率约为1,500Hz。发现囊泡生成产量对流速有很强的依赖性，我们将所述流速保持在1/0.4/0.4微升/分钟(分别为存储缓冲液/油中的DPPC/PBS中的生物化学电路)以实现最佳组装效率。然后，我们使用光透射、共聚焦和环境扫描电子显微镜分析了囊泡的大小分散。观察到平均尺寸参数为10μm的单分散囊泡和明显的逆高斯分布。有趣的是，生物化学电路绝缘似乎并未影响囊泡的尺寸分布，这支持将绝缘过程与生物化学内容的复杂性脱钩。此外，3个月后没有记录到尺寸的变化，这表明囊泡之间没有融合事件。为了评估囊泡在不泄漏的情况下封装蛋白质种类的能力(这是实现生物化学信息处理合理设计的先决条件)，我们使用共聚焦显微镜测定了封装稳定性。为此，将带有荧光标记的无关蛋白质封装在囊泡内，并在3个月内监测内部荧光的演变。发现内部荧光保持稳定，这表明在我们的储存条件下没有可测量的蛋白质通过囊泡膜泄漏。另外，使用磷脂双分子层特异性染料DiIC18，当专门掺入双分子层时，其荧光量子产率急剧增加(Gullapalli等人,2008,《物理化学与化学物理学(Phys Chem Chem Phys)》；10(24):3548-3560)，可以看到从双乳液中完全提取油酸和双层结构良好的排列。我们接下来试图评估囊泡内生物酶部分的封装。我们发现我们可以检索囊泡内部酶的分子特征信息。综上所述，这些发现表明，这种设定被证明能够高效地生成稳定的、模块化的囊泡，以及用户定义的可微调的内容。

实例3：将含有所关注的生物化学网络的囊泡掺入凝胶基质中。

一旦含有所关注的生物化学网络的囊泡准备就绪，囊泡就会被掺入最终格式，所述最终格式是基于凝胶基质的珠子集合。凝胶珠的尺寸可以根据最终用户的需求进行调整(即直径为5mm)。凝胶由10％聚乙烯醇(PVA)和1％海藻酸钠构成。将囊泡中含有所有生物化学网络的组分的混合物掺入具有10％聚乙烯醇(PVA)、1％海藻酸钠的液体溶液中。然后在搅拌棒的搅拌下将生物化学网络/PVA/藻酸盐混合物滴入0.8M硼酸/0.2M CaCl

实例4：草甘膦/量化结果的检测。

1.通过甘氨酸/草甘膦氧化酶网络检测草甘膦

1.1通过使用邻联茴香胺二盐酸盐，我们通过依赖于草甘膦浓度的甘氨酸/草甘膦氧化酶跟踪草甘膦氧化(图1、4A、4B)。珠子的颜色变化之后是分光光度计上450nm处吸光度的变化。这允许我们能够确定甘氨酸/草甘膦氧化酶对草甘膦的亲和力(Km)为2.5mM并且Vmax为6x10

1.2通过液体、囊泡或凝胶中的甘氨酸/草甘膦氧化酶网络(#1)检测Tris缓冲液和大麦提取物中的草甘膦

1.2.1制备用于后续草甘膦检测的大麦提取物

首先，大麦粒经过研磨和筛选。将粉末用Tris 100mM pH 7.5重新悬浮，并在室温下在转轮上孵育30分钟。将提取物以4000g离心10分钟。将上清液用0.2微米截止注射器过滤器过滤，并在分析前在4℃下保存。

1.2.2通过使用安普莱克司红，我们通过依赖于草甘膦浓度的甘氨酸/草甘膦氧化酶跟踪草甘膦氧化(图8A-8B)。反应之后是荧光计上的荧光变化(530nm处的激发/590nm处的发射)。同时，我们跟踪了依赖于草甘膦浓度的反应颜色变化。这允许我们不仅可以在简单的缓冲培养基中检测草甘膦(图8A)，还可以在复杂的大麦提取物中检测草甘膦(图8B)。

1.2.3通过囊泡中的甘氨酸/草甘膦氧化酶网络(#1)检测草甘膦

在将网络的一部分掺入囊泡(HRP、安普莱克司红、Tris 50mM缓冲液pH 7,5)中和囊泡外部(甘氨酸/草甘膦氧化酶)后，我们跟踪了依赖于草甘膦浓度的草甘膦氧化(图9A-9B))。反应之后是荧光计上的荧光变化(530nm处的激发/590nm处的发射)。同时，我们跟踪了依赖于草甘膦浓度的反应颜色变化。这允许我们不仅可以在简单的缓冲培养基中检测草甘膦(图9A)，还可以在复杂的大麦提取物中检测草甘膦(图9B)

