一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶及制备方法

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，尤其涉及一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶及制备方法。

背景技术

7α-、7β-羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)可以偶联催化游离态或结合态甾体类底物C7位羟基的差向异构，是生物转化制备牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)的关键生物催化剂。

目前，现有技术公开的7α-羟基类固醇脱氢酶均为嗜温酶，特征是对温度敏感，热稳定性差。因此，发现嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶及制备方法，旨在解决现有的7α-羟基类固醇脱氢酶的热稳定性差的问题。

为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶，所述嗜热型7α-羟基类固醇脱氢的酶蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本发明提供了一种表达盒，包含第一方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，包含第一方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶。

第四方面，本发明提供了一种重组细胞，包含第三方面所述的表达盒。

第五方面，本发明提供了一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的制备方法，能够成功诱导蛋白表达条件下培养第四方面所述的重组细胞并分离得到7α-羟基类固醇脱氢酶。

第六方面，本发明提供了一种催化剂，包含第一方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶。

第七方面，本发明提供了一种实现化学物质生物转化的方法，包含第一方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶，或包含第七方面所述的催化剂与底物反应的酶促反应。

本发明的一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶及制备方法，通过嗜热型7α-羟基类固醇脱氢的酶蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的首个嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的最适催化温度为75℃，显著高于目前已报道的嗜温型酶，解决了现有的7α-羟基类固醇脱氢酶的热稳定性差的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明提供的一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的SDS-PAGE分析图。

图2是本发明提供的一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的最适温度测定结果图。

图3是本发明提供的一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的制备方法的流程图。

图4是本发明提供的一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的应用的流程图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

请参阅图1至图2，第一方面，本发明提供了一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶，所述嗜热型7α-羟基类固醇脱氢的酶蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本发明提供了一种表达盒，包含第一方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，包含第一方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶。

第四方面，本发明提供了一种重组细胞，包含第三方面所述的表达盒。

第五方面，本发明提供了一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的制备方法，能够成功诱导蛋白表达条件下培养第四方面所述的重组细胞并分离得到7α-羟基类固醇脱氢酶。

第六方面，本发明提供了一种催化剂，包含第一方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶。

第七方面，本发明提供了一种实现化学物质生物转化的方法，包含第一方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶，或包含第七方面所述的催化剂与底物反应的酶促反应。

请参阅图3至图4，本发明提供一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的制备方法，包括以下步骤：

S1对7α-羟基类固醇脱氢酶的编码基因进行全合成，得到表达盒；

具体的，将7α-羟基类固醇脱氢酶的酶蛋白序列交由上海生工生物科技有限公司进行全基因合成，得到表达盒。

S2使用所述表达盒制作重组质粒；

具体的，将所述表达盒克隆入pEGX-6p-1载体，以酶切位点为BamH I/Xho I进行重组，得到重组质粒。

S3使用所述重组质粒转化大肠杆菌BL21，得到重组菌种；

具体方式为：

S31在-80℃中取出大肠杆菌BL21感受态细胞后放置在冰上；

S32在所述大肠杆菌BL21感受态细胞中加入所述重组质粒，30min后将所述大肠杆菌BL21感受态细胞和所述重组质粒从冰上取下进行热休克42℃90s，得到休克细胞；

S33将所述热休克处理的细胞冰上放置2min进行冷处理，得到重组菌种。

具体的，在步骤将所述休克细胞冰上放置2min，得到重组菌种之后还要进行复苏，方法为：将所述重组菌种加入600μL LB培养基，并以37℃，150rpm进行振荡培养45min，得到培养菌种；

吸取200μL所述培养菌种涂布于含有氨苄青霉素的LB平板培养基中，以37℃培养过夜；

从过夜后的所述LB平板培养基中挑取单菌落进行扩大培养并保种。

S4对所述重组菌种进行培养和诱导表达，得到含有目的酶蛋白的重组细胞；

具体方式为：

S41将所述重组菌种接种至LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养，当所述重组菌种的OD600≈0.8时，得到培养菌种；

S42向所述培养菌种中加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导12h，得到诱导表达后的菌种；

S43将上述诱导菌种8000rpm离心5min，得到重悬菌体；

S44对所述重悬菌体进行超声破菌，得到半透明破菌液；

S45将所述澄清破菌液12000rpm离心20min，取离心上清；

S46将所述离心上清与Glutathione Sepharose在4℃结合2h，得到结合有目的酶蛋白的Glutathione Sepharose；

S47将所述结合有目的酶蛋白的Glutathione Sepharose用4℃预冷3-5个柱体积的PBS缓冲液冲洗杂蛋白；

S48向所述PBS缓冲液中加入PreScission Protease酶进行酶切，得到目的酶蛋白。

S5将所述目的酶蛋白进行分离纯化，得到7α-羟基类固醇脱氢酶。

具体的，嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的最适温度检测。

配置pH7.4的PBS缓冲液(50mM)测试酶活性。具体操作如下：将反应体系温度分别控制在25-95℃区间内，在2mL比色皿中依次加入反应缓冲液、NAD

结果显示，本发明所述的首个嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的最适催化温度为75℃，显著高于目前已报道的嗜温型酶。

本发明提供了一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的应用，用于实现化学物质生物转化：

S101使用所述7α-羟基类固醇脱氢酶制备催化剂；

S102使用所述催化剂对底物进行生物转化。

具体的，使用所述催化剂对底物进行酶促反应。

本发明提供了一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的表达基因，应用于第二方面所述的嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶的应用，包括酶蛋白序列和基因序列，所述酶蛋白序列为SEQ ID NO.1；所述基因序列为SEQ ID NO.2。

具体的，通过上述的表达基于所呈现的所述7α-羟基类固醇脱氢酶为嗜热酶。

以上所呈现的仅为本发明一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶及制备方法较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 重庆第二师范学院

<120> 一种嗜热型7α-羟基类固醇脱氢酶及制备方法

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<211> 267

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

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<211> 789

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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

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