1.2.4通过凝胶珠中的甘氨酸/草甘膦氧化酶网络(#1)检测草甘膦

将完整的甘氨酸/草甘膦氧化酶网络掺入藻酸盐凝胶珠中。我们跟踪了依赖于草甘膦浓度的草甘膦氧化(图10)。反应之后是珠子颜色的变化(红色)。同样，这允许我们不仅可以在简单的缓冲培养基中检测草甘膦(图10(第一行))，还可以在复杂的大麦提取物中检测草甘膦(图10，第二行)。

2.通过EPSP合酶网络检测草甘膦，与磷酸盐检测连接

通过使用邻联茴香胺二盐酸盐或安普莱克司红，我们跟踪了依赖于草甘膦浓度的EPSP合酶的草甘膦抑制作用(图2B、5A、5B、7)。反应之后是荧光计上的荧光变化(530nm处的激发/590nm处的发射)或分光光度计上450nm处的吸光度变化。这允许我们能够确定EPSP合酶对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的活性。EPSP对PEP的亲和力为14μM，并且Vmax为10.26x10

3.通过EPSP合酶网络检测草甘膦，与5-O-(l-羧乙烯基)-3-磷酸莽草酸盐检测连接

通过监测NADH消耗，我们跟踪了依赖于草甘膦浓度的EPSP合酶的草甘膦抑制作用(图2A)。NADH的消耗由445nm处荧光发射的变化(340nm处的激发)或分光光度计上340nm处吸光度的变化给出。

实例5：甘氨酸的检测/量化结果。

1.通过液体(无囊泡/无凝胶)中的甘氨酸/草甘膦氧化酶网络(#3)检测Tris缓冲液中的甘氨酸

通过使用安普莱克司红，我们通过甘氨酸/草甘膦氧化酶(甘氨酸/草甘膦氧化酶、来自枯草芽孢杆菌的经基因修饰的H244K甘氨酸/草甘膦氧化酶，与野生型版本相比(创造性酶NATE-1674)相比，其含有1个单氨基酸突变H244K)跟踪了依赖于甘氨酸浓度的甘氨酸氧化(图11)。反应之后是荧光计上的荧光变化(530nm处的激发/590nm处的发射)。这允许我们能够检测甘氨酸。

实例6：草甘膦和甘氨酸的检测/量化结果。

1.通过囊泡中的甘氨酸/草甘膦氧化酶网络(#4)检测Tris缓冲液中的草甘膦和甘氨酸

在此实例中，我们利用了与甘氨酸相比GST-BliGO Mut#1对草甘膦的特异性，以及与草甘膦相比来自枯草芽孢杆菌的甘氨酸/草甘膦氧化酶H244K对甘氨酸的特异性。事实上，GST-BliGO Mut#1衍生自Zhang等人(2016年)开发的BliGO SCF4突变体与WT相比，该突变体对草甘膦的亲和力增加了8倍(1.58mM)，并且其对甘氨酸的活性降低了113倍。开发该突变体是为了增加植物对草甘膦的抗性，我们将其用作草甘膦生物传感的基础。

在将网络的一部分掺入囊泡(HRP、安普莱克司红、Tris 50mM缓冲液pH7,5)中和囊泡外部(甘氨酸/草甘膦氧化酶、来自枯草芽孢杆菌的经基因修饰的H244K甘氨酸/草甘膦氧化酶，与野生型版本相比(创造性酶NATE-1674)相比，其含有1个单氨基酸突变H244K；以及来自地衣芽孢杆菌的衍生自BliGO–SCF-4的GST-BliGO Mut#1，与野生型版本相比，其经基因修饰并含有6个单氨基酸突变)后，我们跟踪了依赖于草甘膦和甘氨酸浓度的草甘膦和/或甘氨酸氧化(图12)。反应之后是荧光计上的荧光变化(530nm处的激发/590nm处的发射)。这允许我们能够检测单独的草甘膦、单独的甘氨酸以及草甘膦和甘氨酸的组合。(图12)。

结论与讨论

该研究表明，根据本发明的方法和组合物是进行农药或内分泌干扰物的检测和量化的非常有前景的工具，可能是多路复用的。我们表明该技术可以成功应用于解决实际环境问题，并证明本发明的方法和组合物可以克服该领域经典诊断工具面临的几个障碍。